基于焦磷酸測序的病毒性出血性敗血癥病毒檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中基于焦磷酸測序的病毒性出血性敗血癥病毒檢測試 劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 鯉春病毒血癥（SVC)、病毒性出血性敗血癥（VHS)、傳染性造血器官壞死?。↖HN) 是同被列為《中華人民共和國進(jìn)境動物一、二類傳染病、寄生蟲病名錄》的二類傳染病，SVC、 VHS和IHN分別是《中華人民共和國動物防疫法》規(guī)定的二類和三類疫病，這三種疫病都是 國際獸疫局0IE名錄中的重要疫病。
[0003]VHS困擾歐洲虹鱒魚達(dá)50多年，被認(rèn)為是歐洲虹鱒魚養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的頭號殺 手，VHS逐漸在其他品種中也有報道。這3種疫病均是由RNA病毒引起的急性高度傳染性疾 病，可侵害多種海水和淡水養(yǎng)殖魚類，在歐、美、日、韓及部分亞洲國家流行，可通過魚體及 所產(chǎn)卵、精液、尿、糞便以及污染的飼料、水等傳播，對養(yǎng)殖場造成致命打擊，危害非常嚴(yán)重。
[0004] 鯉春病毒血癥病毒（SVCV)引起包括鯉魚在內(nèi)的很多水生動物的急性高度傳染性 疾病；傳染性造血器官壞死病毒（IHNV)引起鮭科多種魚的致死性疾病，通過污染的水、飼 料和糞便等傳播，幼魚和魚苗死亡率可達(dá)100%，成魚感染可終身帶毒并散毒；病毒性出血 性敗血癥病毒（VHSV)可引起各種年齡的鮭科多種魚發(fā)病，死亡率達(dá)80-100%，特別是幼魚 和魚苗。
[0005] 目前傳統(tǒng)的病毒分離及血清學(xué)診斷方法操作繁瑣，無法實現(xiàn)對不同亞型病毒的同 步檢測，RT-PCR方法也無法達(dá)到對病毒進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、高通量檢測分型的目的，因而目前 急需一種能夠?qū)VCV、VHSV和IHNV進(jìn)行高通量快速排查的集成化診斷技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何鑒定病毒性出血性敗血癥病毒。
[0007] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了檢測病毒性出血性敗血癥病毒指紋序列 的物質(zhì)在制備基于焦磷酸測序的病毒性出血性敗血癥病毒檢測試劑或試劑盒中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明所提供的檢測病毒性出血性敗血癥病毒指紋序列的物質(zhì)在制備基于焦磷 酸測序的病毒性出血性敗血癥病毒檢測試劑或試劑盒中的應(yīng)用中，所述病毒性出血性敗血 癥病毒指紋序列為序列表中SEQIDNo. 5的第451-467位核苷酸。
[0009] 上述應(yīng)用中，所述檢測病毒性出血性敗血癥病毒指紋序列的物質(zhì)可包括病毒性出 血性敗血癥病毒指紋序列的測序引物和/或擴(kuò)增病毒性出血性敗血癥病毒指紋序列的引 物對。
[0010] 上述應(yīng)用中，所述測序引物可為名稱為VHSV-S的序列表中SEQIDNo. 8所示的單 鏈DNA;所述擴(kuò)增病毒性出血性敗血癥病毒指紋序列的引物對可為名稱為VHSV-P的由序列 表中SEQIDNo. 6所示的單鏈DNA和SEQIDNo. 7所示的單鏈DNA組成的引物對。
[0011] 上述應(yīng)用中，所述SEQIDNo. 6所示的單鏈DNA和/或SEQIDNo. 7所示的單鏈 DNA可用生物素標(biāo)記。
[0012] 在本發(fā)明的一個實施例中，SEQIDNo. 7所示的單鏈DNA的5'端有生物素標(biāo)記。
[0013] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了基于焦磷酸測序的病毒性出血性敗血癥病 毒檢測試劑或試劑盒。
[0014] 本發(fā)明所提供的基于焦磷酸測序的病毒性出血性敗血癥病毒檢測試劑或試劑盒， 包括檢測病毒性出血性敗血癥病毒指紋序列的物質(zhì)；所述病毒性出血性敗血癥病毒指紋序 列為序列表中SEQIDNo. 5的第451-467位核苷酸。
