一種免疫磁珠陰性富集法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于癌癥診斷技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種免疫磁珠陰性富集法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]肺癌是目前發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，據(jù)WHO統(tǒng)計，每年全世界估計有130萬人死于肺癌，其中85%為非小細(xì)胞肺癌。肺癌患者的平均生存期約10個月，其5年生存率不足15%。盡管近年來腫瘤分子生物學(xué)研宄的進展及新的化療藥物的應(yīng)用為肺癌的診斷和治療帶來了新的希望，但大部分肺癌患者的生存率并無明顯改善。肺癌的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及對化療藥物的耐藥仍是目前面臨的難題。胸腔積液是肺癌的常見癥狀之一，也是許多患者的首發(fā)表現(xiàn)，但是胸腔積液亦常見于其他非腫瘤性疾病，如結(jié)核、肺炎及心功能不全等。
[0003]目前胸腔積液腫瘤細(xì)胞富集方法常用的梯度密度離心法，但敏感性較低，約為42?67%，容易漏診。目前最新的免疫磁珠技術(shù)主要用于細(xì)胞的分離和純化，包括免疫磁珠陽性捕獲法和陰性富集法，常用于外周血循環(huán)中腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cels,CTC)的富集。但免疫磁珠陽性法富集檢測腫瘤細(xì)胞需要特異性的腫瘤細(xì)胞抗體，不僅成本較高，對于部分不表達特異性抗體或抗原抗體難以結(jié)合的腫瘤細(xì)胞容易漏診，造成假陰性；并且經(jīng)抗體抗原反應(yīng)后，腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性會受到一定影響，從而影響其后續(xù)生物學(xué)特性分析的準(zhǔn)確性。
[0004]因此迫切需要一種敏感性和特異性俱佳的實驗技術(shù)來協(xié)助惡性胸腔積液的診斷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種免疫磁珠陰性富集法及應(yīng)用，旨在解決現(xiàn)有肺癌診斷技術(shù)敏感性和特異性欠佳的問題。
[0006]本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種免疫磁珠陰性富集法，包括以下步驟:
[0007](I)將預(yù)處理后的1ml胸水標(biāo)本和1ml腹水標(biāo)本加入離心管A中，豎直搖勻細(xì)胞后，配平，室溫600g離心3分鐘，棄上清至3ml，再加入2ml I X hCTC緩沖液，搖勻細(xì)胞；
[0008](2)將3ml hCTC非血源性細(xì)胞分離介質(zhì)加入到離心管B，再將離心管A中的細(xì)胞液轉(zhuǎn)移到離心管B中分離介質(zhì)頂層，將離心管B用hCTC緩沖液配平后，在室溫400g離心5分鐘；將離心管B中底層沉積紅細(xì)胞上的所有液體分別轉(zhuǎn)移至離心管C中；
[0009](3)在搖動狀態(tài)下，按每管80 μ I的比例將洗滌后的磁珠緩慢加入離心管C中，再將離心管以35?40°傾斜固定于搖床上，室溫120rpm搖動10分鐘；
[0010](4)將3ml hCTC非血源性細(xì)胞分離介質(zhì)加入離心管D中，再將離心管C中的磁珠懸液加到離心管D中分離介質(zhì)頂層，將離心管D用hCTC緩沖液配平后，在室溫400g離心5分鐘；將離心管D中底層沉積磁珠上的所有液體轉(zhuǎn)移至離心管E中；
[0011](5)將14ml I XhCTC緩沖液加入離心管E中，使用I XhCTC緩沖液配平后，頭尾顛倒混勻，室溫950g離心3分鐘；棄上清至300 μ I，加入1.4ml I XhCTC緩沖液，混勻，將液體轉(zhuǎn)移至離心管F中；
[0012](6)將離心管F置于磁力架上吸附磁珠，兩分鐘后輕輕吹打、旋轉(zhuǎn)液體，三分鐘后將離心管F內(nèi)的液體轉(zhuǎn)移至離心管G中；
[0013](7)將14ml I XhCTC緩沖液加入到離心管G中，將離心管G中液體吹打三次，再用I XhCTC緩沖液配平后，頭尾顛倒混勻，室溫950g離心3分鐘，棄上清；
[0014](8)將離心管G中的細(xì)胞進行計數(shù)、稀釋后，加入100 μ I Cytelligen固定液混勻，將離心管G中液體涂片、干燥后進行檢測。
[0015]優(yōu)選地，在步驟(I)中，所述預(yù)處理為:將采集的1ml胸水標(biāo)本和1ml腹水標(biāo)本分別與Iml細(xì)胞保存液混合搖勻，4°C避光保存，且標(biāo)本待用時間不超過24小時。
[0016]優(yōu)選地，在步驟⑵中，所述將離心管A中的細(xì)胞液轉(zhuǎn)移到離心管B中分離介質(zhì)頂層具體為:將管A中的細(xì)胞液沿管壁液面處位置緩慢加到離心管B中分離介質(zhì)頂層。
[0017]優(yōu)選地，在步驟(6)中，所述輕輕吹打、旋轉(zhuǎn)液體具體為:用Iml槍頭沿磁珠對側(cè)管壁輕輕吹打液體I?2次，并旋轉(zhuǎn)離心管15°。
[0018]優(yōu)選地，在步驟(8)中，所述計數(shù)、稀釋具體為:
