背景技術(shù)：

1、第二次世界大戰(zhàn)后快速的人口增長引發(fā)了對糧食安全(地球養(yǎng)活越來越多人口的能力極限)的擔(dān)憂。馬爾薩斯主義者預(yù)言可能在20世紀(jì)90年代發(fā)生饑荒。這沒有發(fā)生，原因是綠色革命，農(nóng)業(yè)效率和產(chǎn)量的意外增長。這其中一個(gè)因素是氮肥的發(fā)展，而氮肥又是來自軍需品技術(shù)的副產(chǎn)品?；鹚幑S變成了肥料工廠(化劍為犁)。

2、合成化學(xué)肥料使植物生長。然而，經(jīng)過七十年的使用，出現(xiàn)了意想不到的后果，例如：1)土壤肥力下降和作物產(chǎn)量停滯，2)溫室氣體增加，以及3)地下水的污染導(dǎo)致野生藻類暴增。合成肥料的生產(chǎn)需要燃燒甲烷；據(jù)估計(jì)，12％的溫室氣體源自現(xiàn)代農(nóng)業(yè)，其中大部分來自化學(xué)肥料的使用。

3、在自然界中，植物的生長依賴于植物與土壤微生物之間的共生關(guān)系。植物從其根部滲出糖類(碳化合物)，其供給土壤中存在的微生物，尤其是細(xì)菌。反過來，土壤微生物處理植物生長所需的營養(yǎng)物。土壤細(xì)菌將大氣中的氮轉(zhuǎn)化為可以被植物根部吸收的銨化合物。這個(gè)自然過程被稱為固氮，并且主要是與根部(這個(gè)區(qū)域被稱為“根際”)緊密接觸的細(xì)菌的作用，而不是植物的工作。根際的肥沃土壤每克具有多達(dá)100億個(gè)細(xì)菌。土壤中的微生物組成和活性定義了“肥力”。作物輪作是用豆科植物向土壤中添加氮，但固定氮的是豆科植物根瘤中的細(xì)菌。其他細(xì)菌溶解土壤結(jié)合的磷。

4、化學(xué)肥料繞過了自然過程。隨著時(shí)間的推移，微生物活動(dòng)(肥力)以及土壤的氮和碳的水平下降?；瘜W(xué)肥料以可以被根部直接吸收的形式向土壤中添加大量養(yǎng)分，氮、磷和鉀。然而，植物吸收僅30％的通過化學(xué)施肥而施加的氮。其余的大部分進(jìn)入溶液，最終到達(dá)地下水。眾所周知，肥料向水體中的添加例如已知是通過農(nóng)田土壤徑流進(jìn)入池塘和湖泊而發(fā)生的，促進(jìn)野生藻類的生長，從而導(dǎo)致有害藻類暴增。此外，肥料中的一些氮被轉(zhuǎn)化為一氧化二氮(強(qiáng)效的溫室氣體)。在全球范圍內(nèi)，農(nóng)業(yè)占大氣中排放的一氧化二氮的75％。

5、堆肥的有機(jī)物質(zhì)例如糞肥可以施加至土壤，以提供氮以及細(xì)菌和碳，這喂養(yǎng)了微生物。然而，堆肥的使用由于體積大而不方便，并且難以大規(guī)模應(yīng)用。加工糞肥以制造有機(jī)肥料是工業(yè)過程，并且在運(yùn)輸時(shí)存在能源成本。

6、生物刺激素提供了另一種促進(jìn)植物生長的方式。定義在2018年美國農(nóng)業(yè)法案中，植物生物刺激素(plant?biostimulant，pbs)是促進(jìn)自然過程的復(fù)合物或有機(jī)體。大量研究表明，活的微藻特別是普通小球藻(chlorella?vulgaris)通過葉面和土壤二者施加是有效的生物刺激素。此外，微藻對土壤微生物的刺激作用是再生性的：施加微藻增加了有機(jī)質(zhì)、細(xì)菌量和土壤呼吸(細(xì)菌活性的量度)。換言之，施加微藻使土壤肥力得到改善。然而，在過去，不可能以大規(guī)模使用活的微藻作為生物刺激素，原因是活的微藻的實(shí)際儲(chǔ)存是不可用的，并且活的微藻必須在現(xiàn)場生產(chǎn)并在收獲之后立即使用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明是誘導(dǎo)微藻的異養(yǎng)代謝活性的新方法，這意味著使用該方法培育的微藻如果被置于不可能進(jìn)行光合作用(即沒有光)的條件下，可以消耗來自培養(yǎng)基中的有機(jī)物質(zhì)來生長。本發(fā)明的實(shí)施方案旨在改善用于培育足夠量的小球藻屬(chlorella?sp.)、優(yōu)選普通小球藻的方法，所述小球藻屬在收獲藻類之后作為生物刺激素進(jìn)行商業(yè)銷售以應(yīng)用于作物。特別地，使用改進(jìn)的方法培育的微藻能夠在黑暗冷藏儲(chǔ)存和運(yùn)輸中存活。

2、微藻，并且特別是普通小球藻，已經(jīng)為商業(yè)用途培育了幾十年。用于以商業(yè)體積培育微藻例如c.vulgaris的已知方法涉及光生物反應(yīng)器(pbr)，以使在有限空間內(nèi)的生長最大化。

