Erythroferrone和erfe多肽以及調(diào)控鐵代謝的方法
【專利說明】ERYTHROFERRONE和ERFE多肽以及調(diào)控鐵代謝的方法
[0001] 經(jīng)由EFS-WEB提交的序列表的引用
[0002] 大小為14. 3kb的創(chuàng)建于2013年10月28日且與本申請一起經(jīng)由EFS-Web電子提 交的、名稱為"20131031_034044_119W01_seq_ST25"的序列表的ASCII文本文件的內(nèi)容通 過引用方式整體并入本文中。
[0003] 對于政府支持的致謝
[0004] 本發(fā)明是在美國國立衛(wèi)生研宄院（National Institutes of Health)的國立糖尿 病消化與腎臟疾病研宄所（National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases，NIDDK)授予的資助號R01 DK082717和R01 DK 065029的政府支持下完成的。政 府對本發(fā)明擁有一定的權(quán)利。
[0005] 發(fā)明背景 1.發(fā)明領(lǐng)域
[0006] 本發(fā)明涉及調(diào)控鐵代謝的多肽以及制備和使用該多肽的方法。
[0007] 2.相關(guān)領(lǐng)域的描述
[0008] 紅細(xì)胞生成目前為止是機體內(nèi)鐵的主要消耗者。尤其已經(jīng)由Finch等人在50年 多年以前提出存在響應(yīng)紅細(xì)胞生成需求而調(diào)控鐵的激素。參見Finch1994。令人遺憾的 是，F(xiàn)inch和其它人從未發(fā)現(xiàn)任何此類激素。
[0009] 其它研宄者研宄了在地中海貧血中鐵吸收增加的原因，并且提出兩種物質(zhì)⑶F15 和TWSG1可導(dǎo)致該疾病中鐵調(diào)素抑制和鐵超負(fù)荷，但推論這并不是鐵吸收的生理信號。參 見Tanno2010b和Casanovas2013。⑶F15或TWSG1在地中海貧血的鐵超負(fù)荷中的作用從 未具體說明。
[0010] 發(fā)明概述
[0011] 在一些實施方案中，本發(fā)明涉及經(jīng)分離的、經(jīng)純化的、合成和/或重組多肽，該多 肽包含與SEQIDNO: 16具有約95-100%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約 99%序列同一性的C-末端序列。在一些實施方案中，所述多肽包含與SEQIDN0:17具有約 70-100 %、至少約80 %、至少約90 %或至少約95 %序列同一性的N-末端序列。在一些實施 方案中，本發(fā)明涉及經(jīng)分離的、經(jīng)純化的、合成和/或重組多肽，該多肽基本上由以下序列 組成或者由以下序列組成：與SEQIDNO: 16具有約95-100%、至少約96%、至少約97%、至 少約98%或至少約99%序列同一性的C-末端序列和與SEQIDNO: 17具有約70-100%、至 少約80 %、至少約90 %或至少約95 %序列同一性的N-末端序列。在一些實施方案中，本發(fā) 明涉及經(jīng)分離的、經(jīng)純化的、合成和/或重組多肽，該多肽與SEQIDN0:1或SEQIDN0:2具 有約70至100 %、至少約80 %、至少約90 %或至少約95 %序列同一性。在一些實施方案中， 本發(fā)明涉及經(jīng)分離的、經(jīng)純化的、合成和/或重組多肽，該多肽包含至少一種以下序列、基 本上由至少一種以下序列組成或者由至少一種以下序列組成：SEQIDN0:3，SEQIDN0:4， SEQIDN0:5，SEQIDN0:6，SEQIDN0:7，SEQIDN0:8，SEQIDN0:9，SEQIDN0:10，SEQ IDNO: 11，SEQIDNO: 12,SEQIDNO: 13,SEQIDNO: 14 和SEQIDNO: 15,其中X為任何氨 基酸。