專利名稱：植物與微生物聯(lián)合修復油污污染濕地的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種植物與微生物聯(lián)合修復油污污染濕地的方法。
背景技術：
石油的大規(guī)模開采、冶煉、運輸、使用和處理過程中，污染、遺漏、井噴、輸油管道泄 漏等事故頻發(fā)，導致嚴重的土壤污染[文獻1 劉國良，蘇幼明等.石油污染土壤生物修復 研究新進展[J].化學與生物工程，2008，25(1) :1-4]。石油烴進入土壤后，會破壞土壤結(jié) 構(gòu)，分散土粒，使土壤透水性降低，其富含的反應基能與無機氮、磷結(jié)合并限制硝化作用和 脫磷酸作用，從而使土壤有效氮、磷的含量減少。其中的多環(huán)芳烴等，因具有“三致”效應和 通過食物鏈在生物體內(nèi)富集[文獻2 曾憲軍，劉登魁.微生物修復受石油污染土壤的研究 進展[J].湖南農(nóng)業(yè)科學2006，(2) :36-38，39]。對生態(tài)環(huán)境、食品安全和人身健康構(gòu)成嚴 重威脅，成為困擾環(huán)境領域重要的社會與環(huán)境問題。有關土壤恢復技術的發(fā)展。在80年代以前，常采用熱處理法和化學浸出法進行 治理，但熱處理法代價太昂貴很難實施，化學浸出法采用化學溶劑帶來二次污染問題。80 年代后期，生物修復方式因其經(jīng)濟、有效并對環(huán)境破壞性小等諸多優(yōu)點，近年來發(fā)展尤為迅 猛。生物修復是依靠植物、微生物的吸收和分解氧化作用經(jīng)細胞的分解同化，使有機物轉(zhuǎn)變 為細胞的組成部分或者變?yōu)镠2O和CO2排出體外，從而實現(xiàn)對有機污染的修復。分為原位生 物修復和異位生物修復兩種。在已被石油污染的自然區(qū)域內(nèi)，由于微生物存在的廣泛性會通過自然馴化作用 而產(chǎn)生一定數(shù)量的嗜油微生物[文獻3 =Whyte L. G. Assessment of the biodegradation potential ofpsychrotrophicmicr oorganism[J]. CanadianjournalofMicrobiology, 1996,42(2) :99-106]。能氧化石油烴及其化合物的微生物菌種在自然界分布廣泛。少量烴 類進入土壤時，不但不會影響土壤的通氣性，同時還作為土壤有機質(zhì)促進土壤微生物活性， 有利于污染物的降解。但進入土壤的油濃度過高時，土壤孔隙就會被堵塞，影響通氣性，對 微生物造成不利影響，而且大量土壤結(jié)構(gòu)的活性表面會被油類包裹，使微生物失去良好的 活動場所，微生物的活性受到抑制，其降解能力下降[文獻2 曾憲軍，劉登魁.微生物修復 受石油污染土壤的研究進展[J].湖南農(nóng)業(yè)科學2006，(2) :36-38，39]。植物是一個有效的土壤污染處理系統(tǒng)，主要通過直接吸收石油污染物、釋放分泌 物和酶、刺激根區(qū)微生物的活性并強化生物轉(zhuǎn)化作用。植物促進有機污染物的降解一方面 是由于根際作用增加了微生物降解菌的數(shù)量，另一方面是因為植物分泌有機物為微生物共 代謝提供了基質(zhì)底物。微生物的活動也促進了根系分泌物的釋放。另外，植物還可為微生 物提供生存場所和可轉(zhuǎn)移的氧氣，使根區(qū)的好氧轉(zhuǎn)化作用得以正常進行。不同植物由于不 同的根特性，具有不同的修復效果。有研究表明，植物根系分泌物刺激了細菌的轉(zhuǎn)化作用， 在根區(qū)形成了有機碳，根細胞的死亡也增加了土壤有機碳，這些有機碳的增加可阻止石油 污染物向地下水轉(zhuǎn)移，也可增強微生物對石油污染物的礦化作用。已報道的各種有機污染 物的修復研究表明，草本植物和豆科植物(如紫花苜蓿)較其它植物在污染物根際修復中可能具有更大的應用潛力。