3、微藻的大多數(shù)商業(yè)用途不涉及活的微藻。例如，當(dāng)微藻被培育用于油含量(生物燃料)或用作動(dòng)物飼料添加劑時(shí)，藻類在收獲后立即被加工。市售的基于藻類的生物刺激素包括無細(xì)胞藻類提取物，其包含刺激植物生長并且還促進(jìn)土壤肥力的生長信號化合物(植物激素)，例如生長素和細(xì)胞分裂素。其他是來自藻類培養(yǎng)的生長介質(zhì)，包含由藻類在其生長期間分泌的相同的生長信號化合物。重要地，沒有市售的生物刺激素包含活的綠藻細(xì)胞。大多數(shù)生物刺激素作為化學(xué)肥料的補(bǔ)充物銷售；它們不足以取代化學(xué)肥料。早期的大學(xué)研究表明，施加活藻類(現(xiàn)場培育并在藻類收獲時(shí)施加)對產(chǎn)量和肥力提供足夠的促進(jìn)，從而可以淘汰化學(xué)肥料?；罴?xì)胞藻類生物刺激素被證明比藻類衍生物更有效。由于該原因，在運(yùn)輸和儲(chǔ)存期間保存活藻類的方法可以實(shí)現(xiàn)減少對合成化學(xué)肥料的需求。

4、已知的包含活細(xì)胞的市售生物刺激素使用藍(lán)細(xì)菌(cyanobacteria)(“藍(lán)-綠藻”，其實(shí)際上是細(xì)菌)。藍(lán)細(xì)菌是有效的植物生物刺激素，并產(chǎn)生生長信號化合物，其也由綠藻產(chǎn)生。像其他細(xì)菌一樣，藍(lán)細(xì)菌可以被干燥、包裝，然后在水中重組，并作為活細(xì)胞應(yīng)用。然而，不利地，在過去二十年中，由藍(lán)細(xì)菌產(chǎn)生的神經(jīng)毒素(包括β-n-甲氨基-l-丙氨酸，bmaa)與神經(jīng)退行性疾病的爆發(fā)有關(guān)。因?yàn)檫@個(gè)原因，需要更安全的基于活細(xì)胞的生物刺激素。

5、通過本文教導(dǎo)的方法培育的微藻即使作為“藻類濃縮物”被裝瓶在來自pbr的生長培養(yǎng)基中并在冷藏(6℃)下儲(chǔ)存也保持存活。冷藏使?jié)饪s物在儲(chǔ)存和運(yùn)輸?shù)綉?yīng)用地點(diǎn)期間保持不含污染物，因?yàn)槠湟种屏税ㄔ鷦?dòng)物和細(xì)菌在內(nèi)的常見污染物的生長。冷藏儲(chǔ)存通常是黑暗的，這對于微藻而言成問題，原因是像高等植物一樣，微藻通常是自養(yǎng)的，這意味著其經(jīng)由依賴光的光合作用產(chǎn)生營養(yǎng)來保持生存和生長：

6、藻類+光+水+co2+無機(jī)營養(yǎng)物→葡萄糖(&更多的藻類)+o2

7、當(dāng)微藻失去光時(shí)，光合作用停止，并且藻類細(xì)胞計(jì)數(shù)迅速下降(在我們的實(shí)驗(yàn)室中，五天內(nèi)下降多達(dá)50％，然后恢復(fù)很少，表1)。因此，用標(biāo)準(zhǔn)的繁殖方法，活的微藻必須在本地生產(chǎn)，以便立即用作pbs。由于微藻不容易生長，因此這對于廣泛的商業(yè)用途是成問題的。表明活的微藻，即本地培育并在收獲后立即應(yīng)用的微藻是有效的pbs的研究已經(jīng)在北非、東南亞和東歐進(jìn)行，但該方法尚未被商業(yè)用途采用，原因是其難以復(fù)制。不希望受理論束縛，活藻類，特別是普通小球藻的假定益處是在將其應(yīng)用于植物或土壤之后持續(xù)產(chǎn)生信號化合物?；钤孱?特別是普通小球藻細(xì)胞)的另一個(gè)有益效果是，觀察到其攝取土壤細(xì)菌(可能通過吞噬作用)將它們運(yùn)輸至植物根毛中，并最終將它們釋放至間隙空間中，在間隙空間中它們作為有益的內(nèi)生菌發(fā)揮作用。不存在用于大規(guī)模培育和儲(chǔ)存活的微藻的方法，使得其可以在一個(gè)地方生長，并被分配至其他遙遠(yuǎn)的地方以應(yīng)用，而沒有菌落降解。本發(fā)明的本質(zhì)是用于培育微藻，并且特別是普通小球藻的方法，所述微藻在冷藏、黑暗儲(chǔ)存時(shí)，由于異養(yǎng)代謝的誘導(dǎo)而保持存活，而細(xì)胞計(jì)數(shù)沒有顯著下降；即，通過這種方法培育的微藻能夠消耗有機(jī)物質(zhì)和氧氣，并在沒有光的情況下生長。這是通過在對pbr的生長培養(yǎng)基中使用的水進(jìn)行高充氧來實(shí)現(xiàn)的。在高充氧環(huán)境中，微藻改變代謝行為并變成“混合營養(yǎng)型”，這意味著盡管它們在存在光時(shí)繼續(xù)用光合作用產(chǎn)生食物/能量(自養(yǎng)代謝)，但它們在黑暗時(shí)變得能夠異養(yǎng)生長，能夠消耗有機(jī)營養(yǎng)物。已知藻類能夠異養(yǎng)攝食，因?yàn)橐呀?jīng)觀察到是通過向生長培養(yǎng)基中添加糖如葡萄糖，特別是當(dāng)暴露于高濃度葡萄糖時(shí)來誘導(dǎo)的。本方法通過生長介質(zhì)的高充氧，即通過用氧納米氣泡使生長介質(zhì)飽和來誘導(dǎo)異養(yǎng)代謝。這在先前是沒有報(bào)道過的。之前也沒有關(guān)于能夠在黑暗儲(chǔ)存時(shí)保持藻類菌落細(xì)胞計(jì)數(shù)和生存力的微藻的報(bào)道。雖然該方法被描述用于培育c.vulgaris，但其適用于所有小球藻屬以及其他能夠混合營養(yǎng)代謝的微藻。

