磁珠轉化普魯士藍的禽流感病毒免疫生物傳感器及方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及納米材料科學及電化學生物傳感領域，尤其是一種磁珠轉化普魯士藍 的禽流感病毒免疫生物傳感器及方法。
【背景技術】
[0002] 磁性納米材料作為一種納米材料，不但具有比表面積大、生物相容性好、富含表面 功能基團、表面自由能高等優(yōu)點，廣泛用于高效固定大量生物分子，而且基于其獨特磁性在 磁分離富集和磁熱療等領域備受重視。然而，當前磁珠涉及的應用主要基于磁性，其本身化 學/電化學性質的應用鮮有開拓。
[0003] 生物傳感研究中，信號輸出和放大是決定檢測性能的最關鍵因素之一，當前基于 納米材料優(yōu)異性質而實現信號輸出和放大是研究前沿和應用熱點。當前研究中，磁性材料 常用于在樣品中快速和高效分離目標物，在信號輸出方面應用極少。其它納米材料，如貴金 屬納米顆粒、碳納米管/纖維和半導體量子點等，因具有優(yōu)異表面修飾功能和獨特的光、電、 熱等性質而廣泛用于信號輸出，但前期修飾和功能化過程中涉及大量分離步驟，頻繁使用 離心、超濾和透析等手段，繁瑣而耗時。因此，可快速分離且信號輸出/放大功能豐富的新材 料和新方法可望顯著便利生物傳感器構建與檢測，提升性能。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種磁珠轉化普魯士藍的禽流感病毒免疫生物 傳感器及方法，基于磁珠標記物高效放大信號進行禽流H5N1生物傳感檢測。
[0005] 本發(fā)明采用以下技術方案：
[0006] -、一種磁珠轉化普魯士藍的禽流感病毒免疫生物傳感器：
[0007] 包括由磁珠轉化而成的普魯士藍和三電極系統(tǒng)，三電極系統(tǒng)以飽和甘汞電極為參 比電極，碳電極為對電極，Con A修飾磁珠標記電極為工作電極。
[0008] 二、一種磁珠轉化普魯士藍的禽流感病毒免疫生物傳感器的制備方法：
[0009] 制備獲得作為參比電極的飽和甘汞電極和作為對電極的碳電極，所述Con A修飾 磁珠標記電極和普魯士藍具體制備過程如下：
[0010] 1)處理磁珠水溶液制備獲得Con A修飾磁珠分散液；
[0011] 2)由Con A修飾磁珠分散液處理獲得Con A修飾磁珠標記電極；
[0012] 3)將Con A修飾磁珠標記電極置于鐵氰化鉀和硫酸鉀混合溶液中，采用三電極系 統(tǒng)，Con A修飾磁珠標記電極為工作電極，甘汞電極為參比電極，碳棒為對電極，進行多電位 階越（1.60V，450s; 0V，250s)掃描獲得普魯士藍。
[0013]本發(fā)明將普魯士藍在〇. 1M酸性K2S04溶液中-0.3V~0.5V掃循環(huán)伏安，根據普魯士 藍的氧化或還原峰電流定量樣品中禽流感病毒H5N1的濃度。
[0014]所述步驟1)具體如下：
[0015] 1.1)將磁珠水溶液在工作頻率為40kHz，功率為160W的超聲作用下分散5min，得到 分散均勾的磁珠分散液；
[0016] 1.2)將用于羧基化磁珠的檸檬酸與磁珠分散液混合，靜置于旋轉儀上12h過夜得 到羧基化磁珠分散液，檸檬酸的含量為0. lmmol-0.3mmol每毫克磁珠；
[0017] 1.3)將上述羧基化磁珠分散液依次進行磁性分離、去除上清液，然后將磁珠用磷 酸鹽緩沖液清洗三次，然后分散于15mL MES緩沖液中，使得磁珠的最終濃度約為lmg/mL，4 °(：下保存；
[0018] 1.4)將EDC(2mg，10mM)和NHS(0.35mg，15mM)加入到lmL上述羧基化磁珠的MES分散 液中，常溫下攪拌反應2小時，用磷酸緩沖液(pH 6.0)磁性分離、去除上清液，用磷酸鹽緩沖 液重復清洗三次，得到活化磁珠，分散在lmL磷酸緩沖液中；
[0019] 1.5)取活化磁珠與伴刀豆球蛋白A(Con A)于常溫下反應，用磷酸緩沖液(pH 6.0) 磁性分離、去除上清液，用磷酸鹽緩沖液重復清洗三次，得到Con A修飾磁珠，分散在lmL磷 酸緩沖液中，在冰箱中4°C保存；
[0020] 所述步驟1)具體如下：
[0021] 2.1)將干凈的金磁電極在二硫雙琥珀酰亞胺基丙酸酯(DTSP)的丙酮溶液中浸泡， 丙酮洗3次，然后超純水洗3次，獲得DTSP修飾金磁電極；
[0022] 2.2)在DTSP修飾金磁電極上滴加伴刀豆球蛋白A溶液，常溫下反應，用roS緩沖液 (pH 7.0)清洗，獲得蛋白A修飾金磁電極；
[0023] 2.3)在伴刀豆球蛋白A修飾金磁電極表面滴加禽流感病毒H5N1抗體溶液，常溫下 反應，用PBS緩沖液(pH 7.0)清洗，獲得抗體修飾金磁電極；
[0024] 2.4)在抗體修飾金磁電極表面滴加牛血清白蛋白（BSA)溶液，常溫下反應以封閉 非特異性結合位點，用PBS緩沖液(pH 7.0)清洗，最終獲得傳感電極；
[0025] 2.5)在傳感電極表面滴加禽流感病毒H5N1懸濁液，常溫下培育，用PBS緩沖液清 洗，獲得檢測電極；