污染土壤植物根際微生態(tài)環(huán)境對微生物活性具有誘導作用，有 利于石油烴的降解和污染土層的生物修復。大草原植物與其內(nèi)生微生物聯(lián)合對石油烴的 降解活性研究，其中黑麥草增加了內(nèi)生寄生微生物系統(tǒng)對根際土壤中烷烴的降解率減少了 根際系統(tǒng)對根際土壤中PAH的降解。表明，生長在石油污染土壤中的不同植物種屬特性不 同，不同種分布的微生物種群，能影響植物對烴類的降解[文獻4 :Lori A. Phillips, James J. Germida et al. Hydrocarbon degradation potentialand activity of endophytic bacteriaassociated with prairie plants[J]. Soil Biology&Biochemistry,2008,40 3054-3064]。趙愛芬等在石油污染的水稻田中分離出的微生物Bacillussp，僅在有水稻根 分泌物的情況下才能在石油的殘留物中生長，表明水稻根分泌物促進了特定微生物消除石 油殘留物[文獻5 趙愛芬，趙雪，常學禮.植物對污染土壤修復作用的研究進展[J]. 土壤 通報，2000，31(1) :43-46]。利用生物修復污染土壤是一種安全，環(huán)境友好型的土壤治理方法。該修復技術不 僅能修復被石油污染的土壤，而且對更多種有毒有害污染的土壤修復有效。已被事實證明， 生物修復污染土壤是一項實用性和有效性很強的技術。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種植物與微生物聯(lián)合修復油污污染濕地的方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案為一種植物與微生物聯(lián)合修復油污污染濕地的方法，其特征在于該方法的具體步驟 為a.采集待修復的受油污污染濕地的土壤，用含有所受的油污的無機鹽培養(yǎng)基進行 土著嗜油菌的篩選，并擴大化培養(yǎng)篩選土著嗜油菌，將其以尿素濃度為40g/L，過磷酸鈣濃 度為15g/L的營養(yǎng)底物，制作成0D_ ^ 1. 5的活性菌制劑；b.在油污污染的濕地土壤中種植薦草幼苗或薦草種子，種植密度為2500 5000 株/m2;待幼苗生長旺盛時期，將步驟a所得的活性菌制劑按質(zhì)量比為100 1的比例加入 到種植有薦草幼苗的根系土壤中，待開花期、成熟期結(jié)束后，在嗜油菌群與植物根系的共同 作用下，修復油污污染的濕地。上述的受油污污染為受汽油、柴油、重油、原油或廢棄油污排放帶來的油類有機 物污染。上述的受油污污染的土壤中油污的濃度為1000 20000mg/kg。上述的土著嗜油菌的篩選為在100ml含有100mg/L油污濃度的無機鹽培養(yǎng)基中 培養(yǎng)IOg受油污污染的土壤，每天取樣涂油污平板、分離菌種；再將該菌種加入到含有更高 油污濃度的無機鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分離菌種，如此反復至最終含油污的濃度為8460mg/L，篩 選出最終菌種；將最終篩選得到的菌種接種于富集培養(yǎng)基中，置于37°C、100 150r/min的 搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離心收集菌體；重新懸浮于滅菌營養(yǎng)液中，制成0D_ ^ 1. 5的活性 菌制劑。上述的含有所受的油污的無機鹽培養(yǎng)基為K2HP04lg，KH2PO4Ig, NaCl 0. 5g, NH4 (SO4) 20. 5g，MgSO4O. 2g，KNO3O. 2g，CaCl2O. 02g, NaCl 0. 5g，F(xiàn)eCl3 痕量，微生素母液 0. lml, 8. 46 84. 6g 油污，蒸溜水 1000ml, pH 7. 5。