8、目前，pbr用于在補(bǔ)充有無機(jī)營養(yǎng)物的水中培育微藻。以這種方式培育的微藻可以在收獲后立即加工使用，但是不能運(yùn)輸以用于需要活的微藻細(xì)胞的任何用途的應(yīng)用，因?yàn)槲⒃宀荒茉诤诎?、冷藏?chǔ)存下存活。在光生物反應(yīng)器中培育藻類是常見的實(shí)踐。此外，使用納米氣泡發(fā)生器作為這些系統(tǒng)的一部分已經(jīng)被用于產(chǎn)生用于藻類生長介質(zhì)的滅菌以及清潔藻類生長設(shè)備(罐和管道)的臭氧納米氣泡。本文描述的改善包括具有附接的納米氣泡發(fā)生器(nbg)的氧氣濃縮器。換言之，本發(fā)明首次提供了光生物反應(yīng)器，所述光生物反應(yīng)器配備有用于供應(yīng)納米氣泡形式的氧氣的裝置。如圖1所示，本發(fā)明的系統(tǒng)包括被定位成從來源接收無菌水的nbg。無菌水被進(jìn)給通過nbg以接收氧氣的納米氣泡，從而將水中可測量的氧氣濃度增加至約500％的飽和度，即高充氧狀態(tài)。

9、然后泵送經(jīng)高充氧的水以填充至少一個(gè)pbr。將眾所周知的廣泛用于藻類生產(chǎn)的無機(jī)營養(yǎng)物的混合物添加至pbr的無菌水中以產(chǎn)生生長培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明的可以用于培育藻類的典型培養(yǎng)基的一個(gè)實(shí)例為市售的guillard’s/f/2培養(yǎng)基。優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中，培養(yǎng)基中不存在外部添加的碳水化合物。然后，用微藻接種pbr。

10、系統(tǒng)中使用的pbr由半透明材料制成，使得來自pbr外部的光可以被生長在pbr內(nèi)部的微藻細(xì)胞利用以進(jìn)行光合作用。人造光源安裝在pbr外部并且模擬24小時(shí)的日循環(huán)。由于光合作用還需要二氧化碳，因此使用標(biāo)準(zhǔn)水族箱石質(zhì)起泡器以將經(jīng)過濾的環(huán)境空氣引入生長培養(yǎng)基中，從而提供二氧化碳并保持微藻細(xì)胞混合并呈懸浮狀態(tài)。在從pbr收獲后，將微藻細(xì)胞與其生長培養(yǎng)基一起裝瓶，作為每ml包含最少1000萬個(gè)藻類細(xì)胞的藻類濃縮物；該濃縮物為最終產(chǎn)品，其可以被稀釋并用作植物和土壤生物刺激素。

11、該改進(jìn)方法的一個(gè)重要特征是，其產(chǎn)生的微藻細(xì)胞能夠在黑暗、冷藏儲(chǔ)存下存活大于六個(gè)月，甚至長達(dá)十八個(gè)月，這是足以允許將其運(yùn)輸至農(nóng)業(yè)場所進(jìn)行應(yīng)用的時(shí)間。瓶裝的藻類濃縮物在用作生物刺激素出售之前直接置于冷藏(6℃)以儲(chǔ)存。然而，由于藻類可以在寬范圍的溫度內(nèi)生長，因此冷藏不是必需的。然而，如果儲(chǔ)存延長超過兩個(gè)月，則冷藏有利地防止細(xì)菌和原生動(dòng)物污染物的生長。如果產(chǎn)品在這段時(shí)間內(nèi)使用，則冷藏是不必要的。在最初兩個(gè)月的儲(chǔ)存期間，污染導(dǎo)致藻類菌落損失很少見，這可能是因?yàn)楫愷B(yǎng)攝食抑制了污染物生長。包含活藻類的本發(fā)明的組合物可以在冰箱溫度，例如在6℃下儲(chǔ)存大于八個(gè)月，但是推薦的使用日期是自收獲起六個(gè)月。使用該方法在系統(tǒng)中培育的微藻不僅保持存活，而且能夠在儲(chǔ)存時(shí)繼續(xù)生長，這保持了用作有效生物刺激素的應(yīng)用所必需的細(xì)胞數(shù)(參見表1)?；钤孱惖氖┯寐蕿槊科椒接⒊?0,000個(gè)細(xì)胞，應(yīng)用于土壤、葉或兩者；由此，一升藻類濃縮物可以稀釋成處理4.5英畝；5ml濃縮物處理1000平方英尺。

12、該改進(jìn)方法的另一個(gè)特征是，其使得微藻能夠以低成本以大規(guī)模生長以用于農(nóng)業(yè)用途，需要最少的工程，并在小空間內(nèi)提供高產(chǎn)率的微藻。特別地，本發(fā)明使得藻類能夠在高達(dá)750升容積的升光生物反應(yīng)器罐中生長。先前，存在罐直徑的增加導(dǎo)致罐中心的藻類被遮擋，并因此由于光暴露的效率低而阻礙生長的問題。然而，本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，較大罐中的藻類細(xì)胞計(jì)數(shù)與其較小直徑的300升pbr中的計(jì)數(shù)上升得一樣快。對此的一種解釋是藻類與空氣起泡器不斷混合。這防止藻類細(xì)胞聚集在罐的遠(yuǎn)離光源的中部。另一種解釋是，藻類是混合營養(yǎng)的，即它們不依賴于光合作用，因此它們甚至在反應(yīng)器中更多被遮擋或甚至黑暗的區(qū)域中繼續(xù)生長。使用更大的pbr罐引起了增加的效率和生產(chǎn)率。

