一種檢測腫瘤標志物的熒光方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物傳感及分析領(lǐng)域，特別設(shè)及一種利用導(dǎo)電高分子和核酸適配體實 現(xiàn)對腫瘤標志物的巧光檢測方法領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 核酸適體(aptamer)是一類通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術(shù)(S化EX)篩選出來的 寡聚核巧酸片段，具有易合成、成本低、易儲存及穩(wěn)定性好等優(yōu)點，任何一種祀物質(zhì)都可W 篩選出與之高度特異性結(jié)合的核酸適體，它對其祀分子具有高度的親和力，并且可W通過 化學(xué)生產(chǎn)獲得，被譽為"化學(xué)抗體"。
[0003] 腫瘤標志物(Tumor Marker)即反映腫瘤存在的化學(xué)類物質(zhì)。腫瘤標志物在腫瘤普 查、腫瘤診斷、評價治療療效和高危人群隨訪觀察等方面都具有較大的實用價值。癌胚抗原 CEA是一種重要的腫瘤相關(guān)抗原，在結(jié)腸癌、胃癌、膜腺癌、肺癌等患者的胃液、唾液、胸腹水 中CEA檢測呈陽性率較高。甲胎蛋白AFP是早期診斷原發(fā)性肝癌最敏感、最特異的指標，AFP 在大約80%的肝癌患者血清中升高，在生殖細胞腫瘤出現(xiàn)AFP陽性率為50%，在其它腸胃管 腫瘤如膜腺癌或肺癌及肝硬化等患者亦可出現(xiàn)不同程度的升高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 發(fā)明目的：提供一種簡便、無標記、快捷的檢測腫瘤標志物的方法。優(yōu)點要放在有 益效果中，不要放在發(fā)明目的中。
[000引技術(shù)方案:本發(fā)明提出的檢測腫瘤標志物的方法，W核酸適配體作為分子識別元 件，使核酸適配體通過靜電相互作用與導(dǎo)電高分子形成復(fù)合物，使導(dǎo)電高分子巧光巧滅;月中 瘤標志物與核酸適配體結(jié)合后，使核酸適配體離開導(dǎo)電高分子，導(dǎo)電高分子巧光恢復(fù)，從而 實現(xiàn)對腫瘤標志物的檢測。本發(fā)明提供的方法處理更快捷，簡化了探針的構(gòu)建方法，能夠方 便檢測到低水平的腫瘤標志物，在早期癌癥的臨床診斷方面具有重要意義。
[0006] 本發(fā)明基于核酸適配體和導(dǎo)電高分子檢測腫瘤標志物的巧光方法，包括W下步 驟：
[0007] 1)、將核酸適配體與導(dǎo)電高分子結(jié)合，形成復(fù)合物，進行巧光檢測；
[0008] 2)、將核酸適配體與腫瘤標志物結(jié)合，形成復(fù)合物；
[0009] 3)、將核酸適配體與腫瘤標志物形成的復(fù)合物加至導(dǎo)電高分子溶液中，再次進行 巧光檢測。
[0010] 其中，步驟1)中核酸適配體與導(dǎo)電高分子的結(jié)合是由于他們之間的靜電作用，形 成復(fù)合物，使得導(dǎo)電高分子的巧光巧滅。
[0011] 步驟2)和3)中，當溶液中存在腫瘤標志物的時候，腫瘤標志物將誘導(dǎo)核酸適配體 序列從游離態(tài)變成立體的=維空間結(jié)構(gòu)，并形成復(fù)合物，增加了其與聚合物之間的距離，從 而使得聚合物的巧光恢復(fù)。