上述的富集培養(yǎng)基為蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，氯化鈉5g/L，油污42. 3g/L，蒸 餾水 1000ml/L, pH 7. 5，上述的菌制劑營養(yǎng)底物為尿素40g/L，過磷酸鈣15g/L，蒸餾水1000ml/L，pH 7. 5。在石油烴污染土壤上種植薦草，薦草的生長及其根際微生物的活動以及分泌物和 酶的作用，加入土壤的嗜油菌對石油烴有良好的降解效果，薦草的能夠促進嗜油菌對土壤 中石油烴污染物的降解，因此通過種植薦草可降解土壤中過量的石油烴，從而達到清除土 壤中石油烴污染的目的，可以成功避免二次污染。本發(fā)明所采用的薦草(Scirpus triqueter L.)多年生水生挺水草本植物，生于河 邊、溪塘邊、沼澤地及低洼潮濕處，具有較好的觀賞價值。植物分類學特征如下具長的匍匐 根狀莖。稈散生，粗壯，高20 100cm，三棱形，基部具2 3個葉鞘，鞘膜質(zhì)，最上一個鞘頂 具葉片。葉片扁平，長1. 3 5. 5cm,寬1. 5 2mm。苞片1枚為稈的延長，三棱形，長1. 5 7cm,側(cè)枝聚傘形花序假側(cè)生，有1 8個輻射枝，輻射枝三棱形，棱上粗糙，長達5cm，每輻射 枝頂有1 g個簇生的小穗；小穗卵形或長圓形，長6 12mm，3 7mm，密生多數(shù)花，鱗片 長圓形、橢圓形或?qū)捖研?，長3 4mm，膜質(zhì)，黃棕色；下位剛毛3 5條，與小堅果略等長， 有倒刺；雄蕊3 ；花柱短，柱頭2。小堅果倒卵形，平凸狀，長2 3mm，成熟時褐色，具光澤。 花果期6 9月。繁殖與栽培有性繁殖即種子繁殖。3 4月份在室內(nèi)播種，用盆裝入培養(yǎng)土并整 平壓實，后將催好芽的種子撒播在上面，然后灑上一層細紗或土覆蓋種子，再將播好種的盆 浸入水中。保持室溫20 25°C，20天左右即可發(fā)芽生根。無性繁殖在清明節(jié)前后，把越 冬苗從田或盆中挖出，把土抖掉，用枝剪或快刀將地下莖切成若干塊叢，每叢8 12個莖 芽，進行栽種。露地栽培，選擇水景區(qū)適合的位置，在地面上挖穴栽植，株行距30cm左右，如 肥沃地(池)，當年即可旺盛生長連成片。盆栽，選用無泄漏地水盆，每盆栽8株左右，保持 25°C左右溫度及淺水(1 3cm) 15天左右即可發(fā)芽。在生長發(fā)育季節(jié)時，應及時清除田中、 盆中雜草，初期水淺，中期深水，后期淺水，以促使地下莖越冬芽地形成，提高來年的繁殖系 數(shù)。生長期內(nèi)需施1 2次追肥，冬季要清除枯葉。本發(fā)明通過種植石油烴修復植物薦草與嗜油菌聯(lián)合作用來修復石油烴污染土壤。 該方法與傳統(tǒng)土壤治理方法相比，具有投資少、工程量小、技術要求不高等優(yōu)點，無二次污 染。修復進程不僅不會破壞土壤生態(tài)環(huán)境，還有助于改善因石油烴污染而引起的土壤退化 和生產(chǎn)力下降，恢復并提高其生物多樣性。另外，薦草挺拔直立，色澤光雅潔凈，主要用于水 面綠化或岸邊、池旁點綴，較為美觀，也可盆栽庭院擺放或沉入小水景中作觀賞用。全草入 藥，主治食積氣滯，呃逆飽脹。莖可織席，編草鞋，又可用于造紙。具有良好的生態(tài)效益。


圖1薦草與土著嗜油菌群降解后剩余柴油含量圖2薦草與土著嗜油菌群降解柴油的效率圖3薦草與土著嗜油菌群降解柴油各組分情況