13、在本發(fā)明的上下文中，描述了至少以下實(shí)施方案e1至e72：

14、e1.根據(jù)第一實(shí)施方案，本發(fā)明涉及生產(chǎn)包含活的藻類和液體的藻類組合物的方法，包括以下步驟：

15、-向所述液體中添加氧氣以提供高充氧液體；

16、-至少暫時(shí)在光暴露下在所述高充氧液體中培養(yǎng)所述藻類，以使得所述藻類能夠繁殖。

17、e2.實(shí)施方案1所述的方法，包括以下步驟：

18、-提供液體；

19、-向所述液體中添加氧氣以提供高充氧液體；

20、-用藻類接種所述高充氧液體；

21、-至少暫時(shí)在光暴露下在所述高充氧液體中培養(yǎng)所述藻類，以使得所述藻類能夠繁殖。

22、e3.實(shí)施方案1所述的方法，包括以下步驟：

23、-提供包含藻類的液體；

24、-向所述液體中添加氧氣以提供高充氧液體以及/或者添加高充氧液體；

25、-至少暫時(shí)在光暴露下在所述高充氧液體中培養(yǎng)所述藻類，以使得所述藻類能夠繁殖。

26、e4.實(shí)施方案1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述液體中的活細(xì)胞計(jì)數(shù)為100萬個(gè)細(xì)胞/ml至2000萬個(gè)細(xì)胞/ml，優(yōu)選200萬個(gè)細(xì)胞/ml至1800萬個(gè)細(xì)胞/ml，更優(yōu)選500萬個(gè)細(xì)胞/ml至1500萬個(gè)細(xì)胞/ml，甚至更優(yōu)選700萬個(gè)細(xì)胞/ml至1400萬個(gè)細(xì)胞/ml，還更優(yōu)選1000萬個(gè)細(xì)胞/ml至1300萬個(gè)細(xì)胞/ml，最優(yōu)選1100萬個(gè)細(xì)胞/ml至1300萬個(gè)細(xì)胞/ml。

27、e5.實(shí)施方案1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中活細(xì)胞計(jì)數(shù)的衰減是相同時(shí)間段內(nèi)相同藻類的未經(jīng)高充氧的對照培養(yǎng)物的活細(xì)胞計(jì)數(shù)的衰減的至多90％，優(yōu)選至多80％，更優(yōu)選至多70％，甚至更優(yōu)選至多60％，還更優(yōu)選至多50％，還更優(yōu)選至多40％，還更優(yōu)選至多30％，還更優(yōu)選至多20％，還更優(yōu)選至多10％，還更優(yōu)選至多5％。

28、e6.實(shí)施方案1至5中任一項(xiàng)所述的方法，其中當(dāng)與相同藻類的未經(jīng)高充氧的對照培養(yǎng)物相比時(shí)，在以下時(shí)間段內(nèi)存在至多10％，優(yōu)選至多8％，更優(yōu)選至多6％，甚至更優(yōu)選至多4％，還更優(yōu)選至多2％，還更優(yōu)選至多1％的活細(xì)胞計(jì)數(shù)的衰減，最優(yōu)選沒有活細(xì)胞計(jì)數(shù)的衰減，

29、(i)1個(gè)月至24個(gè)月，優(yōu)選1個(gè)月至20個(gè)月，進(jìn)一步地1個(gè)月至18個(gè)月，甚至更優(yōu)選2個(gè)月至15個(gè)月，還更優(yōu)選2個(gè)月至12個(gè)月，甚至更優(yōu)選2個(gè)月至10個(gè)月，甚至更優(yōu)選3個(gè)月至9個(gè)月，最優(yōu)選4個(gè)月至8個(gè)月；或者

30、(ii)1天至30天，優(yōu)選1天至25天，更優(yōu)選1天至15天，甚至更優(yōu)選1天至10天，最優(yōu)選4天至6天；或者

31、(iii)至少1個(gè)月，優(yōu)選至少2個(gè)月，更優(yōu)選至少3個(gè)月，甚至更優(yōu)選至少4個(gè)月，還更優(yōu)選至少5個(gè)月，甚至更優(yōu)選至少6個(gè)月，還更優(yōu)選至少7個(gè)月，最優(yōu)選至少8個(gè)月。

32、e7.實(shí)施方案1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中當(dāng)與相同藻類的未經(jīng)高充氧的對照培養(yǎng)物相比時(shí)，所述活細(xì)胞計(jì)數(shù)在以下時(shí)間段內(nèi)增加至少1％，優(yōu)選至少5％，更優(yōu)選至少10％，甚至更優(yōu)選至少20％，還更優(yōu)選至少30％，最優(yōu)選至少40％：

33、(i)1天至30天，優(yōu)選5天至25天，更優(yōu)選10天至25天，甚至更優(yōu)選15天至25天，最優(yōu)選18天至22天，或者

34、(ii)1個(gè)月至24個(gè)月，優(yōu)選1個(gè)月至20個(gè)月，進(jìn)一步地1個(gè)月至18個(gè)月，甚至更優(yōu)選2個(gè)月至15個(gè)月，還更優(yōu)選3個(gè)月至12個(gè)月，甚至更優(yōu)選3個(gè)月至10個(gè)月，甚至更優(yōu)選3個(gè)月至8個(gè)月，還更優(yōu)選3個(gè)月至6個(gè)月，最優(yōu)選3個(gè)月至4個(gè)月。

35、e8.實(shí)施方案1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述活的藻類可以在0℃至10℃，優(yōu)選2℃至8℃，更優(yōu)選5℃至7℃的溫度下儲(chǔ)存至少1個(gè)月，優(yōu)選至少2個(gè)月，更優(yōu)選至少4個(gè)月，甚至更優(yōu)選至少5個(gè)月，還更優(yōu)選至少6個(gè)月，甚至更優(yōu)選至少7個(gè)月，甚至更優(yōu)選至少8個(gè)月，最優(yōu)選長達(dá)18個(gè)月，以及/或者其中所述活的藻類可以在室溫下，優(yōu)選在10℃至30℃，優(yōu)選15℃至25℃，更優(yōu)選18℃至22℃的溫度下儲(chǔ)存至少1周，優(yōu)選至少2周，更優(yōu)選至少3周，甚至更優(yōu)選至少4周，還更優(yōu)選至少5周，甚至更優(yōu)選至少6周，還更優(yōu)選至少7周，最優(yōu)選至少8周，特別是至少2個(gè)月，而與收獲所述藻類時(shí)的活細(xì)胞計(jì)數(shù)相比活細(xì)胞計(jì)數(shù)沒有顯著衰減。