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及經(jīng)分離的、經(jīng)純化的、合成和/或重組多肽，該多肽包 含所有以下序列、基本上由所有以下序列組成或者由所有以下序列組成：SEQIDN0:3，SEQ IDNO:4,SEQIDNO:5,SEQIDNO:6,SEQIDNO:7,SEQIDNO:8,SEQIDNO:9,SEQID 勵：10,5￡〇10勵：11，5￡〇10勵：12,5￡〇10勵：13,5￡〇10勵：14和5￡〇10勵：15，其中 X為任何氨基酸。在一些實施方案中，當(dāng)向人受試者施用時，本發(fā)明的多肽降低在人受試者 中的肝鐵調(diào)素mRNA和/或血清鐵調(diào)素水平。在一些實施方案中，本發(fā)明的多肽表現(xiàn)出與 SEQIDN0:1 或SEQIDN0:2 的erythroferrone活性相同或者基本類似的erythroferrone 活性。在一些實施方案中，本發(fā)明的多肽表現(xiàn)出由SEQIDNO: 1或SEQIDN0:2提供的 erythroferrone活性的約 60-100%、約 70-100%、約 80-100%、約 90-100%或約 95-100% 的erythroferrone活性。
[0012] 在一些實施方案中，本發(fā)明涉及經(jīng)分離的、經(jīng)純化的、合成和/或重組多肽，該多 肽包含以下殘基、基本上由以下殘基組成或者由以下殘基組成：至少約10、至少約11、至少 約12、至少約13、至少約14、至少約15、至少約16、至少約17、至少約18、至少約19、至少約 20、至少約21、至少約22、至少約23、至少約24或至少約25個SEQIDNO: 1、SEQIDN0:2 或SEQIDNO: 16的連續(xù)氨基酸殘基。
[0013] 在一些實施方案中，使用合成或重組技術(shù)來制備本發(fā)明的多肽。
[0014] 在一些實施方案中，本發(fā)明涉及經(jīng)經(jīng)分離的、經(jīng)純化的、合成和/或重組核酸分 子，該核酸分子包含編碼根據(jù)本發(fā)明所述的多肽的序列、基本上由編碼根據(jù)本發(fā)明所述的 多肽的序列組成或者由編碼根據(jù)本發(fā)明所述的多肽的序列組成。
[0015] 在一些實施方案中，本發(fā)明涉及重組細(xì)胞，該重組細(xì)胞能夠表達(dá)根據(jù)本發(fā)明所述 的多肽和/或包含編碼根據(jù)本發(fā)明所述的多肽的核酸分子。
[0016] 在一些實施方案中，本發(fā)明涉及抗體，該抗體針對根據(jù)本發(fā)明所述的多肽產(chǎn)生。所 述抗體可以為單克隆抗體。在一些實施方案中，所述抗體為人源化抗體、嵌合抗體或人抗 體。
[0017] 在一些實施方案中，本發(fā)明涉及組合物，該組合物包含以下物質(zhì)、基本上由以下物 質(zhì)組成或者由以下物質(zhì)組成：根據(jù)本發(fā)明所述的多肽和/或編碼根據(jù)本發(fā)明所述的多肽的 核酸分子和/或針對根據(jù)本發(fā)明所述的多肽產(chǎn)生的抗體。在一些實施方案中，所述組合物 以比在正常受試者中存在的濃度更高的濃度包含根據(jù)本發(fā)明所述的多肽和/或編碼根據(jù) 本發(fā)明所述的多肽的核酸分子和/或針對根據(jù)本發(fā)明所述的多肽產(chǎn)生的抗體。