[0012] 其中所述的腫瘤標志物為癌胚抗原CEA和甲胎蛋白AFP;核酸適配體為癌胚抗原 CEA的核酸適配體apt-18，其堿基組成為：-TTAACTTATTCGACCATA-3/，和甲胎蛋白AFP的核 酸適配體apt-72，其堿基組成為：5' -GGCAGGAAGACAAACAAGCTTGGCGGCGGGAAGGTGTTTAAATTCC CGGGTCTGCGTGGTCTGTGGTGCTGT-3'。
[0013] 巧光檢測所用的儀器為巧光分光度計(RF-5301，日本）。巧光光譜測量條件:氣燈 激發(fā)，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為1.5nm和3. Onm,激發(fā)波長為39化m，發(fā)射波長掃描范圍400-650nm;用300化石英比色皿在室溫下進行測量，樣品體積20化L。實驗過程中的緩沖液為 IOmM PBS,PH=7.4〇
[0014] 本發(fā)明的有益效果:根據(jù)本發(fā)明所述的巧光檢測方法基于核酸適配體與導(dǎo)電高分 子之間靜電作用，使得導(dǎo)電高分子巧光巧滅的特點，W及核酸適配體與腫瘤標志物可形成 立體空間結(jié)構(gòu)遠離導(dǎo)電高分子的特點，利用核酸適配體空間構(gòu)型的改變對導(dǎo)電高分子巧光 的影響，來實現(xiàn)對腫瘤標志物的檢測。該方法操作方便，響應(yīng)快，成本低，且具有較高的選擇 性，是一種分析效率較高的檢測方法。
[0015] 本發(fā)明的研究，W導(dǎo)電高分子作為巧光傳感材料，且無需構(gòu)建生物探針，W核酸適 配體作為分子識別元件，W巧光檢測為主要分析手段，實現(xiàn)了對腫瘤標志物的檢測。本發(fā)明 提供的方法處理更快捷，能夠方便檢測到低水平的腫瘤標志物，在早期癌癥的臨床診斷方 面具有重要意義。
[0016] 運種檢測方法不僅利用了共輛聚合物的分子導(dǎo)線及巧光特征，同時利用了核酸適 配體對腫瘤標志物的高親和力和強特異性，可W克服傳統(tǒng)檢測方法中操作復(fù)雜、成本高、選 擇性差的缺點，具有高靈敏度、快速響應(yīng)和強抗干擾能力。
【附圖說明】
[0017] 圖1為檢測腫瘤標志物的流程示意圖。
[0018] 圖2為本發(fā)明所述方法，CEA的核酸適配體濃度選擇圖，即不同濃度apt-18對導(dǎo)電 高分子的巧光巧滅圖。
[0019] 圖3A為本發(fā)明所述方法檢測CEA時，隨著CEA濃度的增加，導(dǎo)電高分子巧光恢復(fù)的 譜圖。
[0020] 圖3B為本發(fā)明所述方法檢測CEA時，隨著CEA濃度的增加，導(dǎo)電高分子巧光恢復(fù)的 趨勢圖，其中Fo表示apt-18使導(dǎo)電高分子巧光巧滅效果最好的時候的巧光強度值，F(xiàn)表示溶 液中有CEA時的巧光強度值。
[0021] 圖4為本發(fā)明所述方法檢測CEA時，特異性和抗干擾性分析圖，其中Fo表示apt-18 使導(dǎo)電高分子巧光巧滅效果最好的時候的巧光強度值，F(xiàn)表示溶液中有CEA時的巧光強度 值。
[0022] 圖5為本發(fā)明所述方法，AFP的核酸適配體濃度選擇圖，即不同濃度apt-72對導(dǎo)電 高分子的巧光巧滅圖。
[002引圖6A為本發(fā)明所述方法檢測AF即寸，隨著AFP濃度的增加，導(dǎo)電高分子巧光恢復(fù)的 譜圖。
[0024]圖6B為本發(fā)明所述方法檢測AFP時，隨著AFP濃度的增加，導(dǎo)電高分子巧光恢復(fù)的 趨勢圖，其中Fo表示apt-72使導(dǎo)電高分子巧光巧滅效果最好的時候的巧光強度值，F(xiàn)表示溶 液中有AFP時的巧光強度值。