36、e9.實(shí)施方案1至8中任一項(xiàng)所述的方法，其中僅添加一次氧氣。

37、e10.實(shí)施方案1至9中任一項(xiàng)所述的方法，包括向所述液體中添加氧氣以提供高充氧液體以及/或者添加高充氧液體的多于一個(gè)步驟。

38、e11.實(shí)施方案1至8中任一項(xiàng)所述的方法，其中向所述液體中連續(xù)添加氧氣。

39、e12.實(shí)施方案1至11中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法在光生物反應(yīng)器中進(jìn)行。

40、e13.實(shí)施方案1至12中任一項(xiàng)所述的方法，其中將所述液體中的所述藻類暴露于光以1小時(shí)至12小時(shí)的間隔進(jìn)行至少1小時(shí)至24小時(shí)，優(yōu)選以8小時(shí)的間隔進(jìn)行至少16小時(shí)。

41、e14.實(shí)施方案1至13中任一項(xiàng)所述的方法，其中將所述液體中的所述藻類暴露于光在200nm至800nm，優(yōu)選250nm至650nm，更優(yōu)選300nm至550nm，甚至更優(yōu)選400nm至500nm，最優(yōu)選440nm的波長下進(jìn)行。

42、e15.實(shí)施方案1至14中任一項(xiàng)所述的方法，其中將所述液體中的所述藻類暴露于光在1w至20w，優(yōu)選5w至20w，更優(yōu)選10w至20w，甚至更優(yōu)選10w至15w，最優(yōu)選13w的功率下進(jìn)行。

43、e16.實(shí)施方案1至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中將所述液體中的所述藻類暴露于光在1,000勒克斯至20,000勒克斯，優(yōu)選5,000勒克斯至15,000勒克斯，更優(yōu)選8,000勒克斯至12,000勒克斯的光強(qiáng)度下進(jìn)行。

44、e17.實(shí)施方案1至16中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法還包括：

45、(i)監(jiān)測活細(xì)胞計(jì)數(shù)；以及/或者

46、(ii)收獲所述藻類；以及/或者

47、(iii)將收獲的藻類濃縮；以及/或者

48、(iv)儲(chǔ)存所述藻類。

49、e18.實(shí)施方案1至17中任一項(xiàng)所述的方法，其中將所述活的藻類儲(chǔ)存：

50、(i)在0℃至10℃，優(yōu)選2℃至8℃，更優(yōu)選5℃至7℃的溫度下；以及/或者

51、(ii)在10℃至30℃，優(yōu)選15℃至25℃，更優(yōu)選18℃至22℃的溫度下；以及/或者

52、(iii)在黑暗中。

53、e19.實(shí)施方案1至18中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過向所述液體供應(yīng)氧納米氣泡來向所述液體中添加氧。

54、e20.實(shí)施方案1至19中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述液體的氧水平為至少20ppm，優(yōu)選至少25ppm，更優(yōu)選至少30ppm，甚至更優(yōu)選至少35ppm，還更優(yōu)選至少40，甚至更優(yōu)選至少45ppm，最優(yōu)選至少50ppm。

55、e21.實(shí)施方案1至20中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述液體的氧飽和度為至少100％，優(yōu)選至少200％，更優(yōu)選至少300％，甚至更優(yōu)選至少400％，最優(yōu)選至少500％。

56、e22.實(shí)施方案2至21中任一項(xiàng)所述的方法，其中接種有所述藻類的所述高充氧液體具有至少50ppm的氧水平和/或至少500％的氧飽和度。

57、e23.實(shí)施方案1至22中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述液體為水性溶液，優(yōu)選選自水、淡水、海水、無菌水、培養(yǎng)基和/或緩沖液。

58、e24.實(shí)施方案1至17中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述液體為培養(yǎng)基，優(yōu)選所述培養(yǎng)基包含：

59、a)水，優(yōu)選無菌水；

60、b)硝酸鹽，優(yōu)選其堿金屬鹽，更優(yōu)選硝酸鈉；

61、c)磷酸二氫鹽，優(yōu)選其堿金屬鹽，更優(yōu)選磷酸二氫鈉；

62、d)硅酸鹽，優(yōu)選其堿金屬鹽，更優(yōu)選硅酸鈉；

63、e)一種或更多種痕量金屬，優(yōu)選其無機(jī)鹽，更優(yōu)選地所述痕量金屬選自鈷、銅、鐵、錳、鉬和/或鋅；以及/或者

64、f)一種或更多種維生素，優(yōu)選選自維生素b12、生物素和/或硫胺素。

65、e25.實(shí)施方案1至24所述的方法，其中所述液體中不存在外部添加的碳水化合物。

66、e26.實(shí)施方案1至25中任一項(xiàng)所述的方法，其中不向所述液體中添加另外的碳水化合物以誘導(dǎo)所述藻類中的異養(yǎng)代謝。

67、e27.實(shí)施方案1至26中任一項(xiàng)所述的方法，以分批模式、補(bǔ)料分批模式、半連續(xù)模式或連續(xù)模式操作。

68、e28.實(shí)施方案1至27中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述藻類能夠進(jìn)行混合營養(yǎng)代謝，優(yōu)選地其中所述藻類能夠進(jìn)行自養(yǎng)代謝和異養(yǎng)代謝二者，甚至更優(yōu)選地所述藻類在光暴露下生長時(shí)具有自養(yǎng)代謝并且能夠在不存在光的情況下進(jìn)行異養(yǎng)代謝。