具體實施例方式供試柴油供試柴油為零號柴油上海市寶山區(qū)中石化明和加油站購買。實施例子薦草與土著嗜油菌群的除油戶外試驗本實驗于2009年8月進行。實驗地點在上海大學環(huán)境與化學實驗樓五樓露天陽 臺，該研究所處上海市寶山區(qū)，屬濕帶半濕大陸性季風氣候，年降水量在500 600左右。 試驗用原始石油污染土壤取自黃浦江-長江口濕地土壤，并從中篩取出本實驗所采用的三 種嗜油菌株。清潔土壤取自上海大學東區(qū)花壇，過2mm篩后，按沙土比2 3均勻混合，并 配置成不同柴油濃度梯度的土壤。配置成5個濃度梯度，分別為1000mg/kg，5000mg/kg， 10000mg/kg, 15000mg/kg，20000mg/kg。實驗共設三個處理，分別為油污土(空白組)、油 污土接種菌(微生物組)、油污土接種菌種入藤草(實驗組)。接種菌懸液為將嗜油菌 在30°C下培養(yǎng)至對數(shù)期，離心后收集菌體，將其懸浮于尿素濃度為40g/L，過磷酸鈣濃度為 15g/L的營養(yǎng)液中，調(diào)節(jié)吸光度(OD66tl)為1.5，菌懸液為三種菌株的1 1 1混合液。每 千克土壤中營養(yǎng)菌懸液的加入量為IOml。根據(jù)土壤水分豐缺狀況，不定期澆水，使土壤飽和 含水。澆入菌液時利用小鐵鏟松動表土，松土時不要傷到薦草的根，從而保證菌液的均勻分 布與土壤中氧氣充足，利于薦草和微生物的生長繁殖。實驗共歷時60天，在實驗過程中間歇采取土樣測定其中柴油含量與組分發(fā)生的 變化。實驗結(jié)果如下1)不同處理濃度下嗜油菌群對柴油的降解效率在不同污染物濃度處理下，薦草對污染物顯示出了較強的耐受性，無表觀毒害特 征，植株均生長良好。從圖1各組樣品的剩余殘油量可以看出，嗜油菌群使土壤中柴油有較 大的降解效果，在薦草與嗜油菌的共同作用下，使土壤中殘油量進一步的減少。如圖2所示 各組樣品的降解率，在各種污染物濃度下，薦草與嗜油菌的共同作用使得降解率有了更大 的提高。污染土壤植物根際微生態(tài)環(huán)境對微生物活性具有誘導作用，有利于石油烴的降解 和污染土層的生物修復。嗜油菌對柴油的降解率達到12. 6 55.0%，薦草嗜油菌共同作用 下，柴油降解率達到13. 6 61. %。在低濃度柴油的土壤中，由于柴油揮發(fā)性與檢測分析 域值的影響，降解率出現(xiàn)峰值。而現(xiàn)實是，隨著土壤中柴油濃度的增大，在薦草與嗜油菌的 共同作用下柴油的降解率提高。2)薦草聯(lián)合嗜油菌作用下對柴油組分的降解效果剩余殘油經(jīng)氣相色譜分析發(fā)現(xiàn)(如圖3)，嗜油菌群降解作用下，柴油組分的相對 含量并未發(fā)生明顯的變化，正構(gòu)烷烴各組分的峰值仍在C19左右，而在植物薦草與嗜油菌的 聯(lián)合作用下，正構(gòu)烷烴組分各組分的相對含量發(fā)生了明顯的變化，從C17 C24的正構(gòu)烷烴組 分均有了很大程度的降解。
權(quán)利要求
一種植物與微生物聯(lián)合修復油污污染濕地的方法，其特征在于該方法的具體步驟為a.采集待修復的受油污污染濕地的土壤，用含有所受的油污的無機鹽培養(yǎng)基進行土著嗜油菌的篩選，并擴大化培養(yǎng)篩選土著嗜油菌，將其以尿素濃度為40g/L，過磷酸鈣濃度為15g/L的營養(yǎng)底物，制作成OD600≈1.5的活性菌制劑；b.在油污污染的濕地土壤中種植藨草幼苗或藨草種子，種植密度為2500～5000株/m2；待幼苗生長旺盛時期，將步驟a所得的活性菌制劑按質(zhì)量比為100∶1的比例加入到種植有藨草幼苗的根系土壤中，待開花期、成熟期結(jié)束后，在嗜油菌群與植物根系的共同作用下，修復油污污染的濕地。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物與微生物聯(lián)合修復油污污染濕地的方法，其特征在于所 述的受油污污染為受汽油、柴油、重油、原油或廢棄油污排放帶來的油類有機物污染。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物與微生物聯(lián)合修復油污污染濕地的方法，其特征在于所 述的受油污污染的土壤中油污的濃度為1000 20000mg/kg。