一種整體蛋白質(zhì)定量分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)分子的分析方法，尤其是涉及一種整體蛋白質(zhì)定量分析方法，主要涉及與生物質(zhì)譜相關(guān)的系統(tǒng)生物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]近兩三年來，商業(yè)化的高質(zhì)量分辨、高質(zhì)量測量精度質(zhì)譜儀有了飛躍式發(fā)展，也就是軌道阱質(zhì)譜儀的出現(xiàn)。軌道阱質(zhì)譜儀跟傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀分辨率和精度相當(dāng)；但價(jià)格相對便宜，質(zhì)譜采集速度更快、解離效率更高。該質(zhì)譜儀的相對普及為分子量相對較大的整體蛋白的質(zhì)譜及串級質(zhì)譜分析提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。在整體蛋白定量標(biāo)記方面，基于SILAC的體內(nèi)標(biāo)記和基于TMT的體外標(biāo)記，由于靶向氨基酸的非完全標(biāo)記(如重的賴氨酸或精氨酸在SILAC中的非完全替代)和非靶向氨基酸的非選擇性標(biāo)記(如蘇氨酸的TMT標(biāo)記)，其應(yīng)用范圍受到了比較大的限制。二甲基(同位素，isotopic或同重，isobaric)標(biāo)記由于其試劑易得，標(biāo)記效率高，在多肽定量方面得到了廣泛的研究和應(yīng)用；我國科學(xué)家在這個(gè)定量技術(shù)方面也做出了巨大的貢獻(xiàn)，發(fā)展了多種不同形式的二甲基標(biāo)記；其中中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所張玉奎院士和張麗華研究員課題組發(fā)展的N端同重二甲基標(biāo)記和復(fù)旦大學(xué)楊亢原教授和陸豪杰教授課題組發(fā)展的賴氨酸ε-氨基的胍化保護(hù)組合起來可直接應(yīng)用于蛋白的定量標(biāo)記，有較好的前景。
[0003]在整體蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫新算法和引擎發(fā)展方面，中國專利CN103389335A、CN104359967A、CN104765984A 公布了同位素輪廓指紋比對算法(isotopic envelopefingerprinting, iEF)，直接在原始數(shù)據(jù)上進(jìn)行匹配離子的搜索和蛋白質(zhì)的鑒定。該算法無需對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行“去同位素”預(yù)處理，可以節(jié)省相應(yīng)的時(shí)間；根據(jù)各個(gè)離子中是否有同位素峰缺失和同位素峰相對強(qiáng)度的偏差對理想及非理想實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行很好的區(qū)分，保證蛋白鑒定的可信度；根據(jù)已知重疊離子的同位素峰相對強(qiáng)度關(guān)系對重疊實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行有效的解析?；谠撍惴ㄉ暾埲顺晒Φ亻_發(fā)了整體蛋白數(shù)據(jù)庫搜索引擎ProteinGoggle，在單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白(泛素、肌紅蛋白)及整體蛋白質(zhì)組混合物(組蛋白H4家族翻譯后修飾異構(gòu)體、大腸桿菌)的定性鑒定中，表現(xiàn)出較高的可信度和較好的應(yīng)用前景。在定量分析方面，ProteinGoggle有著它內(nèi)在的和獨(dú)特的潛在優(yōu)勢；一方面基于同位素輪廓及其中每個(gè)同位素的指紋比對可以快速精確地搜索同位素或同重標(biāo)記的定量離子對；另一方面，搜索過程中每個(gè)離子中每個(gè)同位素峰的實(shí)驗(yàn)強(qiáng)度都被記錄和輸出，可以用來直接計(jì)算相對定量比。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種標(biāo)記效率高、無需預(yù)先對部分官能團(tuán)進(jìn)行保護(hù)、準(zhǔn)確度高的整體蛋白質(zhì)定量方法。