[0025] 圖7為本發(fā)明所述方法檢測AFP時，特異性和抗干擾性分析圖，其中Fo表示apt-72 使導(dǎo)電高分子巧光巧滅效果最好的時候的巧光強度值，F(xiàn)表示溶液中有AFP時的巧光強度 值。
[0026] 具體實施方法
[0027] 為了更好地理解本發(fā)明的內(nèi)容，下面結(jié)合附圖1，具體介紹檢測腫瘤標志物的巧光 方法。運用該技術(shù)包括如下=個步驟：
[002引（1)、將導(dǎo)電高分子溶于IOmM, PH = 7.4的PBS緩沖溶液中，濃度為IOiiM;取IOiiM的導(dǎo) 電高分子溶液18化L，向其中加入4化核酸適配體，再補充緩沖液至體系中最終體積為20化 L，混合均勻，立即測試其巧光光譜，此時體系中最終聚合物濃度為9iiM。核酸適配體通過靜 電相互作用與導(dǎo)電高分子形成復(fù)合物，使導(dǎo)電高分子巧光巧滅；
[0029] (2 )、取核酸適配體與不同濃度的腫瘤標志物各化L，加至12化的1 OmM，PH = 7.4的 PBS緩沖溶液中，混合均勻;將核酸適配體與腫瘤標志物的混合物置于37°C下解育2分鐘，使 得核酸適配體與腫瘤標志物充分反應(yīng)形成空間立體結(jié)構(gòu)；
[0030] (3)、將核酸適配體與不同濃度腫瘤標志物形成的復(fù)合物分別加至IOiiM的18化L的 導(dǎo)電高分子溶液中，混合均勻后立即測試巧光光譜。腫瘤標志物與核酸適配體結(jié)合后，形成 空間立體結(jié)構(gòu)使核酸適配體離開導(dǎo)電高分子，導(dǎo)電高分子巧光恢復(fù)，從而實現(xiàn)對腫瘤標志 物的檢測。
[0031] 其中，巧光檢測所用的儀器為巧光分光度計(RF-5301，日本）。巧光光譜測量條件： 氣燈激發(fā)，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為1.5nm和3.Onm,激發(fā)波長為39化m，發(fā)射波長掃描范圍 400-650nm;用30化L石英比色皿在室溫下進行測量，樣品體積20化L。實驗過程中的緩沖液 為IOmM PBS，PH=7.4。
[0032] 本發(fā)明實施例中所用的核酸適配體apt-18和apt-72均購自上海生物工程技術(shù)有 限公司，堿基序列分別為5^1744(：1741'1'〔64(^4了4-3^ 和5^66〔4664464〔444〔446(：1766〔660 GGGAAGGTGTTTAAATTCCCGGGTCTGCGTGGTCTGTGGTGCTGT-3' ; CEA購自上海領(lǐng)潮生物科技有限 公司；AFP購自United States Biological。
[0033] 實施例1:檢測癌胚抗原CEA
[0034] (1)將導(dǎo)電高分子溶于IOmM,PH = T.4的PBS緩沖溶液中，配成濃度為IOiiM的溶液； 取IOiiM的導(dǎo)電高分子溶液18化L，向其中加入不同濃度CEA的適配體(apt-18)化L，再補充緩 沖液至體系中最終體積為20化L，混合均勻，立即測試其巧光光譜，此時體系中導(dǎo)電高分子 的最終濃度為9山1。核酸適配體通過靜電相互作用與導(dǎo)電高分子形成復(fù)合物，使導(dǎo)電高分子 巧光巧滅。實驗結(jié)果如圖2所示，當apt-18的濃度為4(K)nM的時候，導(dǎo)電高分子的巧光巧滅效 率最好，因此，后期實驗中，選擇apt-18的濃度為400nM。
[0035] (2)取400nM的適配體apt-18與不同濃度的癌胚抗原C