[0026] 2.6)取Con A修飾磁珠分散液滴加到檢測電極表面，常溫反應，用roS緩沖液清洗， 獲得Con A修飾磁珠標記電極。
[0027] 所述的干凈的金磁電極采用以下方式清洗:金磁電極依次在砂紙、0.5μπι氧化鋁粉 末和0.05μπι氧化鋁粉末中打磨，打磨后經充分清洗，再依次在超純水、乙醇和超純水中各超 聲5分鐘，配制Prihna溶液滴加5yL于電極表面，保持5分鐘，最后采用大量水進行清洗。
[0028] 所述步驟1.2)中檸檬酸與磁珠分散液的配比為0. lmmol-0.3mmol每毫克磁性納米 料子。
[0029] 所述步驟1.5)中活化磁珠與Con A的質量比為1: 5-1:10，時間為lh，反應時間為 45_90min〇
[0030] 所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0 · 01M-0 · 05M，pH < 6 · 0 ;所述的MES，濃度為0.011_ 0.05M,pH<6.0〇
[0031] 所述步驟2.2)中0了3?濃度為1-5禮，反應時間為4-1811。優(yōu)選的反應時間是1211。 [0032] 所述步驟2.2)中伴刀豆球蛋白A溶液的濃度為0.1-0.5mg mL-1，反應時間為45-90min〇
[0033] 所述步驟2.3)中禽流感病毒H5N1抗體溶液的濃度為0.1 -0.5mg ml/1，反應時間為 45-90min〇
[0034] 所述步驟2.4)中用于封閉的牛血清白蛋白溶液的濃度為5%-10%，反應時間為 45-90min〇
[0035] 所述步驟2.5)中禽流感病毒!15附的濃度為0.0025-0.16說1]，禽流感病毒!15附培育 時間為30_60min。
[0036] 所步驟2.6)中Con A修飾磁珠分散液用量為5-10yL，培育時間為30-60min。
[0037] 所述步驟3)種鐵氰化鉀和硫酸鉀混合溶液中鐵氰化鉀和硫酸鉀的濃度分別為 0.1-5m]\^P0.1M。
[0038] 所述多電位階躍采用以下參數：第一階段，電壓1.60V，時長450s;第二階段電壓 0V，時長250s。
[0039]所述多電位階躍替換為循環(huán)伏安法，循環(huán)伏安法參數為:高電位1.65V，低電位為-〇.3￥，所用溶液?!1<6.0。
[0040]本發(fā)明采用抗體修飾電極捕獲禽流感病毒H5N1，然后標記磁珠;在磁場控制下，采 用電化學方法使磁珠標記物轉化生成普魯士藍;基于生成的普魯士藍的電化學還原峰定量 檢測禽流感病毒。
[0041] 本發(fā)明的有益效果是：
[0042] 采用本發(fā)明的方法可在前期基于磁分離而簡便修飾操作，檢測時通過原位電化學 轉化磁珠生成高電化學活性普魯士藍而顯著放大信號，實現對目標物的便利和靈敏檢測。
[0043] 本發(fā)明的方法創(chuàng)新了磁性納米料子的新性質，在充分利用磁珠的分離富集功能的 基礎上引入電化學轉化產生電化學活性普魯士藍，獲得電化學信號輸出和放大功能。
[0044]本發(fā)明生物傳感技術可簡便、低成本和靈敏檢測禽流感病毒H5N1，并且在生物檢 測領域應用前景廣闊。
【附圖說明】
[0045] 圖1為本發(fā)明中生物傳感器構建和檢測原理示意圖。
[0046] 圖2為本發(fā)明中制備的Con A修飾磁珠的紅外表征圖。
[0047]圖中a、b和c三條曲線分別為羧基化磁珠 、Con A修飾磁珠和Con A的紅外表征曲 線。
[0048]圖3為本發(fā)明中不同修飾電極的掃描電鏡圖。
[0049] A、B、C分別表示電極表面捕獲禽流感病毒H5N1、標記Con A修飾磁珠和電化學轉化 磁珠標記物的掃描電鏡表征。
[0050] 圖4為本發(fā)明方法中不同禽流感病毒H5N1濃度時生物傳感器的循環(huán)伏安響應曲線 和工作曲線。
【具體實施方式】
[0051] 下面結合附圖及具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。
[0052] 為了使本技術領域的人員更好地理解本發(fā)明技術方案，下面結合附圖和實施方式 對本發(fā)明作進一步的詳細說明。
[0053]本發(fā)明的實施例如下：
[0054] 實施例1
[0055] 將15mL磁珠水溶液置于50mL離心管中，在工作頻率為40kHz，功率為160W的超聲作 用下分散5min，得到分散均勻的磁珠分散液。
[0056]再加入15mL濃度為0.4M的檸檬酸水溶液，超聲30min，常溫條件(25 °C )條件下旋轉 反應20h。依次進行磁性分離、去除上清液，將磁珠用磷酸鹽緩沖液清洗的步驟三次，然后分 散于15mL MES緩沖液中（磁珠的最終濃度約為lmg/mL)，4°C下保存。
[0057] 將EDC( 2mg，10mM)和NHS(0.35mg，15mM)加入到lm