[0005]本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):
[0006]—種整體蛋白質(zhì)定量分析方法，包括以下步驟:
[0007](I)將兩組不同生理或病理?xiàng)l件的整體蛋白質(zhì)分別作為控制組與疾病組，并分別對可能存在的一■硫鍵進(jìn)彳丁還原，同時(shí)對疏基進(jìn)彳丁燒基化保護(hù)；
[0008](2)對兩組烷基化的蛋白質(zhì)的氨基酸特定官能團(tuán)進(jìn)行全同重化學(xué)共價(jià)標(biāo)記；
[0009](3)同重標(biāo)記后兩組蛋白質(zhì)按等比例混合進(jìn)行高分辨質(zhì)譜和串級質(zhì)譜分析得到一個(gè)數(shù)據(jù)組；
[0010](4)對數(shù)據(jù)組進(jìn)行定性、定量數(shù)據(jù)庫搜索，得到蛋白質(zhì)的ID及疾病組每一個(gè)蛋白質(zhì)相對于控制組的相對比例，即疾病條件下所有蛋白的上調(diào)或下調(diào)情況，上調(diào)或下調(diào)倍數(shù)最大的蛋白即為與該疾病發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的蛋白。
[0011]優(yōu)選地，步驟(I)中用二硫蘇糖醇對可能存在的二硫鍵進(jìn)行還原，用碘乙酰胺對所有巰基進(jìn)行烷基化保護(hù)。
[0012]優(yōu)選地，步驟(2)中氨基酸特定官能團(tuán)包括賴氨酸ε -氨基及N端氨基，同時(shí)該方法同樣適用于蛋白質(zhì)序列中賴氨酸ε-氨基及N端氨基除外的其他特定官能團(tuán)的全同重化學(xué)共價(jià)標(biāo)記。
[0013]優(yōu)選地，步驟(2)中，一組蛋白質(zhì)中的氨基酸特定官能團(tuán)標(biāo)記為-N(CH2D)2，另一組蛋白質(zhì)中的氨基酸特定官能團(tuán)標(biāo)記為-N(13CH3)2，單個(gè)標(biāo)記后氨基的質(zhì)量差異為0.00584Dao同樣的，本發(fā)明方法同樣適用于蛋白質(zhì)序列中賴氨酸氨基及N端氨基其他全同重化學(xué)共價(jià)標(biāo)記。
[0014]對于標(biāo)記為-N(CH2D)JP -N( 13CH3)2的方法而言，一組蛋白質(zhì)用甲醛和氘代氰基硼氫化鈉標(biāo)記，另一組蛋白質(zhì)用13C標(biāo)記甲醛和氰基硼氫化鈉標(biāo)記；反應(yīng)過程和條件如下:烷基化的蛋白質(zhì)重新溶解在乙酸鈉緩沖溶液后，加入4% (v/v)甲醛溶液；在攪拌條件下加入600mM的新配制的氰基硼氫化鈉溶液，室溫反應(yīng)I小時(shí)后，用4% (v/v)的氨水淬滅。其中，所述的乙酸鈉緩沖溶液為lOOmmol/L，pH為5_6。
[0015]步驟(3)所述的等比例混合指:按照控制組與疾病組的重量、體積或摩爾量以1:1比例進(jìn)行混合。
[0016]步驟(4)中對數(shù)據(jù)組進(jìn)行定性、定量數(shù)據(jù)庫搜索，得到蛋白質(zhì)的ID及疾病組每一個(gè)蛋白質(zhì)相對于控制組的相對比例為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，優(yōu)選使用【背景技術(shù)】中介紹的整體蛋白數(shù)據(jù)庫搜索引擎ProteinGoggle，同時(shí)也可以使用其他數(shù)據(jù)庫。
[0017]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果:
[0018]1、本發(fā)明的解析方法基于所述質(zhì)譜的原始二級質(zhì)譜，通過計(jì)算含標(biāo)記基團(tuán)碎片離子的平均相對強(qiáng)度從而計(jì)算標(biāo)記蛋白在不同生理或病理?xiàng)l件下的相對強(qiáng)度。本發(fā)明的定量方法對整體蛋白質(zhì)序列中賴氨酸ε-氨基及N端氨基的同重標(biāo)記和其高分辨串級質(zhì)譜標(biāo)記碎片離子同位素輪廓指紋比對原位數(shù)據(jù)解析，標(biāo)記效率高，準(zhǔn)確度高，適用于整體蛋白質(zhì)基于高分辨串級質(zhì)譜的定量分析。
[0019]2、本發(fā)明方法僅需對蛋白質(zhì)進(jìn)行二硫鍵還原，和對巰基進(jìn)行