利用黃萎病菌VdP4-ATPase基因提高植物對(duì)黃萎病抗性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域。具體地說(shuō)，設(shè)及利用基因工程技術(shù)提高植物抗病 性的方法。 技術(shù)背景
[0002] 黃萎病嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，全球每年因黃萎病引起的損失達(dá)數(shù)十億美元 (Pegg et al. ,2002)。報(bào)道稱馬鈴馨因感染黃萎病年產(chǎn)量減少50% W上，通常情況下可W 引起 10-15%的減產(chǎn)(Powelson et al.，1993;Rowe et al.，1987,2002);生菜種植區(qū)，黃萎 病引起的損失非常容易達(dá)到100% (Subbarao et al. , 1997) ;Levinet(2003)等研究發(fā)現(xiàn)， 油橄攬因黃萎病引起的減產(chǎn)可W達(dá)到70% W上；黃萎病也是多數(shù)植棉國(guó)家的棉花主要病 害，比如，澳大利亞、己西、保加利亞、中國(guó)、希臘、秘魯、±耳其、烏干達(dá)、美國(guó)和烏茲別克斯 坦等國(guó)家，可W造成30%W上棉花的減產(chǎn)(Bolek et曰1.，2005)，發(fā)病嚴(yán)重的地區(qū)或年份減 產(chǎn)可W達(dá)到100%。黃萎病是制約我國(guó)棉花生產(chǎn)的一種主要病害，目前我國(guó)各棉區(qū)的發(fā)病面 積已占植棉總面積的50% W上，每年損失皮棉7.5-10萬(wàn)噸，直接經(jīng)濟(jì)損失16-20億元（肖松 華等，2006)。在我國(guó)棉花黃萎病重病地塊逐年增多，危害逐年加重，已成為當(dāng)前實(shí)現(xiàn)棉花高 產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的主要限制因素。黃萎病不僅引起作物大量減產(chǎn)和產(chǎn)品品質(zhì)降低，其致病菌產(chǎn)生的 毒素也能危害人類的健康。
[000引黃萎病主要是由大麗枝菌Ver t i C i 11 i um dah 1 iae K1 eb和黑白輪枝菌 Verticillium a化oatrum侵染引起的一種±傳維管束病害。病原菌一旦侵入植物體內(nèi)，便 沒(méi)有有效的防治方法。黃萎病菌寄主范圍廣，可W侵染包括所有雙子葉植物在內(nèi)的200多種 植物，病原菌能W微菌核的形式在±壤中存活20年左右化losterman et日1.,2009)，除 2001年Kawchuk等從番茄中克隆得到1個(gè)針對(duì)茄屬黃萎病菌的抗病基因 VeW外，幾乎沒(méi)有克 隆到來(lái)自其他植物的抗病基因，對(duì)Ve抗病基因的機(jī)制研究表明該基因只對(duì)黃萎病菌的部分 小種具有抗性(Fradin et al. ,2009)。早期的研究認(rèn)為，植物感染黃萎病后，其導(dǎo)管被抱 子、菌絲W及病原菌通過(guò)植物細(xì)胞形成的膠狀物等堵塞而致萎黨壞死(Agrios，2005)，但 是，隨后的研究表明，導(dǎo)管堵塞不是黃萎病萎黨的主要原因，隨著研究的不斷深入，人們認(rèn) 識(shí)到黃萎病菌產(chǎn)生的毒素是導(dǎo)致植物萎黨的重要因素(化adin et al. ,2006)。還有一些學(xué) 者認(rèn)為，維管束的堵塞也是基于毒素的誘導(dǎo)效應(yīng)(陳旭升等，1998)。
[0004]實(shí)踐證明，利用抗病品種是防治黃萎病危害的唯一經(jīng)濟(jì)有效的途徑。傳統(tǒng)育種方 法雖然能利用作物本身或親緣種的抗性基因選育抗病品種，但存在著可利用的抗性品種資 源少，選育時(shí)間長(zhǎng)，耗資大等缺點(diǎn)；施用化學(xué)藥劑不僅難W有效防治黃萎病而且污染環(huán)境。 隨著植物基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展W及對(duì)植物和病原物相互作用的深入了解使得將外源 抗性基因?qū)胫参飦?lái)提高抗病性成為一條有效途徑。通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)可W打破傳統(tǒng)育種中 的種間不親和現(xiàn)象，消除雜交障礙，極大地拓寬了抗性基因的來(lái)源和應(yīng)用（Grover and Gowthama,2003)。