[0015] 上述試劑或試劑盒中，所述檢測病毒性出血性敗血癥病毒指紋序列的物質(zhì)可包括 病毒性出血性敗血癥病毒指紋序列的測序引物和/或擴(kuò)增病毒性出血性敗血癥病毒指紋 序列的引物對。
[0016] 上述試劑或試劑盒中，所述測序引物可為名稱為VHSV-S的序列表中SEQIDNo. 8 所示的單鏈DNA;所述擴(kuò)增病毒性出血性敗血癥病毒指紋序列的引物對可為名稱為VHSV-P 的由序列表中SEQIDNo. 6所示的單鏈DNA和SEQIDNo. 7所示的單鏈DNA組成的引物對。
[0017] 上述試劑或試劑盒中，所述SEQIDNo. 6所示的單鏈DNA或SEQIDNo. 7所示的 單鏈DNA可用生物素標(biāo)記。
[0018] 在本發(fā)明的一個實施例中，SEQIDNo. 7所示的單鏈DNA的5'端有生物素標(biāo)記。
[0019] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了基于焦磷酸測序的病毒性出血性敗血癥病 毒檢測試劑或試劑盒的制備方法。
[0020] 本發(fā)明所提供的基于焦磷酸測序的病毒性出血性敗血癥病毒檢測試劑或試劑盒 的制備方法中，所述基于焦磷酸測序的病毒性出血性敗血癥病毒檢測試劑或試劑盒為上文 所述基于焦磷酸測序的病毒性出血性敗血癥病毒檢測試劑或試劑盒；所述基于焦磷酸測序 的病毒性出血性敗血癥病毒檢測試劑或試劑盒的制備方法，包括將所述測序引物和/或所 述擴(kuò)增病毒性出血性敗血癥病毒指紋序列的引物對的兩條單鏈DNA獨立包裝的步驟。
[0021] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了檢測病毒性出血性敗血癥病毒指紋序列的 物質(zhì)。
[0022] 本發(fā)明所提供的檢測病毒性出血性敗血癥病毒指紋序列的物質(zhì)，為上述應(yīng)用中或 上述試劑或試劑盒中所述檢測病毒性出血性敗血癥病毒指紋序列的物質(zhì)。
[0023] 上述檢測病毒性出血性敗血癥病毒指紋序列的物質(zhì)，可包括下述P1和/或P2 :
[0024] P1、所述病毒性出血性敗血癥病毒指紋序列的測序引物；
[0025]P2、所述擴(kuò)增病毒性出血性敗血癥病毒指紋序列的引物對。
[0026] 上述檢測病毒性出血性敗血癥病毒指紋序列的物質(zhì)中，所述測序引物可為名稱為 VHSV-S的序列表中SEQIDNo. 8所示的單鏈DNA;所述擴(kuò)增病毒性出血性敗血癥病毒指紋 序列的引物對可為名稱為VHSV-P的由序列表中SEQIDNo. 6所示的單鏈DNA和SEQID No. 7所示的單鏈DNA組成的引物對。
[0027] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了病毒性出血性敗血癥病毒的檢測方法1。
[0028] 本發(fā)明所提供的病毒性出血性敗血癥病毒的檢測方法1，包括下述H1)和H2)的步 驟：
[0029] H1)以待測生物樣品的核酸（RNA或DNA)為模板，選用58°C的退火溫度，用所述 VHSV-P進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物；
[0030] H2)檢測步驟HI)得到的PCR產(chǎn)物的大小，如果所述PCR產(chǎn)物中含有205bp的DNA 片段，所述待測樣品含有病毒性出血性敗血癥病毒或候選含有病毒性出血性敗血癥病毒； 如果所述PCR產(chǎn)物中不含205bp的DNA片段，所述待測樣品不含病毒性出血性敗血癥病毒 或候選不含病毒性出血性敗血癥病毒。
[0031] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了病毒性出血性敗血癥病毒的檢測方法2。
[0032] 本發(fā)明所提供的病毒性出血性敗血癥病毒的檢測方法2,包括下述H3)和H4)的步 驟：
[0033]H3)以待測生物樣品的核酸（RNA或DNA)為模板，選用58°C的退火溫度，用所述 VHSV-P進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物；
