yl并且飼喂充滿(mǎn)鐵的（300ppm)飲食。為了評(píng)估Erfe 對(duì)鐵循環(huán)和由儲(chǔ)備中動(dòng)員的影響，使用右旋糖酐鐵來(lái)預(yù)處理小鼠以向它們提供充足的鐵儲(chǔ) 備，從而補(bǔ)償500 y 1失血（300 y g的鐵），并且一周之后進(jìn)行靜脈抽血和飼喂4ppm缺鐵飲 食。預(yù)計(jì)在Erfe K0小鼠中缺乏鐵調(diào)素抑制將會(huì)損壞儲(chǔ)備鐵釋放和由飲食吸收鐵的代償性 增加。其它結(jié)果會(huì)導(dǎo)致如由其它人（Chaston 2008)所報(bào)道的小腸對(duì)比巨噬細(xì)胞鐵運(yùn)輸差 別調(diào)控或者它們調(diào)控冗余途徑的可能性。
[0091] 其它可能的活性：Erfe可能對(duì)骨髓環(huán)境產(chǎn)生某些影響。為了檢測(cè)主要影響，人們 可比較在過(guò)表達(dá)Erfe的Erfe+和WT小鼠中股骨段的形態(tài)。為了比較在這些小鼠中的紅 細(xì)胞譜系，人們可通過(guò)基于c-kit、Terl 19、⑶71和/或⑶44的表達(dá)水平的流式細(xì)胞術(shù)來(lái)分 析總脾細(xì)胞和骨髓細(xì)胞。參見(jiàn)Socolovsky 2007;Chen 2009。
[0092] 2. Erythroferrone表征、其活性和作用機(jī)制
[0093] 可表征erythroferrone的質(zhì)量和組成（包括它的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外同工型），并且 進(jìn)行結(jié)構(gòu)域刪除分析以建立其功能組件。也可確定erythroferrone是否分泌至循環(huán)內(nèi)和 它是否直對(duì)肝臟產(chǎn)生影響。Erythroferrone的重組型和/或合成型可用于檢查它對(duì)鐵調(diào)素 體內(nèi)和體外表達(dá)的影響?？蓹z查erythroferrone以及erythroferrone的受體對(duì)紅細(xì)胞類(lèi) 前體及其紅細(xì)胞類(lèi)分化的影響。
[0094] 物理化學(xué)和組成特征-人們可使用編碼融合到C-末端FLAG和6-組氨酸標(biāo)記的 小鼠和人erythroferrone cDNA序列的質(zhì)粒來(lái)進(jìn)行HEK293T細(xì)胞（Freestyle 293表達(dá)系 統(tǒng)，Invitrogen)中等規(guī)模的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)增加以下可能性：重組蛋 白越來(lái)越接近實(shí)際上可行的天然形式。可純化和測(cè)定來(lái)自細(xì)胞裂解物的胞內(nèi)形式和來(lái)自 培養(yǎng)基中分泌形式。根據(jù)之前的實(shí)驗(yàn)，優(yōu)選2步純化用于獲得令人滿(mǎn)意的純蛋白，該純蛋 白可用于體內(nèi)和體外處理。因此，主要可使用對(duì)C-末端標(biāo)記之一特異的親和珠進(jìn)行重組 erythroferrone的初始純化，并可通過(guò)HPLC進(jìn)行最后的純化。為了防止在純化期間活性被 潛在抑制或者被標(biāo)記抑制，人們也可測(cè)試經(jīng)部分純化的級(jí)分和經(jīng)處理去除標(biāo)記的蛋白的活 性?？墒褂媚z滲透色譜和SDS-PAGE表征純化蛋白的大小，然后可通過(guò)N-末端Edman降 解和通過(guò)蛋白酶切割和碎裂質(zhì)譜來(lái)測(cè)定序列。使用具有針對(duì)erythroferrone的抗體的蛋 白質(zhì)印跡，人們可比較重組蛋白與在培養(yǎng)物中通過(guò)經(jīng)EP0刺激的鼠成紅細(xì)胞分泌的Erfe的 大小。