[0005] 利用外源抗病基因產(chǎn)物抑制黃萎病菌在植株體內(nèi)的生長(zhǎng)和繁殖可W提高植物對(duì) 黃萎病的抗性，另一方面，基于黃萎病菌毒素的致病機(jī)理，提高植物對(duì)黃萎病菌毒素的解毒 能力，也是提高植物對(duì)黃萎病抗性的有效方法之一。但是，絕大數(shù)研究者主要利用前一種方 法達(dá)到提高植物抗性的目的，尚未見成功利用外源基因的表達(dá)產(chǎn)物解毒病原菌產(chǎn)生的毒素 來(lái)提高對(duì)黃萎病抗性的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供編碼黃萎病菌P類ATTase的VdP4-ATPase基因在提高 植物對(duì)黃萎病抗性中的用途，通過(guò)將編碼黃萎病菌P類ATTase的VdP4-ATPase基因整合進(jìn)入 目標(biāo)植物構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物，并使得所述VdP4-ATPase基因在植物中表達(dá)而提高植物對(duì)黃萎 病的抗性。
[0007] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種提高植物對(duì)黃萎病抗性的方法，通過(guò)在目標(biāo)植 物體內(nèi)表達(dá)外源基因而提高所述植物對(duì)黃萎病的抗性，所述外源基因?yàn)榫幋a黃萎病菌P類 AT 化 se 的 VdP4-ATPase 基因。
[0008] 具體地，本發(fā)明是將含有SEQ ID ^.9所示核巧酸序列的黃萎病菌￥(1口4-4了口曰36基 因整合入植物中，實(shí)現(xiàn)運(yùn)些基因的組成型表達(dá)，提高轉(zhuǎn)基因植物對(duì)黃萎病菌毒素的解毒能 力，進(jìn)而獲得抗黃萎病的轉(zhuǎn)基因植物。
[0009] 更具體地，本發(fā)明的方法，包括下述步驟：
[0010] 將VdP4-ATPase基因整合進(jìn)入目標(biāo)植物構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物，并使得所述VdP4-ATPase 基因在植物中表達(dá)。
[0011] 優(yōu)選地，所述的方法，包括下述步驟：
[0012] 1)構(gòu)建含有來(lái)自黃萎病菌VdP4-ATPase基因的重組植物表達(dá)載體；
[0013] 2)將所述重組植物表達(dá)載體導(dǎo)入目標(biāo)植物中，使得VdP4-ATPase基因在目標(biāo)植物 中組成型表達(dá)；
[0014] 3)獲得具有提高的抗黃萎病的轉(zhuǎn)基因植物。
[0015] 優(yōu)選地，所述￥(1?4-4了?曰36基因的核巧酸序列如569 10^.9所示。
[0016] 本發(fā)明的方法可W適用于的目標(biāo)植物優(yōu)選為番茄、煙草或棉花。
[0017] 本發(fā)明方法中，步驟1)中的重組植物表達(dá)載體具有如圖4所示的結(jié)構(gòu)。
[001 引
[0019] 本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種具有黃萎病抗性的轉(zhuǎn)基因植物的制備方法，包括 W下步驟：
[0020] i)獲得編碼黃萎病菌P類ATTase的VdP4-ATPase基因，并將其可操作地插入植物表 達(dá)載體中，構(gòu)建植物表達(dá)載體；
[0021 ] i i)用步驟i)獲得的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主，獲得轉(zhuǎn)化體；
[0022] iii)用步驟ii)獲得的轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)化植物，獲得轉(zhuǎn)基因植物。