[0018] 在一些實施方案中，本發(fā)明涉及在受試者中治療鐵代謝疾病的方法，該方法包括 以下步驟、基本上由以下步驟組成或者由以下步驟組成：施用至少一種根據(jù)本發(fā)明所述的 多肽、編碼根據(jù)本發(fā)明所述的多肽的核酸分子、針對根據(jù)本發(fā)明所述的多肽產(chǎn)生的抗體或 者包含根據(jù)本發(fā)明所述的多肽的組合物。在一些實施方案中，所述受試者為人。在一些實 施方案中，所述受試者需要該方法。如本文所使用，"有需要的受試者"是已經(jīng)被診斷具有或 患有鐵代謝疾病的受試者。在一些實施方案中，鐵代謝疾病是鐵超負(fù)荷疾病或者與異常低 水平的鐵調(diào)素相關(guān)的疾病和/或病癥。在一些實施方案中，鐵代謝疾病是與異常低水平的 鐵和/或異常高水平的鐵調(diào)素相關(guān)的疾病或病癥。在一些實施方案中，向受試者施用的多 肽為-ERFE多肽。在一些實施方案中，向受試者施用的多肽為+ERFE多肽。在一些實施方 案中，施用有效量、優(yōu)選治療有效量的一種或多種多肽。在一些實施方案中，該方法包括以 下步驟、基本上由以下步驟組成或者由以下步驟組成：通過向受試者施用有效量、優(yōu)選治療 有效量的ERFE多肽來調(diào)控在受試者中鐵調(diào)素的量。在一些實施方案中，該方法包括測量在 施用之前、之中或之后在受試者中的一種或多種ERFE多肽和/或鐵調(diào)素的量。在一些實施 方案中，使用測定來測量ERFE多肽的量，該測定使用編碼根據(jù)本發(fā)明所述的多肽的一種或 多種核酸分子和/或針對根據(jù)本發(fā)明所述的多肽產(chǎn)生的一種或多種抗體。在一些實施方案 中，該方法包括向受試者施用鐵調(diào)素的測量值高于正常值時的一種或多種+ERFE多肽或者 鐵調(diào)素的測量值低于正常值時的一種或多種_ERFE多肽。
[0019] 在一些實施方案中，本發(fā)明涉及測定，該測定用于檢測在樣品中ERFE多肽的存在 和/或測量在樣品中ERFE多肽的量，該測定包括使樣品與針對根據(jù)本發(fā)明所述的多肽產(chǎn)生 的抗體接觸，然后檢測結(jié)合抗體的存在和/或測量結(jié)合抗體的量。
[0020] 在一些實施方案中，本發(fā)明涉及試劑盒，該試劑盒包括與試劑、裝置、指導(dǎo)材料或 者其組合一起包裝的至少一種根據(jù)本發(fā)明所述的多肽、編碼根據(jù)本發(fā)明所述的多肽的核酸 分子、如本文所公開的重組細(xì)胞、針對根據(jù)本發(fā)明所述的多肽產(chǎn)生的抗體或者如本文所公 開的組合物。
[0021] 在一些實施方案中，本發(fā)明涉及雜交瘤細(xì)胞系，該雜交瘤細(xì)胞系能夠表達(dá)特異性 識別根據(jù)本發(fā)明所述的多肽的抗體或者針對根據(jù)本發(fā)明所述的多肽產(chǎn)生的抗體。
[0022] 在一些實施方案中，本發(fā)明涉及復(fù)合物，該復(fù)合物包含結(jié)合抗體的至少一種根據(jù) 本發(fā)明所述的多肽，其中所述至少一種多肽和/或抗體通過重組技術(shù)制備。
[0023] 在一些實施方案中，本發(fā)明涉及一種或多種根據(jù)本發(fā)明所述的多肽、編碼根據(jù)本 發(fā)明所述的多肽的核酸分子、針對根據(jù)本發(fā)明所述的多肽產(chǎn)生的抗體或者包含所述多肽、 核酸分子和抗體中的一種或多種的組合物在制備治療鐵代謝疾病的藥劑中的用途。
[0024] 在一些實施方案中，本發(fā)明涉及一種或多種根據(jù)本發(fā)明所述的多肽、編碼根據(jù)本 發(fā)明所述的多肽的核酸分子、針對根據(jù)本發(fā)明所述的多肽產(chǎn)生的抗體或者包含所述多肽、 核酸分子和抗體中的一種或多種的組合物在治療鐵代謝疾病中的用途。
[0025] 發(fā)明詳述
[0026] 前面的概述和以下的詳述都僅為示例性和說明性，并且意在對要求保護(hù)的本發(fā)明 提供進(jìn)一步的解釋。附圖被包括以進(jìn)一步理解本發(fā)明并在此引入本說明書，并且組成本說 明書的一部分、說明本發(fā)明的一些實施方案及與說明書一起用于解釋本發(fā)明的原理。