[0034]H4)檢測步驟H3)得到的PCR產(chǎn)物，如果所述PCR產(chǎn)物中含有所述病毒性出血性敗 血癥病毒指紋序列，所述待測樣品含有病毒性出血性敗血癥病毒或候選含有病毒性出血性 敗血癥病毒；如果所述PCR產(chǎn)物中不含所述病毒性出血性敗血癥病毒指紋序列，所述待測 樣品不含病毒性出血性敗血癥病毒或候選不含病毒性出血性敗血癥病毒。
[0035] 上述病毒性出血性敗血癥病毒的檢測方法2中，所述檢測步驟H3)得到的PCR產(chǎn) 物為以所述VHSV-S為測序引物進(jìn)行焦磷酸測序。
[0036] 上文中，所述檢測病毒性出血性敗血癥病毒指紋序列的物質(zhì)可只由所述VHSV-S 和所述VHSV-P組成，也可只由所述VHSV-P組成，也可只由所述VHSV-S組成。
[0037] 上文中，所述檢測病毒性出血性敗血癥病毒指紋序列的物質(zhì)，還可包括檢測所述 病毒性出血性敗血癥病毒指紋序列所需要的其他試劑和/或儀器，如通過焦磷酸測序檢測 所述病毒性出血性敗血癥病毒指紋序列所需的試劑和儀器。
[0038] 具體來說，進(jìn)行焦磷酸測序所需要的其它試劑和儀器可為5XPCRbuffer和/或 Taq熱啟動酶和/或變性緩沖液（denatureationbuffer)和/或沖洗緩沖液（washing buffer)和/或鏈霉親和素包被的磁珠和/或真空吸附栗（vacuumpreptool)和/或PCR 儀和/或PYROMARKID儀器。
[0039] 其中，所述5XPCR buffer和所述Taq熱啟動酶均可為寶生物工程（大連）有限 公司產(chǎn)品，貨號為DRR019A);
[0040] 所述鏈霉親和素包被的磁珠可為北京思爾成生物技術(shù)有限公司的貨號為142-03 的Dynabeacfs?M_280Tosylactivated〇
[0041] 所述真空吸附栗（vacuumpreptool)可為德國QIAGEN產(chǎn)品。
[0042] 所述變性緩沖液（denatureationbuffer)可為為德國QIAGEN產(chǎn)品，貨號為 19083。
[0043] 所述沖洗緩沖液（washingbuffer)可為德國QIAGEN產(chǎn)品，貨號為19086。
[0044] 上述檢測病毒性出血性敗血癥病毒指紋序列的物質(zhì)均可獨立包裝。
[0045] 實驗證明，基于本發(fā)明的病毒性出血性敗血癥病毒（VHSV)指紋序列，可利用本發(fā) 明的檢測病毒性出血性敗血癥病毒（VHSV)指紋序列的物質(zhì)通過焦磷酸測序法對病毒性出 血性敗血癥病毒進(jìn)行鑒定，其中VHSV-P可擴(kuò)增出含有VHSV指紋序列的DNA片段，VHSV-S可 通過焦磷酸測序法測定VHSV指紋序列的序列；本發(fā)明的VHSV-P和VHSV-S可特異識別病毒 性出血性敗血癥病毒的核酸序列；本發(fā)明的VHSV-P具有較高的靈敏度，可識別濃度為1拷 貝/yL的病毒性出血性敗血癥病毒。依賴于本發(fā)明的VHSV指紋序列及VHSV-P與VHSV-S 的鑒定VHSV的焦磷酸測序法與普通PCR鑒定VHSV的結(jié)果是一致的，并可避免普通PCR鑒定VHSV時的假陽性的問題；常規(guī)的DNA測序技術(shù)對大片段的DNA進(jìn)行序列測定速度慢、消耗 大，更不易于進(jìn)行大規(guī)模樣本的檢測，而依賴于本發(fā)明的VHSV-P與VHSV-S的鑒定VHSV的 焦磷酸測序法則可克服這一缺點，可快速檢測大規(guī)模樣本，在4小時內(nèi)即可完成檢測過程。 實驗證明，與普通PCR鑒定VHSV相比，依賴于本發(fā)明的VHSV指紋序列及VHSV-P與VHSV-S 的鑒定VHSV的焦磷酸測序法具有自動化程度高、準(zhǔn)確性高、靈敏度高、可靠性好、重復(fù)性 好、穩(wěn)定性好、操作簡便、耗時短、高通量、成本低的特點。
【附圖說明】
[0046] 圖1為PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，泳道M為DL2000Marker;泳道1為 用SVCV-P以SVCV的RNA為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖；泳道2為用VHSV-P以VH