[0019]將100 μ I細(xì)胞液混勻后，取4 μ I細(xì)胞液于4 μ I 2 %冰醋酸中，混勻，將以上8 μ I液體于血細(xì)胞計數(shù)板上觀察四個大方格中的細(xì)胞總數(shù)；
[0020]當(dāng)四個大方格中的細(xì)胞數(shù)多于100個時，按比例將細(xì)胞液稀釋至四個大方格中的細(xì)胞總數(shù)為100個以內(nèi)。
[0021]優(yōu)選地，在步驟(8)中，所述干燥具體為:將標(biāo)本放置30?32°C干燥箱過夜，干燥箱全程不開鼓風(fēng)，打開頂置通風(fēng)口，第二天關(guān)閉干燥箱溫度后將標(biāo)本繼續(xù)靜置于干燥箱中30分鐘涼至室溫，立即進行后續(xù)檢測。
[0022]優(yōu)選地，在步驟(8)中，所述檢測包括FISH檢測。
[0023]有優(yōu)選地，所述離心管A?G的規(guī)格分別為50ml、50ml、50ml、50ml、15ml、2ml、15ml o
[0024]本發(fā)明進一步提供了上述免疫磁珠陰性富集法在肺癌診療中的應(yīng)用。
[0025]優(yōu)選地，所述應(yīng)用具體包括:
[0026](I)對捕獲合并惡性胸腔積液的NSCLC患者治療前、治療中、治療后的胸水腫瘤細(xì)胞進行腫瘤細(xì)胞計數(shù)；
[0027](2)對捕獲的腫瘤細(xì)胞采用免疫熒光及流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面CD133、CK表達、倍體分析、端粒酶活性檢測、腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力；
[0028](3)收集入組NSCLC患者臨床資料，將腫瘤細(xì)胞計數(shù)、⑶133、CK表達、倍體分析、端粒酶活性、腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力與肺癌患者耐藥、療效及預(yù)后分析。
[0029]免疫磁珠陰性富集法起初用于外周血循環(huán)中腫瘤細(xì)胞的富集及檢測，其敏感性及特異性均較高，原理是通過免疫磁珠技術(shù)去除無關(guān)細(xì)胞而使目標(biāo)細(xì)胞得以純化，從而提高外周血循環(huán)中腫瘤細(xì)胞的檢測率；并且陰性法富集后的腫瘤細(xì)胞純度較高，且沒有被抗體觸及而處于自然狀態(tài)，從而可進行一系列后續(xù)分析測定。本發(fā)明克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，首次將免疫磁珠陰性富集法用于惡性胸腔積液中腫瘤細(xì)胞的富集，提高了腫瘤細(xì)胞檢出的敏感性，與此同時，與外周血陰性富集法不同之處在于，由于正常外周血中不存在上皮來源的細(xì)胞，故上皮來源的腫瘤細(xì)胞分離及鑒定較為容易，而胸腔積液中因有大量的上皮和間皮細(xì)胞，大大影響了上皮來源腫瘤細(xì)胞的檢出及鑒定，本發(fā)明免疫磁珠陰性富集法對此做了很大的改進，并聯(lián)合FISH檢測成功解決了上述難題，為肺癌診療提供極大幫助。本發(fā)明去除了胸腔積液中白細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞端粒酶活性檢測的影響，提高了胸腔積液中端粒酶活性對肺癌診療的敏感性、特異性及應(yīng)用價值。
【附圖說明】
[0030]圖1是本發(fā)明實施例中惡性胸腔積液腫瘤細(xì)胞瑞姬染色涂片；其中，圖①，②為密度梯度離心法富集后瑞姬染色細(xì)胞涂片(其中雜細(xì)胞較多，腫瘤細(xì)胞易聚集成團)；圖③，④為免疫磁珠陰性富集法富集后瑞姬染色細(xì)胞涂片)；
[0031]圖2是本發(fā)明實施例中惡性胸腔積液腫瘤細(xì)胞免疫磁珠陰性富集后7、8號染色體著絲粒FISH分析圖；其中，圖①、②、③為二倍體細(xì)胞，圖④、⑤、⑥為超二倍體細(xì)胞；
[0032]圖3是本發(fā)明實施例中經(jīng)免疫磁珠陰性富集法捕獲的惡性胸腔積液腫瘤細(xì)胞(WBC)和 CD 133 細(xì)胞(CSC)。
【具體實施方式】
[0033]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0034]實施例1實驗材料、器材準(zhǔn)備與說明
[0035](I)調(diào)節(jié)離心機的加減速時間，本發(fā)明步驟中所有離心加減速時間均一樣。符合實驗要求的加減速時間為:設(shè)置離心機的離心力450g，從轉(zhuǎn)速O升至450g的時間應(yīng)為40秒，從450g降到O的時間最短應(yīng)為200秒。
[0036](2)測試水平轉(zhuǎn)子低速離心機是否滿足本實驗要求，測試方法:取Iml hCTC分離介質(zhì)至15ml離心管中，將0.5ml外周血與1.5ml Ix hCTC緩沖液混勻后加到Iml hCTC非血源性細(xì)胞分離介質(zhì)頂層，室溫離心5分鐘(550g)，離心后可見液體明顯分層，上層為透明液體，下層為棕紅色沉積紅細(xì)胞。如離心后分層效果差，即該離心機不能滿足本實驗要求。
[0037](3)每隔一周使用溫度計測試干燥箱內(nèi)干片溫度30°C，如干燥箱內(nèi)實測溫度與設(shè)定的30°C不相符，按照儀器使用說明校準(zhǔn)溫度至所需30°C。
[0038](4)