[0023] 本發(fā)明利用黃萎病菌VdP4-ATPase基因提高植物對(duì)黃萎病抗性的方法，具體包括 如下的步驟：
[0024] 1)獲得黃萎病菌VdP4-ATPase基因：引入Spel和Smal酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，然后W黃 萎病菌cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物即為添加酶切位點(diǎn)的VdP4-ATPase基因序列；
[00巧]2)構(gòu)建組成型表達(dá)VdP4-ATPase基因的植物表達(dá)載體:將擴(kuò)增獲得的VdP4-ATPase 基因序列連接入植物表達(dá)載體化GN-35S-NOS，構(gòu)建一個(gè)新的植物表達(dá)載體，命名為化GN- 35S-VdP4-ATPase；
[0026] 3)植物的遺傳轉(zhuǎn)化：利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將上述步驟2)獲得的化GN-35S- VdP4-ATPase植物表達(dá)載體整合入植物基因組，實(shí)現(xiàn)VdP4-ATPase基因在轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)的組 成型表達(dá)，提高轉(zhuǎn)基因植物對(duì)黃萎病的抗性；
[0027] 4)抗黃萎病的VdP4-ATPase轉(zhuǎn)基因植株的獲得:將步驟3)獲得的轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)一 步進(jìn)行繁殖、分子鑒定和抗病鑒定，獲得對(duì)黃萎病抗性提高的VdP4-ATPase轉(zhuǎn)基因植株。
[0028] 進(jìn)一步，組成型表達(dá)的pLGN-35S-VdP4-ATPase植物表達(dá)載體構(gòu)建的步驟包括:獲 得黃萎病菌的cDNA后，設(shè)計(jì)上游引物:5 ' -GACTAGTATGGC TGGACGACCCACGGG(SpeI)-3 '，下游 引物5 ' -CCCCGGGTCAGGTTCCCTGTCCTTGTG (Smal) ~3 '進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物和 pLGN-35S-Nos 載體質(zhì)粒分別進(jìn)行Spel和Smal雙酶切，并分別回收酶切后的大片段，再利用連接酶將回收 片段進(jìn)行連接，構(gòu)建一個(gè)新的植物表達(dá)載體，命名為pLGN-35S-VdP4-ATPase，W實(shí)現(xiàn)VdP4- AT化S e基因在轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)的組成型表達(dá)。
[0029] 本發(fā)明所述的植物主要為煙草、番茄和棉花。
[0030] 前述步驟2)所述的構(gòu)建組成型表達(dá)黃萎病菌VdP4-ATPase基因植物表達(dá)載體的方 法為本領(lǐng)域的常規(guī)方法，使用的載體為植物基因工程的常規(guī)載體，組成型表達(dá)啟動(dòng)子為花 挪菜花葉病毒CaMV35S啟動(dòng)子，利用其他具有組成型特性的啟動(dòng)子也能達(dá)到同樣的目的。
[0031] 前述步驟3)所述的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化方法，其中將植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng) 桿菌的方法為電轉(zhuǎn)化法，將植物表達(dá)載體整合入煙草、番茄和棉花的方法為根癌農(nóng)桿菌介 導(dǎo)法。
[0032] 前述步驟4)所述的分子鑒定為分子生物學(xué)、基因工程等領(lǐng)域所用的鑒定技術(shù)，如 GUS組織化學(xué)染色、PCR擴(kuò)增鑒定等技術(shù)。
[0033] 前述步驟4)所述的抗病鑒定是指人工氣候室或溫室內(nèi)幼苗植株對(duì)黃萎病的抗性 鑒定，轉(zhuǎn)基因煙草和番茄均采用灌菌液法進(jìn)行病原菌的接種，棉花則采用浸根法進(jìn)行接種。