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物與微生物聯(lián)合修復油污污染濕地的方法，其特征在于所 述的土著嗜油菌的篩選為在IOOml含有100mg/L油污濃度的無機鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)IOg受 油污污染的土壤，每天取樣涂油污平板、分離菌種；再將該菌種加入到含有更高油污濃度的 無機鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分離菌種，如此反復至最終含油污的濃度為8460mg/L，篩選出最終菌 種；將最終篩選得到的菌種接種于富集培養(yǎng)基中，置于37°C、100 150r/min的搖床培養(yǎng)至 對數(shù)生長期，離心收集菌體；重新懸浮于滅菌營養(yǎng)液中，制成0D_ ^ 1. 5的活性菌制劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求5所述的受油污污染濕地的微生物修復方法，其特征在于所述的含有 所受的油污的無機鹽培養(yǎng)基為K2HP04lg，KH2PO4Ig, NaCl 0. 5g，NH4 (SO4) 20. 5g，MgSO4O. 2g， KNO3O. 2g，CaCl2O. 02g, NaCl 0. 5g，F(xiàn)eCl3 痕量，微生素母液 0. Iml,8.46 - 84. 6g 油污，蒸餾 水 1000ml，pH 7·5。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的受油污污染濕地的微生物修復方法，其特征在于所述的富 集培養(yǎng)基為蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，氯化鈉5g/L，油污42. 3g/L，蒸餾水1000ml/L，pH 7. 5，
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的受油污污染濕地的微生物修復方法，其特征在于所述的菌制 劑營養(yǎng)底物為尿素40g/L，過磷酸鈣15g/L，蒸餾水1000ml/L，pH 7. 5。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種植物與微生物聯(lián)合修復油污污染濕地的方法。該方法具體為采集待修復的受油污污染濕地的土壤，用含有所受的油污的無機鹽培養(yǎng)基進行土著嗜油菌的篩選，并擴大化培養(yǎng)篩選土著嗜油菌，將其以尿素濃度為40g/L，過磷酸鈣濃度為15g/L的營養(yǎng)底物，制作成OD600≈1.5的活性菌制劑；在油污污染的濕地土壤中種植藨草幼苗或藨草種子，種植密度為2500～5000株/m2；待幼苗生長旺盛時期，將步驟a所得的活性菌制劑按質(zhì)量比約為100∶1的比例加入到種植有藨草幼苗的根系土壤中，待開花期、成熟期結(jié)束后，在嗜油菌群與植物根系的共同作用下，修復油污污染的濕地。該方法與傳統(tǒng)土壤治理方法相比，具有投資少、工程量小、技術要求不很高等優(yōu)點，無二次污染。修復進程不僅不會破壞土壤生態(tài)環(huán)境，還有助于改善因石油烴污染而引起的土壤退化和生產(chǎn)力下降，恢復并提高其生物多樣性。
文檔編號B09C1/00GK101954373SQ20101029095
公開日2011年1月26日 申請日期2010年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月21日
發(fā)明者劉曉艷, 張新穎, 曹正楠, 杜靜麗, 王君, 王珍珍, 蘇鵬程, 蔡倩, 鐘成林 申請人:上海大學