69、e29.實(shí)施方案1至28中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述藻類為專性混合營養(yǎng)生物、專性自養(yǎng)生物和兼性異養(yǎng)生物、兼性自養(yǎng)生物和專性異養(yǎng)生物、和/或兼性混合營養(yǎng)生物。

70、e30.實(shí)施方案1至29中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述藻類選自單細(xì)胞藻類的組，優(yōu)選綠藻，更優(yōu)選地所述藻類為小球藻屬，甚至更優(yōu)選地所述藻類為普通小球藻。

71、e31.一種包含活的藻類和液體的組合物，其中所述組合物可通過根據(jù)實(shí)施方案1至30中任一項(xiàng)的方法獲得。

72、e32.一種包含活的藻類和液體的組合物，其中所述液體是高充氧的。

73、e33.實(shí)施方案31或32所述的組合物，其中所述液體包含氧納米氣泡，優(yōu)選地其中所述液體經(jīng)氧納米氣泡飽和。

74、e34.實(shí)施方案31至33中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述液體的氧水平為至少20ppm，優(yōu)選至少25ppm，更優(yōu)選至少30ppm，甚至更優(yōu)選至少35ppm，還更優(yōu)選至少40，甚至更優(yōu)選至少45ppm，最優(yōu)選至少50ppm。

75、e35.實(shí)施方案31至34中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述液體的氧飽和度為至少200％，優(yōu)選至少300％，更優(yōu)選至少400％，最優(yōu)選至少500％。

76、e36.實(shí)施方案31至35中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述液體選自水性溶液，優(yōu)選選自水、淡水、海水、無菌水、培養(yǎng)基和/或緩沖液。

77、e37.實(shí)施方案31至36中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述液體為包含以下的培養(yǎng)基：

78、a)水，優(yōu)選無菌水；

79、b)硝酸鹽，優(yōu)選其堿金屬鹽，更優(yōu)選硝酸鈉；

80、c)磷酸二氫鹽，優(yōu)選其堿金屬鹽，更優(yōu)選磷酸二氫鈉；

81、d)硅酸鹽，優(yōu)選其堿金屬鹽，更優(yōu)選硅酸鈉；

82、e)一種或更多種痕量金屬，優(yōu)選其無機(jī)鹽，更優(yōu)選地所述痕量金屬選自鈷、銅、鐵、錳、鉬和/或鋅；以及/或者

83、f)一種或更多種維生素，優(yōu)選選自維生素b12、生物素和/或硫胺素。

84、e38.實(shí)施方案31至37中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述液體中不存在外部添加的碳水化合物。

85、e39.實(shí)施方案31至38中任一項(xiàng)所述的組合物，其中不向所述液體中添加另外的碳水化合物。

86、e40.實(shí)施方案31至3中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述藻類能夠進(jìn)行混合營養(yǎng)代謝，優(yōu)選地其中所述藻類能夠進(jìn)行自養(yǎng)代謝和異養(yǎng)代謝二者，甚至更優(yōu)選地所述藻類在光暴露下生長時(shí)具有自養(yǎng)代謝并且能夠在不存在光的情況下進(jìn)行異養(yǎng)代謝。

87、e41.實(shí)施方案31至40中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述藻類為專性混合營養(yǎng)生物、專性自養(yǎng)生物和兼性異養(yǎng)生物、兼性自養(yǎng)生物和專性異養(yǎng)生物、和/或兼性混合營養(yǎng)生物。

88、e42.實(shí)施方案31至41中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述藻類選自單細(xì)胞藻類的組，優(yōu)選綠藻，更優(yōu)選地所述藻類為小球藻屬，甚至更優(yōu)選地所述藻類為普通小球藻。

89、e43.實(shí)施方案31至42中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述液體中的活細(xì)胞計(jì)數(shù)為100萬個(gè)細(xì)胞/ml至2000萬個(gè)細(xì)胞/ml，優(yōu)選200萬個(gè)細(xì)胞/ml至1800萬個(gè)細(xì)胞/ml，更優(yōu)選500萬個(gè)細(xì)胞/ml至1500萬個(gè)細(xì)胞/ml，甚至更優(yōu)選700萬個(gè)細(xì)胞/ml至1400萬個(gè)細(xì)胞/ml，還更優(yōu)選1000萬個(gè)細(xì)胞/ml至1300萬個(gè)細(xì)胞/ml，最優(yōu)選1100萬個(gè)細(xì)胞/ml至1300萬個(gè)細(xì)胞/ml。

90、e44.實(shí)施方案31至43中任一項(xiàng)所述的組合物，其中當(dāng)與相同時(shí)間段內(nèi)相同藻類的未經(jīng)高充氧的對照培養(yǎng)物的活細(xì)胞計(jì)數(shù)的衰減相比時(shí)，活細(xì)胞計(jì)數(shù)的衰減為至多90％，優(yōu)選至多80，更優(yōu)選至多70％，甚至更優(yōu)選至多60％，還更優(yōu)選至多50％，還更優(yōu)選至多40％，還更優(yōu)選至多30％，還更優(yōu)選至多20％，還更優(yōu)選至多10％，還更優(yōu)選至多5％。

91、e45.實(shí)施方案31至44中任一項(xiàng)所述的組合物，其中當(dāng)與相同藻類的未經(jīng)高充氧的對照培養(yǎng)物相比時(shí)，在以下時(shí)間段內(nèi)存在至多10％，優(yōu)選至多8％，更優(yōu)選至多6％，甚至更優(yōu)選至多4％，還更優(yōu)選至多2％，還更優(yōu)選至多1％的活細(xì)胞計(jì)數(shù)的衰減，最優(yōu)選沒有活細(xì)胞計(jì)數(shù)的衰減：

