本發(fā)明涉及樣本分析領(lǐng)域，具體地，涉及一種同時檢測多種樣本中精胺、亞精胺的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。

背景技術(shù)：

1、世界各國老年人數(shù)量和占比呈上升趨勢。世衛(wèi)組織數(shù)據(jù)表明到2030年，全世界六分之一的人將達(dá)60歲以上。從2020年到2030年，60歲以上人口將從10億人增加到14億人。到2050年，全世界60歲以上人口將翻一番，增至21億人。2020年至2050年期間，預(yù)計80歲以上人數(shù)將增加兩倍，達(dá)到4.26億人。隨著人類壽命的延長和全球老齡化問題的加劇，研究衰老的機制及其潛在干預(yù)措施已經(jīng)成為科學(xué)界的焦點。人類長壽干預(yù)措施的識別和評估已成為該領(lǐng)域的關(guān)鍵目標(biāo)。衰老的生物標(biāo)志物是在現(xiàn)實的時間框架內(nèi)實現(xiàn)這些目標(biāo)的至關(guān)重要的工具。2021年10月20日，美國國立衛(wèi)生研究院(nih)針對人體內(nèi)存在的一種被稱為“衰老細(xì)胞”(senescent)的罕見非分裂細(xì)胞啟動了一項細(xì)胞衰老網(wǎng)絡(luò)(sennet)計劃，將在5年內(nèi)為16家機構(gòu)提供1.25億美元的資助。需要注意的是，目前尚未有任何一種衰老生物標(biāo)志物獲得美國監(jiān)管機構(gòu)批準(zhǔn)用于臨床應(yīng)用，國內(nèi)亦是。

2、發(fā)現(xiàn)精胺和亞精胺兩種晶體250年后，才確定這兩種晶體物質(zhì)的正確化學(xué)構(gòu)成，并命名，開始了多胺的早期研究。2009年，發(fā)表在nature?cell?biology上題為“亞精胺誘導(dǎo)自噬從而延長壽命”的文章引發(fā)了亞精胺抗衰老的轟動。2018年，science發(fā)表綜述“亞精胺在健康與疾病中的作用”。亞精胺不僅存在于精液中，更在人體其他組織和細(xì)胞中廣泛分布。細(xì)胞內(nèi)的亞精胺濃度主要取決于四個因素：精氨酸→腐胺→亞精胺←精胺。精氨酸是細(xì)胞內(nèi)合成亞精胺的主要原料，它在精氨酸酶的催化下生成鳥氨酸和尿素，鳥氨酸接著在鳥氨酸脫羧酶1(odc1)的作用下生成腐胺(此為限速步驟)，腐胺在亞精胺合酶(spds)作用下生成亞精胺。亞精胺也能由精胺降解產(chǎn)生。亞精胺的濃度隨年齡而變化，有研究者分別測量了3周齡、10周齡和26周齡小鼠各組織器官中多胺的濃度，發(fā)現(xiàn)其在胰腺、大腦和子宮中基本維持不變，在腸中隨年齡增長略微降低。為了更多的理解這些能量代謝類、生物胺類、氨基酸等小分子在人體內(nèi)衰老過程中發(fā)揮的不同作用，有必要對這些分子進(jìn)行準(zhǔn)確定量，建立衰老相關(guān)小分子生物標(biāo)志物在人體內(nèi)的代謝譜圖，為臨床多種衰老相關(guān)疾病預(yù)防、治療和科研工作提供技術(shù)性理論依據(jù)。

3、精胺和亞精胺屬于生物胺化合物，這些物質(zhì)缺少發(fā)色基團(tuán)，本身既無紫外吸收又無熒光及電化學(xué)活性，使得常規(guī)分析測定比較困難。目前gb?5009.208-2016的液相色譜法和分光光度計法都須采用衍生化法完成。但是，衍生化常常操作繁瑣復(fù)雜，衍生條件嚴(yán)格，衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定，方法重現(xiàn)性較差。gb?5009.208-2016方法分析檢測時間較長，需要35min，商業(yè)化時間成本較高。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明旨在克服上述缺陷，提供一種高效、精確、同時檢測多種樣本中精胺、亞精胺的方法。

2、本發(fā)明提供的一種同時檢測多種樣本中精胺、亞精胺的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，可用于同時檢測血漿、全血樣本、血清樣本中的精胺和亞精胺，其特征在于：采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行檢測；

