棉花黃萎病菌致病相關(guān)基因cyc8的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物病理學(xué)和微生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及棉花黃萎病菌致病相關(guān) 基因 CYC8的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 棉花是關(guān)系到我國(guó)國(guó)計(jì)民生的重要經(jīng)濟(jì)作物之一，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展中起到舉足輕 重的地位，被譽(yù)為棉花的"癌癥"病害一一黃萎病，是全生育期的系統(tǒng)性、土傳維管束病害， 可在整個(gè)生育期侵染危害，導(dǎo)致棉花大幅減產(chǎn)，經(jīng)濟(jì)損失慘重。我國(guó)主要病原菌是大麗輪枝 菌（Verticillium dahliae Kleb)，屬半知菌亞門，叢梗孢目，淡色孢科，輪枝菌屬。其中，病 原菌的致病機(jī)理不清，抗病育種滯后，品種抗性喪失快，缺乏環(huán)境友好且防治效果好的殺菌 劑，是該病防治難度大，爆發(fā)成災(zāi)的主要原因。為了較好的控制一種植物病害，明確病原菌 的侵染過程和致病機(jī)理是必要的基礎(chǔ)性工作。
[0003] 目前，棉花黃萎病侵染棉花的過程是比較清楚的，土壤中微菌核或分生孢子受棉 花根系分泌物的刺激，開始萌發(fā)，產(chǎn)生的菌絲在寄主根表面定殖、穿過表皮、在皮層中發(fā)生 及在棉花體內(nèi)擴(kuò)展，最終導(dǎo)致癥狀的形成。與其它病害相比，土傳病害的病原真菌尤其是棉 花黃萎病菌分子致病機(jī)理的研宄明顯滯后，因此分離鑒定致病相關(guān)基因并進(jìn)行功能驗(yàn)證顯 得迫在眉睫。由于大麗輪枝菌的休眠體微菌核和分生孢子是主要的接種體，因此分離得到 同時(shí)調(diào)控微菌核和分生孢子產(chǎn)生的致病相關(guān)基因，并進(jìn)行全面的功能分析，為揭示其分子 致病機(jī)理提供理論依據(jù)，也為棉花定向抗病育種提供可靠的靶位點(diǎn)，對(duì)有效防治棉花黃萎 菌病菌具有重要意義。
[0004] 細(xì)胞壁作為植物的第一道物理屏障，在防御病原菌方面起重要作用。大麗輪枝菌 在侵染寄主植物時(shí)產(chǎn)生各種細(xì)胞壁降解酶，如果膠酶、纖維素酶等，這些細(xì)胞壁降解酶能降 解寄主植物的細(xì)胞壁，打破寄主的物理屏障，有利于病原菌的定殖、傳播和癥狀的擴(kuò)展。研 宄表明，大麗輪枝菌菌株產(chǎn)生纖維素酶能力與侵染力呈顯著正相關(guān)，細(xì)胞壁降解酶在大麗 輪枝菌致病中作為毒力因子而起作用。應(yīng)用生物信息學(xué)方法分析大麗輪枝菌VdLs. 17基因 組序列發(fā)現(xiàn)，含有大量的編碼碳水化合物活性酶類（Carbohydrate-activeen-zymes)如果 膠酶、纖維素酶等，這可能是大麗輪枝菌能夠在廣泛的寄主植物上定殖的重要原因之一。目 前，已經(jīng)有少數(shù)大麗輪枝菌的致病基因的功能已經(jīng)得到了分析驗(yàn)證。
[0005] 在真核生物中，復(fù)雜的生長(zhǎng)發(fā)育過程對(duì)環(huán)境變化的響應(yīng)，常常依賴于基因表達(dá)的 精細(xì)調(diào)控。一般來(lái)說，大部分基因的表達(dá)變化都是受轉(zhuǎn)錄水平或抑制或促進(jìn)的調(diào)控。也 就是轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合在特異識(shí)別的DNA位點(diǎn)，使該基因不能表達(dá)為負(fù)調(diào)控；從靶基因上去 除阻遏蛋白，RNA聚合酶識(shí)別受調(diào)控基因的啟動(dòng)子，使基因得以表達(dá)為正調(diào)控（Berk et al. , 1999) 〇
[0006] CYC8(也叫做Ssn6)是由Trumbly (1988)首次克隆得到的，該基因全長(zhǎng)為3. 5kb， 編碼966個(gè)氨基酸，蛋白分子量是107215D，在N端和C端分別有16個(gè)和31個(gè)谷氨酸串聯(lián)結(jié) 構(gòu)域，是一類葡萄糖阻遏蛋白。CYC8和Tupl蛋白共同組成CYC8-Tupl抑制子，是真菌中最 為重要的一類阻遏蛋白復(fù)合物，在轉(zhuǎn)錄水平行使著功能。作為重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，雖然 存在保守結(jié)構(gòu)域，但是在不同真菌中起到的作用各有不同。在Saccharomyces cerevisiae 中，3%的功能基因表達(dá)都受到CYC8-Tupl的不同程度的調(diào)控。缺失CYC8的突變體會(huì)表現(xiàn)為 低生長(zhǎng)速率、低產(chǎn)孢量、無(wú)法從培養(yǎng)基中利用胸（腺嘧啶脫氧核）苷、葡萄糖抑制作用的喪 失和對(duì)脅迫環(huán)境的應(yīng)答缺陷（Smith et al·，2000)。在 Aspergillus niger 中，Tupl_Cyc8 控制細(xì)胞壁合成、發(fā)育并且影響氮源利用能力（Schachtschabe et al.，2013)。但是，CYC8 對(duì)植物病原真菌致病力的影響卻未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供了一個(gè)來(lái)源于棉花黃萎病菌的、在致病性、分生 孢子產(chǎn)生、黑色素積累、微菌核產(chǎn)生和纖維素酶活性中起重要作用的基因 CYC8,通過鑒定該 基因可為防治棉花黃萎病害提供藥物靶標(biāo)。