[0095] ERFE多肽和活性-人們可通過(guò)兩種互補(bǔ)的方法分析ERFE多肽的功能形式和結(jié) 構(gòu)域。首先，通過(guò)將部分或完全純化的可溶性和細(xì)胞來(lái)源的ERFE注射至小鼠內(nèi)來(lái)測(cè)定它們 的生物活性。在第二方法中，慢病毒遞送方法用于研宄Erfe變體，其中修飾所述蛋白以去 除其單獨(dú)結(jié)構(gòu)域部分或者全部。最初，人們可取代遺傳信號(hào)序列和使所述蛋白進(jìn)行N-末端 截短分析以去除N-末端結(jié)構(gòu)域（NTD1)和/或膠原結(jié)構(gòu)域（圖12)，從而測(cè)定這些對(duì)Erfe 體內(nèi)活性是否重要。N-末端結(jié)構(gòu)域2(NTD2)可能更難完全去除，因?yàn)樗腃ysl42可能參 與二硫鍵配對(duì)，但是可去除它的至少一半N-末端。根據(jù)它與其它細(xì)胞因子的同源性，預(yù)期 TNF-樣C-末端是活性部分，并且其它結(jié)構(gòu)域促進(jìn)合成、分泌或可能的替代性功能，例如膜 締合形式的Erfe的細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)。在兩種方法中，4-15小時(shí)之后的讀出將包括通過(guò)免疫 測(cè)定和qPCR測(cè)量在肝臟中鐵調(diào)素mRNA表達(dá)的血清鐵調(diào)素。為了防止當(dāng)飼喂小鼠導(dǎo)致中等 鐵超負(fù)荷的"標(biāo)準(zhǔn)"飲食（通常270-300ppm)時(shí)刺激鐵調(diào)素的強(qiáng)鐵信號(hào)的干擾，可在注射之 前飼喂小鼠低（4ppm Fe)或充足（50ppm Fe)鐵飲食中2周。這種預(yù)處理確保鐵調(diào)素對(duì)正 刺激和負(fù)刺激的響應(yīng)。
[0096] 紅細(xì)胞類(lèi)成熟_ Erythroferrone也可對(duì)紅細(xì)胞類(lèi)擴(kuò)增和成熟產(chǎn)生作用，無(wú)論是 直接還是通過(guò)它對(duì)鐵遞送的作用產(chǎn)生。顯示在缺鐵性貧血之后補(bǔ)充鐵會(huì)增加有核類(lèi)紅細(xì)胞 (erythroid cells) 2. 5倍，而增加成紅細(xì)胞多達(dá)3. 9倍，這表明鐵的利用率限制看成紅細(xì) 胞擴(kuò)增。在初步研宄中，將流式細(xì)胞術(shù)（Terll9、CD71、CD44標(biāo)記）（Socolovsky 2007;Chen 2009)用于分析與未經(jīng)處理的同窩小鼠對(duì)照相比在靜脈抽血的野生型、雜合體和K0小鼠的 骨髓和脾臟中成紅細(xì)胞的成熟。在靜脈抽血后72小時(shí)，在Erf小鼠中類(lèi)紅細(xì)胞看起來(lái) 比WT和雜合體中類(lèi)紅細(xì)胞更加不成熟，但未觀察到更多死細(xì)胞，從而表明Erfe在成紅細(xì)胞 針對(duì)細(xì)胞凋亡的保護(hù)中無(wú)作用。因?yàn)镵0小鼠看起來(lái)具有相對(duì)較少的不成熟前體（早期成 紅細(xì)胞）以及在Erfe K0小鼠中細(xì)胞凋亡似乎未改變，所以Erfe可能在早期祖細(xì)胞增殖和 分化的調(diào)控中起到作用。