3、其中，樣本萃取的蛋白沉淀試劑選自含0.1-0.2％甲酸的溶液；液相色譜的檢測條件為：流動相選自含0.1-0.2％甲酸的溶液。

4、進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的方法，其特征還在于：

5、上述流動相a為含0.1-0.2％甲酸的溶液，流動相b為100％甲醇。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的方法，其特征還在于：

6、采用梯度洗脫的方式。

7、進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的方法，其特征還在于：

8、上述梯度洗脫條件如下：

9、0min流動相組成為98％a+2％b；

10、2.5min流動相組成為98％a+2％b；

11、3.2min流動相組成為10％a+90％b；

12、5.0min流動相組成為10％a+90％b；

13、5.2min流動相組成為98％a+2％b；

14、7.0min流動相組成為98％a+2％b。

15、進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的方法，其特征還在于：

16、采用內(nèi)標(biāo)法，以精胺-d20、亞精胺-d8為內(nèi)標(biāo)。

17、進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的方法，其特征還在于：

18、色譜柱選用2.6-3μm，100×2.1-3mm規(guī)格；

19、流速為0.18ml/min；柱溫為40℃。

20、進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的方法，其特征還在于：

21、質(zhì)譜條件為：

22、選擇電噴霧離子源，正負(fù)離子模式；

23、毛細(xì)管電壓為5.5kv，脫溶劑溫度為550℃。

24、進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的方法，其特征還在于：

25、當(dāng)樣本為血漿或血清時，向樣本中，加入精胺-d20、亞精胺-d8的混合內(nèi)標(biāo)，再加入乙腈進(jìn)行蛋白沉淀，震蕩混勻后30-60秒，12000-14000rpm，0-4℃離心5-10分鐘，吸取上清，得到待測樣本。

26、進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的方法，其特征還在于：

27、當(dāng)樣本為全血樣本時，吸取凍融后的全血和ddh2o混合，加入精胺-d20、亞精胺-d8的混合內(nèi)標(biāo)，再加入乙腈，震蕩混勻后30-60秒，12000-14000rpm，0-4℃離心5-10分鐘，吸取上清和ddh20混合后，得到待測樣本。

28、此外，本發(fā)明還提供了上述方法在同時對血漿、全血樣本、血清樣本中的精胺、亞精胺進(jìn)行定性和定量分析上的應(yīng)用。

29、本發(fā)明的作用和效果：

30、本方法無須衍生化，節(jié)省前處理的成本，方法重現(xiàn)性好，大大降低前處理的實驗成本和實驗誤差；分析時間短、抗基質(zhì)干擾能力強，7min完成一次檢測；精胺和亞精胺濃度范圍為1-500ng/ml和10-5000ng/ml，具有良好的線性相關(guān)性，r均大于0.99，此實驗方法檢出限遠(yuǎn)遠(yuǎn)可以滿足國家標(biāo)準(zhǔn)；在低、中、高三種濃度下，方法cv(n＝6)均小于15％；提供一種快速簡單、靈敏度高，重現(xiàn)性好的生物胺檢測方法，該方法在生物檢測領(lǐng)域有著重要的參考意義。

技術(shù)特征：

1.一種同時檢測多種樣本中精胺、亞精胺的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，可用于同時檢測血漿、全血樣本、血清樣本中的精胺和亞精胺，其特征在于：采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行檢測；

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：

3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：

4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：

5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：

6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：

7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：

8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：

9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：

10.如權(quán)利要求1-9任一所述的方法在同時對血漿、全血樣本、血清樣本中的精胺、亞精胺進(jìn)行定性和定量分析上的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種同時檢測多種樣本中精胺、亞精胺的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，可用于同時檢測血漿、全血樣本、血清樣本中的精胺和亞精胺，其特征在于：采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行檢測；其中，樣本萃取的蛋白沉淀試劑選自含酸的溶液；液相色譜的檢測條件為：流動相選自含酸的溶液。該方案檢測效率高，精度高，靈敏度高，利于大范圍推廣。

技術(shù)研發(fā)人員：馬妍慧,劉毅,沈立松,陳惠,皇甫昱嬋
受保護(hù)的技術(shù)使用者：上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/8