[0008] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的棉花黃萎病菌的致病相關(guān)基因 CYC8(Glucose repression mediator protein CYC8)來(lái)自大_輪枝菌（Verticillium dahliae Kleb)，該基因的核苷酸序列為SEQ ID N0:1。
[0009] 本發(fā)明同時(shí)提供了上述基因 CYC8的編碼區(qū)序列，具有SEQ ID NO: 2所示的核苷酸 序列。
[0010] 本發(fā)明同時(shí)提供了上述基因 CYC8編碼的蛋白質(zhì)序列，該蛋白質(zhì)序列具有SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列。
[0011] 本發(fā)明的通過篩選農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA插入技術(shù)建立的大麗輪枝菌突變體庫(kù)，獲 得了致病力減弱的突變菌株T286。Southern雜交證實(shí)該突變菌株為T-DNA單插入突變體。 借助TAIL-PCR技術(shù)和VdLs. 17的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得了 T-DNA插入的側(cè)翼序列，并從野生 型菌株Vd080中成功克隆得到了致病相關(guān)基因 CYC8。
[0012] 本發(fā)明利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將CYC8敲除載體轉(zhuǎn)入野生型菌株Vd080,得到了 三個(gè)表型穩(wěn)定的基因缺失突變體Δ CYC8-45、Δ CYC8-55和Δ CYC8-56 ;將CYC8互補(bǔ)載體導(dǎo) 入轉(zhuǎn)化子T286,獲得三個(gè)回補(bǔ)突變體ACYC8-C26、ACYC8-C30和ACYC8-C36。
[0013] 本發(fā)明測(cè)定了三個(gè)敲除突變體和三個(gè)回補(bǔ)突變體的生物學(xué)性狀、胞外酶活性以及 對(duì)棉花的致病性，并與野生型VdOSO和轉(zhuǎn)化子T286進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明：敲除突變體 ACYC8較野生型VdOSO相比，分生孢子的產(chǎn)量驟減，降低了一個(gè)數(shù)量級(jí)；且不產(chǎn)生微菌核； 纖維素酶活性極顯著降低，對(duì)纖維素的利用能力較野生型降低了 16. 0-24. 7% ;致病力測(cè)定 結(jié)果表明，敲除突變體ACYC8對(duì)棉花的致病力平均降低了 60. 3%。而回補(bǔ)突變體ACYC8-C 的上述性狀得到不同程度的恢復(fù)，接近野生型。因此判斷CYC8基因是棉花黃萎病菌中重要 的致病相關(guān)基因，關(guān)聯(lián)分生孢子和微菌核的產(chǎn)生、黑色素的積累，并對(duì)纖維素酶的活性有一 定貢獻(xiàn)。
【附圖說明】
[0014] 圖1顯示源于突變體T286中CYC8的基因信息（A T-DNA插入拷貝數(shù)分析；B TAIL-PCR電泳圖；C CYC8基因結(jié)構(gòu)圖。
[0015] 圖2為CYC8敲除載體構(gòu)建示意圖，A CYC8融合片段獲得示意圖；B Gateway技術(shù) 獲得敲除載體PGK02-CYC8示意圖。
[0016] 圖3顯示陽(yáng)性敲除突變體ACYC8的獲得以及與野生型Vd080和T286培養(yǎng)性 狀比較圖示，A三步法構(gòu)建敲除轉(zhuǎn)化子的電泳圖譜；B陽(yáng)性敲除突變體的分子檢測(cè)圖譜；C RT-PCR檢測(cè)CYC8的表達(dá)量；D培養(yǎng)性狀比較圖示。
[0017] 圖4顯示野生型Vd080、T286和回補(bǔ)突變體ACYC8-C培養(yǎng)性狀和熒光觀察比較圖 示，第一列PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)性狀觀察；第二列顯微鏡普通視圖；第三列熒光照片。
[0018] 圖5為敲除突變體Λ CYC8在不同碳源（脫脂奶粉、淀粉、纖維素）培養(yǎng)基上生長(zhǎng) 示意圖；
[0019] 圖6為回補(bǔ)突變體Λ CYC8-C在不同碳源（脫脂奶粉、淀粉、纖維素）培養(yǎng)基上生 長(zhǎng)示意圖。
[0020] 圖7顯示敲除突變體Λ CYC8和回補(bǔ)突變體Λ CYC8-C致病力測(cè)定，AB :病情指數(shù)； ⑶：野生型Vd080、Τ286與敲除突變株侵染棉花的表型）、。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 實(shí)施例1 :突變體T286的獲得