92、(i)1個(gè)月至24個(gè)月，優(yōu)選1個(gè)月至20個(gè)月，進(jìn)一步地1個(gè)月至18個(gè)月，甚至更優(yōu)選2個(gè)月至15個(gè)月，還更優(yōu)選2個(gè)月至12個(gè)月，甚至更優(yōu)選2個(gè)月至10個(gè)月，甚至更優(yōu)選3個(gè)月至6個(gè)月，最優(yōu)選3個(gè)月至5個(gè)月；或者

93、(ii)1天至30天，優(yōu)選1天至25天，更優(yōu)選1天至15天，甚至更優(yōu)選1天至10天，最優(yōu)選4天至6天；或者

94、(iii)至少1個(gè)月，優(yōu)選至少2個(gè)月，更優(yōu)選至少3個(gè)月，甚至更優(yōu)選至少4個(gè)月，還更優(yōu)選至少5個(gè)月，甚至更優(yōu)選至少6個(gè)月，還更優(yōu)選至少7個(gè)月，最優(yōu)選至少8個(gè)月。

95、e46.實(shí)施方案31至44中任一項(xiàng)所述的組合物，其中當(dāng)與相同藻類的未經(jīng)高充氧的對照培養(yǎng)物相比時(shí)，所述活細(xì)胞計(jì)數(shù)在以下時(shí)間段內(nèi)增加至少1％，優(yōu)選至少5％，更優(yōu)選至少10％，甚至更優(yōu)選至少20％，還更優(yōu)選至少30％，最優(yōu)選至少40％：

96、(i)1天至30天，優(yōu)選5天至25天，更優(yōu)選10天至25天，甚至更優(yōu)選15天至25天，最優(yōu)選18天至22天，或者

97、(ii)1個(gè)月至24個(gè)月，優(yōu)選1個(gè)月至20個(gè)月，進(jìn)一步地1個(gè)月至18個(gè)月，甚至更優(yōu)選2個(gè)月至15個(gè)月，還更優(yōu)選3個(gè)月至12個(gè)月，甚至更優(yōu)選3個(gè)月至10個(gè)月，甚至更優(yōu)選3個(gè)月至8個(gè)月，還更優(yōu)選3個(gè)月至6個(gè)月，最優(yōu)選3個(gè)月至4個(gè)月。

98、e47.實(shí)施方案31至46中任一項(xiàng)所述的組合物用于改善植物生長的用途。

99、e48.實(shí)施方案47所述的用途，其中所述植物選自水果、蔬菜和/或作物，優(yōu)選地所述作物是為食物或纖維而種植的農(nóng)業(yè)植物。

100、e49.實(shí)施方案48所述的用途，其中所述水果選自結(jié)果樹木、漿果灌木和/或菠蘿。

101、e50.實(shí)施方案48所述的用途，其中所述蔬菜選自菜園蔬菜，優(yōu)選番茄、馬鈴薯、黃瓜、辣椒、胡蘿卜、筍瓜和/或南瓜。

102、e51.實(shí)施方案48所述的用途，其中所述作物選自蔬菜作物、甜菜、玉米、豆類、干草、花生、棉花、麻和/或煙草。

103、e52.一種保持或改善土壤肥力以及/或者改善植物生長的方法，包括將實(shí)施方案31至46中任一項(xiàng)所述的組合物施加至土壤和/或植物的步驟。

104、e53.實(shí)施方案52所述的方法，其中所述土壤為農(nóng)業(yè)用地、牧場、運(yùn)動(dòng)場、高爾夫球場和/或城市綠地。

105、e54.實(shí)施方案52或53所述的方法，包括在將實(shí)施方案25至37中任一項(xiàng)所述的組合物施加至土壤和/或植物之前將所述組合物稀釋的步驟。

106、e55.實(shí)施方案52至54中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述組合物以每平方英尺10個(gè)至100,000個(gè)細(xì)胞，優(yōu)選每平方英尺100個(gè)至90,000個(gè)細(xì)胞，優(yōu)選每平方英尺1,000個(gè)至80,000個(gè)細(xì)胞，更優(yōu)選每平方英尺10,000個(gè)至70,000個(gè)細(xì)胞，還更優(yōu)選每平方英尺20,000個(gè)至60,000個(gè)細(xì)胞，甚至更優(yōu)選每平方英尺30,000個(gè)至55,000個(gè)細(xì)胞，還更優(yōu)選每平方英尺35,000個(gè)至55,000個(gè)細(xì)胞，還更優(yōu)選每平方英尺40,000個(gè)至55,000個(gè)細(xì)胞，甚至更優(yōu)選每平方英尺45,000個(gè)至55,000個(gè)細(xì)胞的量施加，最優(yōu)選以每平方英尺50,000個(gè)細(xì)胞的量施加。

107、e56.一種光生物反應(yīng)器，包括用于供應(yīng)納米氣泡形式的氧氣的裝置。

108、e57.實(shí)施方案56所述的光生物反應(yīng)器，其中所述用于供應(yīng)納米氣泡形式的氧氣的裝置包括用于提供氧氣的裝置，優(yōu)選氧氣濃縮器，以及用于產(chǎn)生納米氣泡的裝置，優(yōu)選納米氣泡發(fā)生器。

109、e58.實(shí)施方案57所述的光生物反應(yīng)器，其中所述用于提供氧氣的裝置可操作地連接至所述用于產(chǎn)生納米氣泡的裝置。

110、e59.實(shí)施方案56至58中任一項(xiàng)所述的光生物反應(yīng)器，包括以下中的一者或更多者：

111、a)一個(gè)或更多個(gè)反應(yīng)容器，優(yōu)選由玻璃纖維制成；

112、b)一個(gè)或更多個(gè)儲(chǔ)存器；

113、c)一個(gè)或更多個(gè)光源，優(yōu)選led光源，更優(yōu)選管狀led生長燈和/或led燈泡；

114、d)一個(gè)或更多個(gè)用于向所述光生物反應(yīng)器供應(yīng)溶解氣體的裝置；

115、e)氧氣濃縮器；

116、f)管道；和/或

117、g)一個(gè)或更多個(gè)閥。

118、e60.實(shí)施方案56至59中任一項(xiàng)所述的光生物反應(yīng)器，包括反應(yīng)容器，優(yōu)選地其中所述反應(yīng)容器為特征在于以下中的一者或更多者的容器：