[0034] 本發(fā)明所提供的提高植物對(duì)黃萎病抗性的方法，是將來(lái)自黃萎病菌的VdP4- ATTase基因分別轉(zhuǎn)入煙草、番茄和棉花細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)運(yùn)些基因在轉(zhuǎn)基因植株中的組成型表 達(dá)，利用外源基因編碼的P4類ATP酶解毒黃萎病菌在植物體內(nèi)產(chǎn)生的毒素，提高轉(zhuǎn)基因植物 對(duì)黃萎病菌毒素的解毒能力，進(jìn)而提高轉(zhuǎn)基因植物對(duì)黃萎病的抗病性。
[0035] 環(huán)抱菌素 A(CsA)是一種由11個(gè)氨基酸組成的親脂疏水性環(huán)膚，本發(fā)明結(jié)合了 CsA 和黃萎病菌毒素部分結(jié)構(gòu)的相似性，W及黃萎病菌致病機(jī)理的特性，創(chuàng)造性地提出利用黃 萎病菌VdP4-ATPase基因在轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)組成型表達(dá)，提高轉(zhuǎn)基因植物對(duì)黃萎病菌毒素的 解毒能力，進(jìn)而提高轉(zhuǎn)基因植物對(duì)黃萎病的抗性的策略。
[0036] 本發(fā)明主要是利用轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物對(duì)黃萎菌毒素的解毒能力提高植物抗病性，更進(jìn)一 步的W相同的方式利用轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物提高植物對(duì)真菌毒素的解毒能力也是本發(fā)明的保護(hù)范 圍。同時(shí)本發(fā)明中設(shè)及的植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化細(xì)胞等也在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0037] 利用本發(fā)明方法獲得的VdP4-ATPase轉(zhuǎn)基因煙草，To代幼苗利用傷根灌菌液法接 種高毒力12-1菌株30(1，病情指數(shù)為29.35，較野生型對(duì)照46.34。接種30(1，46個(gè)￥(1口4- ATTase轉(zhuǎn)化子中仍有14個(gè)轉(zhuǎn)化子沒(méi)有出現(xiàn)明顯的病癥。VdP4-ATPase轉(zhuǎn)基因棉花Τι代幼苗， 利用浸根接種法接種V991落葉型黃萎病菌株20d，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ詹∏橹笖?shù)達(dá)到了 82.24,有 兩個(gè)VdP4-ATPase株系的病情指數(shù)低于10,分別為6.25和8.33。利用本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因番 茄To代幼苗植株利用傷根灌菌液法接種高毒力L2-1菌株，非轉(zhuǎn)基因番茄的病情指數(shù)達(dá)到 78.33，VdP4-ATPase轉(zhuǎn)基因番茄的病情指數(shù)為40.83，較野生型對(duì)照降低37.5。研究結(jié)果表 明，利用本發(fā)明方法獲得的轉(zhuǎn)基因棉花、煙草和番茄可W顯著提轉(zhuǎn)基因植物對(duì)黃萎病的抗 病性。說(shuō)明，本發(fā)明提供的提高植物對(duì)黃萎病抗性的方法效果顯著。該方法不僅適用于棉 花、煙草和番茄，所有能受黃萎病菌侵染的植物均可利用該方法提高對(duì)黃萎病的抗性。
[0038] 本發(fā)明提供的方法主要是利用對(duì)病原菌毒素的解毒而提高植物的抗性，因而不具 有病原菌小種抗性的特點(diǎn)。因此，可W廣泛應(yīng)用于提高不同病原菌生理小種的抗性，不存在 小種專一性抗性的特點(diǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0039] 圖1為植物病原菌對(duì)CsA的敏感性檢測(cè)結(jié)果分析
[0040]