[0097] 人們通過(guò)比較Erfe K0小鼠與WT小鼠，可通過(guò)在紅細(xì)胞生成激發(fā)之后各時(shí)間間隔 下收集的脾和骨髓祖細(xì)胞以及培養(yǎng)的胎肝臟祖細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)，研宄在erythroferrone 紅細(xì)胞生成中的作用。人們還可使用在Erfe K0和WT小鼠中類(lèi)似的方法研宄注射的 erythroferrone對(duì)紅細(xì)胞生成的影響。可通過(guò)Terll9、Q)71和/或⑶44表達(dá)表征成紅細(xì) 胞分化?？赏ㄟ^(guò)使用AnnexinV和7-氨基-放線(xiàn)菌素D (7-AAD)分別染色來(lái)分析細(xì)胞凋亡 信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞死亡。
[0098] 體內(nèi)Erfe處理及隨后對(duì)成熟階段之間的紅細(xì)胞前體數(shù)目和分布的流式細(xì)胞分析 將證實(shí)Erfe對(duì)紅細(xì)胞前體增殖或成熟的任何顯著作用。然而，它們無(wú)法確定所述作用是由 鐵和鐵調(diào)素來(lái)介導(dǎo)還是通過(guò)Erfe直接影響紅細(xì)胞前體來(lái)介導(dǎo)。為了回答這個(gè)問(wèn)題，人們可 研宄添加到胎肝臟紅細(xì)胞前體培養(yǎng)物中的Erfe的作用，其中鐵（含鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白）存在于培 養(yǎng)基中并且鐵調(diào)素濃度非常低。在添加的重組Erfe存在或缺失的情況下，可進(jìn)行來(lái)自WT 和Erfe+小鼠的14. 5-15. 5天胎肝臟紅細(xì)胞前體的體外培養(yǎng)。如前所述通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)可 分析紅細(xì)胞前體的成熟。在所有這些研宄中，人們可比較在Erfe K0和WT小鼠之間和Erfe 處理和假處理?xiàng)l件之間的前體類(lèi)群或細(xì)胞死亡/細(xì)胞凋亡指數(shù)。
[0099] ERFE 的受體-基于 erythroferrone 與 TNF a 的類(lèi)似性，erythroferrone 受體可 屬于TNF受體（TNFR)家族。在該家族中多個(gè)受體均是孤兒，即，缺乏任何已知的配體。參 見(jiàn)Bossen 2006。因此，人們可通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)來(lái)篩選已知鼠和人TNFR家族的表達(dá)文庫(kù)。 受體構(gòu)建體可在HEK293細(xì)胞中瞬間表達(dá)（Bossen 2006)，并且可使用鼠或人的FLAG-標(biāo) 記形式的erythroferrone (圖10G)、隨后為生物素化的抗-FLAG M2抗體和PE-偶聯(lián)的鏈 霉親和素來(lái)對(duì)這些受體構(gòu)建體染色。如果沒(méi)有已知的TNFR家族結(jié)合erythroferrone，貝1J 人們可使用在384孔板中粘附細(xì)胞和高通量熒光顯微術(shù)來(lái)對(duì)來(lái)自小鼠和人cDNA表達(dá)文庫(kù) 的所有受體樣分子進(jìn)行機(jī)器高通量篩選?？蓪?duì)命中進(jìn)行流式細(xì)胞確認(rèn)?？赏ㄟ^(guò)檢查組織 表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（例如，Nextbio Body Atlas)來(lái)篩選所有鑒定的受體的表達(dá)方式，從而證實(shí) 所述受體在erythroferrone的革E1組織（如果介體直接作用則為肝細(xì)胞）中表達(dá)，以及識(shí) 別針對(duì)erythroferrone的潛在的另外的組合和器官祀。人們也可進(jìn)行生化方法來(lái)鑒定 與erythroferrone相互作用的蛋白。可將Erythroferrone和/或ERFE多肽固定在磁珠 上，并且將它們用于從小鼠原代肝細(xì)胞（在之前研宄中被鑒定為ERFE靶的其它細(xì)胞類(lèi)型） 的膜或細(xì)胞裂解物中提取任何結(jié)合蛋白?？墒褂肏PLC-質(zhì)譜鑒定該復(fù)合物。一旦鑒定出 erythroferrone受體，則人們可使用它與其它受體（如何有）的類(lèi)似性來(lái)明確它潛在的信 號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。