[0027] 附圖描述
[0028] 通過參考附圖進(jìn)一步理解本發(fā)明，其中：
[0029] 圖1:相對于未經(jīng)處理的動物，在紅細(xì)胞生成刺激（靜脈抽血（實線）或EPO注射 (虛線））之后肝Hamp mRNA受到抑制。使用6周齡雄性小鼠，n=4/組。*p〈0. 05，**p〈. 01， #*p〈.001，通過學(xué)生t檢驗與未經(jīng)處理的動物比較。
[0030] 圖2 :健康人志愿者對在第2天9AM時給予EPO5000U的響應(yīng)（Ashby2010)。
[0031] 圖 3A-3B:ERFE是TNF-a超家族的成員。圖 3A:小鼠（SEQIDNO:2)和人ERFE 蛋白（SEQIDNO: 1)的比對。突出顯示的序列是SEQIDNO: 16。進(jìn)行人ERFE的C-末端 區(qū)段與TNF家族的其它人成員和ERFE的人變體的彩色CLUSTAL比對。發(fā)現(xiàn)，ERFE的人變 體在信號序列上不同。因此，根據(jù)本發(fā)明所述的ERFE多肽包含與如SEQIDNO: 16所示的 N-末端區(qū)段的90-100 %，優(yōu)選95-100 %，更優(yōu)選98-100 %和最優(yōu)選99-100 %序列同一性。 圖3B:基于與TNFa超家族其它成員的類似性的ERFE的結(jié)構(gòu)模型。
[0032] 圖4:與未經(jīng)處理的小鼠相比，在靜脈抽血（實線）或EPO注射（虛線）之后骨髓 ErfemRNA增加倍數(shù)。使用6周齡小鼠，n= 4/組。*p〈. 001，**p〈. 01，通過t檢驗與未經(jīng)處 理的動物比較。圖5:人ERFE是在中幼紅細(xì)胞中最大程度表達(dá)的紅細(xì)胞系轉(zhuǎn)錄物。圖5A顯 示在各種組織中按照強度順序的相對的人ERFEmRNA表達(dá)。胎兒肝臟和骨髓，高水平表達(dá)人 ERFEmRNA的器官，含有成紅細(xì)胞。圖5B基于人成紅細(xì)胞成熟數(shù)據(jù)庫（HumanErythroblast MaturationDatabase，Merryweather-Clarke2011)。顯不了從紅細(xì)胞類菌落形成單位 (CFU-E)(紅細(xì)胞發(fā)育的極早期階段）到原成紅細(xì)胞（Pro-E)、中幼紅細(xì)胞（Int-E)到晚幼 紅細(xì)胞（LateE)的成熟人成紅細(xì)胞中人ERFEmRNA的相對表達(dá)。
[0033] 圖6 :通過Socolovsky方法（Liu2006)分類為原成紅細(xì)胞（ProE)和成紅細(xì)胞 EryA、B、C階段的小鼠骨髓成紅細(xì)胞中的ErfemRNA表達(dá)。白柱表示來自在靜脈抽血0.5ml 之后15小時的C57BL/6小鼠的骨髓；而黑柱表示來自未經(jīng)操作的對照小鼠的骨髓。六周齡 雄性小鼠，n= 3/組，*p〈0. 01，通過t-檢驗。
[0034] 圖7A-7C:在靜脈抽血的Erfe+/+、Erfe-和Erfe+小鼠（標(biāo)記為WT(野生型，圖 7A)、HT(雜合體，圖7B)和K0(敲除，圖7C))的肝臟中HampmRNA的改變。n= 3至6只小 鼠/組。與未行靜脈抽血的對照相比，*P〈. 001，**P〈. 01，通過t-檢驗。
[0035] 圖8:缺乏Erfe的小鼠顯示從貧血中恢復(fù)延緩（A和B)。與野生型小鼠相比（虛 線），經(jīng)靜脈抽血的缺乏Erfe的小鼠（實線）顯示出血紅蛋白恢復(fù)延緩和較低的平均紅細(xì) 胞血紅蛋白量（MCH)。通過學(xué)生t檢驗比較WT(n= 17)和K0(n= 15)之間每次測量的 血液參數(shù)（A，B)。在沒有性別差異的情況下，將每一參數(shù)的兩種性別合并。***p〈0. 001， **p〈0. 01，*p〈0. 05。