[0022] 以分離自河北辛集重病田的棉花黃萎病菌Vd080為出發(fā)菌株，將攜帶有pCTHyg雙 元載體的農(nóng)桿菌，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化（ATMT)的方法，構(gòu)建容量為2000個(gè)的攜帶有潮霉素 (HPH)抗性篩選標(biāo)記的T-DNA插入突變體庫(kù)。以陸地棉感病品種冀棉11為鑒別寄主，采用 輕石沙土無(wú)底紙缽定量接菌液法，測(cè)定了 800個(gè)棉花黃萎病菌突變體的致病力。歷經(jīng)初篩 和復(fù)篩兩輪篩選，得到31株致病力極顯著降低的突變體，并評(píng)價(jià)了其生物學(xué)性狀的各項(xiàng)指 標(biāo)。結(jié)果顯示，低致病力T286較野生型致病力有了大幅下降（降低了 77. 1% )，不產(chǎn)微菌 核和黑色素，分生孢子產(chǎn)量驟減。
[0023] 實(shí)施例2 :CYC8基因的分離和克隆
[0024] 2. ISouthern雜交確定突變體T286T-DNA插入拷貝數(shù)
[0025] 根據(jù)T-DNA上大小約為500bp的潮霉素片段序列設(shè)計(jì)Southern雜交探針引物 HygP-F/R。低致病力突變體 T286 的基因組DNA 5ng，NEB buffer 10yL，BamH I 3yL，補(bǔ) 水至100 yL。37°C消化5h，之后，65°C水浴lOmin，終止酶切反應(yīng)。探針制備、DNA變性、轉(zhuǎn) 移、雜交及顯色方法按照試劑盒說明書進(jìn)行。
[0026] 以T-DNA上的潮霉素區(qū)段做探針的Southern blot結(jié)果表明，探針在低致病力突 變體T286基因組上只有一個(gè)雜交信號(hào)。說明T-DNA在突變體T286中為單拷貝插入（圖 1A) 〇
[0027] 2. 2TAIL-PCR技術(shù)獲得失活基因信息
[0028] 根據(jù)雙元載體pCTHyg中T-DNA左臂（LB)和右臂（RB)內(nèi)側(cè)DNA序列，利用NCBI 中的Primer Blast在線工具分別設(shè)計(jì):V和Y步移引物R-SPl、R-SP2、R-SP3和L-SPl、 L-SP2 和 L-SP3 (表 1)，結(jié)合 Genome Walking 試劑盒（Takara 提供的簡(jiǎn)并引物 API、AP2、AP3 和AP4,步移引物與隨機(jī)引物成對(duì)作為模板擴(kuò)增T-DNA左右臂側(cè)翼序列。所用反應(yīng)程序及反 應(yīng)體系均按照試劑盒說明書操作。反應(yīng)結(jié)束后，取上述第一輪、第二輪、第三輪的反應(yīng)產(chǎn)物 于1 %的瓊脂糖凝膠電泳上檢測(cè)（圖1B)。分別回收:V端和Y端第三輪TAIL-PCR特異 產(chǎn)物，克隆測(cè)序。測(cè)序結(jié)果先與T-DNA進(jìn)行兩兩比對(duì)，并在Verticillium dahliae Vdl7基 因組數(shù)據(jù)庫(kù)中做BLAST分析，得知T286中被失活的基因是glucose repression mediator protein CYC8,在基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的編號(hào)為VDAG_07052。該基因位于大麗輪枝菌的第五條 染色體上，由3201個(gè)堿基組成，包括7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子（圖1C)。
[0029] 表1 TAIL-PCR步移特異引物
[0030]
【主權(quán)項(xiàng)】
1.棉花黃萎病菌致病相關(guān)基因CYC8用于篩選棉花抗黃萎病真菌藥劑的應(yīng)用，其中，基 因CYC8的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:2所示。
【專利摘要】本發(fā)明涉及植物病理學(xué)和微生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及棉花黃萎病菌致病相關(guān)基因CYC8的應(yīng)用。本發(fā)明通過基因敲除和基因互補(bǔ)試驗(yàn)，明確了基因CYC8在棉花黃萎病菌致病性、分生孢子產(chǎn)生、微菌核產(chǎn)生、黑色素積累和纖維素酶活性方面行使著重要功能。本發(fā)明所提供的基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)和修飾可作為靶位點(diǎn)用于設(shè)計(jì)和篩選抗真菌藥劑。
【IPC分類】C07K14-37, C12N15-31, C12Q1-68
【公開號(hào)】CN104805095
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410794692
【發(fā)明人】李志芳, 朱荷琴, 馮自力, 師勇強(qiáng), 趙麗紅, 馮鴻杰
【申請(qǐng)人】中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所
【公開日】2015年7月29日
【申請(qǐng)日】2014年12月18日