[0100] 3.在與鐵調(diào)素抑制相關(guān)的鐵超負(fù)荷病癥中erythroferrone是否增加
[0101] 可測(cè)定在健康志愿者和患者血清樣品以及小鼠模型中Erythroferrone濃度以證 實(shí)erythroferrone在具有無(wú)效紅細(xì)胞生成的貧血癥中作為病理鐵調(diào)素抑制劑。
[0102] 正常和病理erythroferrone濃度-針對(duì)erythroferrone和/或ERFE多肽的 抗-erythroferrone抗體可用于測(cè)定在受試者中正常和異常erythroferrone濃度。發(fā)現(xiàn) 在蛋白質(zhì)印跡中針對(duì)Erfe蛋白的兩種不同表位的抗小鼠Erfe抗體與重組蛋白強(qiáng)烈反應(yīng) (圖9C)。ELISA測(cè)定可用于測(cè)量受試者中ERFE的循環(huán)水平，該受試者包括正常受試者和 在靜脈抽血、溶血性貧血之后的受試者或者在貧血恢復(fù)期的受試者以及患有鐵病癥的受試 者，該鐵病癥包括缺鐵性貧血和各種形式的地中海貧血（包括中間型地中海貧血）。
[0103] Erythroferrone的去除-在中間型地中海貧血的患者中缺乏鐵調(diào)素 (Papanikolaou 2005 ;0riga 2007)，因此這解釋了為什么甚至在沒(méi)有紅細(xì)胞輸液或者任何 其它非飲食鐵來(lái)源下這些患者超吸收飲食鐵并發(fā)展成鐵超負(fù)荷。為了探宄erythroferrone 作為在0 -地中海貧血中致病性鐵調(diào)素抑制劑的作用，人們可分析在中間型地中海貧血的 小鼠模型（例如Hbbth3/+)中Erfe去除對(duì)鐵調(diào)素表達(dá)和肝臟鐵超負(fù)荷的影響。Hbb th3/+小鼠 是0 -中間型地中海貧血的兩種可獲得模型中更為嚴(yán)重的一種，它具有7-9g/dL的Hb水 平，循環(huán)EP0濃度增加5至10倍，并且紅細(xì)胞生成無(wú)效（包括髓外部位）。它表現(xiàn)出較低的 鐵調(diào)素，但當(dāng)鐵超負(fù)荷增加到6月齡的菌株對(duì)照的鐵超負(fù)荷的3至5倍時(shí)，鐵調(diào)素最終會(huì)上 升到"正常"水平。參見(jiàn) Gardenghi 2007;Nai 2012。
[0104] 例如，測(cè)量6月齡的Hbbth3/+小鼠和其WT菌株對(duì)照中的Erfe水平，從而確定高水 平的Erfe是否為不恰當(dāng)?shù)退借F調(diào)素的原因。與WT小鼠相比，在Hbb th3/+小鼠的骨髓和脾 臟中Erfe mRNA顯著增加（圖11)。為了測(cè)試增加的Erfe是否為在該模型中觀察到的鐵 超負(fù)荷的原因，人們可確定去除Erfe表達(dá)的作用。Erfe基因在小鼠染色體1上，而0-球 蛋白基因在小鼠染色體7上，因此人們可通過(guò)如在中間型地中海貧血小鼠中其它基因所進(jìn) 行的那樣繁殖來(lái)生成Hbb th3/+Erfe+小鼠。參見(jiàn)Nai 2012;Gardenghi 2010。在C57B/6J背 景下的 Hbbth3/+小鼠可從 Jackson Labs (B6. 129P2-Hbb_bltmlUnc Hbb_b2tmlUnc/J，保存編 號(hào)，002683)獲得。
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