[0036] 圖9A-9C:圖9A:用0.5或1yg質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞，該質(zhì)粒DNA編碼 融合到C-末端6His標(biāo)記的小鼠ErfecDNA。使用抗-6His抗體的蛋白質(zhì)印跡檢測到Erfe 主要在上清液中，這表明分泌了大量的Erfe。圖9B:分泌的Erfe為N-和0-糖基化的。圖 9C:在蛋白質(zhì)印跡中針對內(nèi)部肽序列PSRVPAAQEL(SEQIDN0:18)產(chǎn)生的兔抗小鼠抗-Erfe 抗體2檢測重組蛋白，其中+/-表明經(jīng)Erfe質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或不經(jīng)Erfe質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。
[0037] 圖10 :Erfe直接作用于肝臟來抑制鐵調(diào)素。（A，B，C)使用小鼠重組Erfe(2yg/ g)或鹽水經(jīng)腹腔處理六只C57BL/6雄性小鼠，并在15小時之后分析。肝鐵調(diào)素mRNA(A) 和血清鐵調(diào)素（B)水平均顯著受到Erfe處理抑制，盡管肝臟SaalmRNA表達(dá)（C)增加表明 出現(xiàn)了炎癥反應(yīng)。（D，E，F(xiàn))使用編碼GFP或小鼠ErfecDNA序列的慢病毒來轉(zhuǎn)導(dǎo)八只7周 齡C57BL/6雄性小鼠。（D)在用Erfe慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的小鼠的肝臟中ErfemRNA表達(dá)僅輕度 增加（與使用紅細(xì)胞生成刺激的小鼠骨髓中32倍上調(diào)相比，僅為基線骨髓水平的2倍）， 但是該增加足以降低肝鐵調(diào)素mRNA(E)和血清鐵調(diào)素（F)水平。（G)如通過使用抗-FLAG 抗體的蛋白質(zhì)印跡檢測到，通過使用Erfe慢病毒感染的HEK293T細(xì)胞分泌重組小鼠Erfe。 (H)使用來自對照細(xì)胞或者過表達(dá)Erfe的HEK293T細(xì)胞的上清液（50%v/v)對小鼠原代肝 細(xì)胞處理表明Erfe直接作用于肝臟以抑制鐵調(diào)素mRNA表達(dá)。顯示了一式三份經(jīng)15小時 處理的3個獨立實驗的平均值土SEM。通過qRT-PCR來測量鐵調(diào)素（Hamp)、血清淀粉樣蛋 白l(Saal)和ErfemRNA(Erfe)水平。顯不-ACt(艮P，CtHprt-CtHamp，Saal或Erfe) 的平均值土SEM。通過酶聯(lián)免疫吸附測定來測量血清鐵調(diào)素水平（B，F(xiàn))。通過學(xué)生t檢驗 來比較經(jīng)處理的小鼠和對照小鼠之間或者經(jīng)Erfe處理的樣品和對照樣品之間的平均值。 ***p〈0. 001，**p〈0. 01，*p〈0. 05。
[0038] 圖11 :與野生型小鼠（WT)(n= 5)相比，在中間型0-地中海貧血th3/+小鼠 (thal)(n= 4)的骨髓和脾臟中ErfemRNA增加。使用6月齡雄性小鼠。*p= 0. 016， **p〈0.001。將Hprt用作參考基因。
[0039] 圖12 :Erfe的預(yù)測結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域。SP=信號肽；NTD=N-末端結(jié)構(gòu)域1和2。
[0040] 發(fā)明詳述
[0041] 本發(fā)明基于在本文中被稱為"Erythroferrone"的蛋白的發(fā)現(xiàn)。Erythroferrone 開始被鑒定為在受試者中介導(dǎo)紅細(xì)胞生成以及鐵吸收和分布的"激素"。Erythr