119、(a)所述容器為液體不可滲透的；

120、(b)所述容器為圓柱形的；

121、(c)所述容器具有固定的側(cè)壁和底部；

122、(d)所述容器具有可除去的蓋子；和/或

123、(e)所述容器由半透明材料，優(yōu)選包含玻璃纖維的半透明材料制造。

124、e61.實(shí)施方案56至60中任一項(xiàng)所述的光生物反應(yīng)器，包括光源，優(yōu)選管狀led生長燈和/或led燈泡，更優(yōu)選地其中所述光源的特征在于以下中的一者或更多者：

125、a)波長為200nm至800nm，優(yōu)選250nm至650nm，更優(yōu)選300nm至550nm，甚至更優(yōu)選400nm至500nm，最優(yōu)選440nm；以及/或者

126、b)光強(qiáng)度為1,000勒克斯至20,000勒克斯，優(yōu)選5,000勒克斯至15,000勒克斯，更優(yōu)選8,000勒克斯至12,000勒克斯；以及/或者

127、c)功率為1w至20w，優(yōu)選5w至20w，更優(yōu)選10w至20w，甚至更優(yōu)選10w至15w，最優(yōu)選13w；以及/或者

128、d)所述光源垂直地且等距地定位在所述一個(gè)或更多個(gè)反應(yīng)容器的周圍，優(yōu)選地所述光源以與所述一個(gè)或更多個(gè)反應(yīng)容器相距0.5cm至50cm，優(yōu)選1cm至10cm，更優(yōu)選2cm至8cm，甚至更優(yōu)選5cm至6cm，最優(yōu)選5cm的距離定位；以及/或者

129、e)所述光源包括可操作以打開和關(guān)閉所述光源的計(jì)時(shí)器，優(yōu)選地，所述計(jì)時(shí)器被設(shè)定成使所述光源循環(huán)打開至少1小時(shí)至24小時(shí)并且關(guān)閉至少1小時(shí)至12小時(shí)，優(yōu)選地打開16小時(shí)并且關(guān)閉8小時(shí)。

130、e62.實(shí)施方案56至61中任一項(xiàng)所述的光生物反應(yīng)器，包括用于向所述一個(gè)或更多個(gè)反應(yīng)容器供應(yīng)溶解氣體的一個(gè)或更多個(gè)裝置，所述一個(gè)或更多個(gè)裝置不是用于供應(yīng)納米氣泡形式的氧氣的裝置，優(yōu)選地，其中所述用于向所述一個(gè)或更多個(gè)反應(yīng)容器供應(yīng)溶解氣體的一個(gè)或更多個(gè)裝置包括可操作以將溶解氣體推入到所述一個(gè)或更多個(gè)反應(yīng)容器中的泵、用于所述溶解氣體穿過的管道、和止回閥，更優(yōu)選地，其中所述用于向所述一個(gè)或更多個(gè)反應(yīng)容器供應(yīng)溶解的氣體的一個(gè)或更多個(gè)裝置為水族箱石質(zhì)起泡器。

131、e63.實(shí)施方案56至62中任一項(xiàng)所述的光生物反應(yīng)器，包括管道，優(yōu)選地其中所述管道由聚合物，優(yōu)選聚乙烯，和/或不銹鋼制成，優(yōu)選地所述管道由聚乙烯和不銹鋼的組合制成。

132、e64.實(shí)施方案56至63中任一項(xiàng)所述的光生物反應(yīng)器，包括管道，優(yōu)選地其中所述管道適于提供所述光生物反應(yīng)器的組件的流體連接。

133、e65.一種系統(tǒng)，包括一個(gè)或更多個(gè)根據(jù)實(shí)施方案56至64中任一項(xiàng)的光生物反應(yīng)器。

134、e66.實(shí)施方案65所述的系統(tǒng)，包括至少兩個(gè)光生物反應(yīng)器，優(yōu)選地其中所述光生物反應(yīng)器以流體連接。

135、e67.實(shí)施方案66所述的系統(tǒng)，其中所述光生物反應(yīng)器以光生物反應(yīng)器陣列布置。

136、e68.實(shí)施方案66或67所述的系統(tǒng)，其中所述光生物反應(yīng)器并聯(lián)連接。

137、e69.實(shí)施方案65至68中任一項(xiàng)所述的系統(tǒng)，包括閥，其中所述閥可操作以允許通過打開或關(guān)閉所述閥來將所述至少一個(gè)光生物反應(yīng)器與其他光生物反應(yīng)器分離。

138、e70.實(shí)施方案65至69中任一項(xiàng)所述的系統(tǒng)，其中所述一個(gè)或更多個(gè)光生物反應(yīng)器與納米氣泡發(fā)生器流體連接。

139、e71.根據(jù)權(quán)利要求65至70中任一項(xiàng)所述的系統(tǒng)，包括與所述一個(gè)或更多個(gè)光生物反應(yīng)器流體連接的儲(chǔ)存器。

140、e72.根據(jù)權(quán)利要求65至71中任一項(xiàng)所述的系統(tǒng)，包括可操作地連接至所述一個(gè)或更多個(gè)光生物反應(yīng)器以從所述一個(gè)或更多個(gè)光生物反應(yīng)器中除去液體的排出管線，優(yōu)選地所述排出管線由聚乙烯制成。

141、由仔細(xì)閱讀本發(fā)明的詳細(xì)描述和結(jié)合附圖的說明性實(shí)施方案，對于使用光生物反應(yīng)器繁殖微藻的領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，這些和其他特征及其優(yōu)點(diǎn)將是明顯的。