專利名稱：受對氯硝基苯類化合物污染的環(huán)境的生物修復(fù)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種受污染環(huán)境的生物修復(fù)方法，特別是涉及一種受對氯硝基苯類化合物污染的環(huán)境的生物修復(fù)方法。
背景技術(shù)：
隨著我國工、農(nóng)業(yè)的迅速發(fā)展，環(huán)境污染問題日益成為我國社會發(fā)展過程中十分嚴重和迫切需要解決的問題，它不僅制約了我國的經(jīng)濟發(fā)展和人民生活水平的提高，而且嚴重限制了我國社會的可持續(xù)發(fā)展，對人民健康產(chǎn)生極大威脅，因此，對污染土壤的修復(fù)治理成為人們十分關(guān)注的問題。80年代中期，利用生物修復(fù)技術(shù)對污染土壤進行整治開始得到應(yīng)用，多年的研究表明，生物修復(fù)，既利用微生物或其他生物將土壤、水體中的污染物降解為二氧化碳和水等無害物質(zhì)的技術(shù)，是一種安全又經(jīng)濟的方法。在有機污染的生物修復(fù)過程中，起到關(guān)鍵作用的是具有降解不同污染物能力的微生物，其次是植物。目前，人們逐漸將目光轉(zhuǎn)移到利用微生物與植物根系之間的相互作用促進污染物的降解。植物根系能夠改變土壤的物理結(jié)構(gòu)，增加土壤通氣量、含水量以及改變pH值；更重要的是，植物的根系能夠分泌大量物質(zhì)，包括氨基酸、糖類、有機酸以及多肽等，這些物質(zhì)可以為微生物的生長與繁殖提供營養(yǎng)物質(zhì)，延長其存活時間；另外，某些有機化合物能夠刺激或誘導(dǎo)微生物的代謝活性，加速污染物的降解；此外，植物根系還能夠深入土壤，促進微生物的廣泛分布，并且還能吸收土壤中的水分，因此一些水溶性的污染物可以聚集在根系附近，有利于根系周圍微生物充分發(fā)揮其降解能力，達到快速高效降解污染物的目的；另一方面，降解菌株通過對污染物進行降解，降低了污染物對植物的毒害作用，保護了植物，使得雙方受益，從而相互促進，加速了污染物的降解過程。
氯代硝基苯類化合物(chloronitrobenzens，CNB)是一類重要的化工原料和中間體，被廣泛地運用于橡膠制造、染料以及農(nóng)藥生產(chǎn)等領(lǐng)域。目前，我國氯代硝基苯工業(yè)經(jīng)過50多年的發(fā)展，生產(chǎn)廠家達20多家，總年產(chǎn)能力近20萬噸，已占世界總年產(chǎn)能力的50％以上。然而，隨之而來的是氯代硝基苯等芳香化合物通過各種途徑進入環(huán)境成為污染物。例如，生產(chǎn)過程中排放的污水中含有大量殘留物，或者環(huán)境中其他芳香化合物經(jīng)過不徹底的降解或轉(zhuǎn)化形成了一些硝基取代的芳香化合物；在自來水的氯化消毒過程中，也會產(chǎn)生氯代硝基苯類化合物。研究表明，氯代硝基苯類化合物具有致畸、致癌、致突變的“三致”作用。在氯代硝基苯類化合物中，又以氯代硝基苯最為嚴重，例如，對氯硝基苯能夠引起人或動物的高鐵血紅蛋白癥(methemoglobinemia)或貧血(anemia)，因此歐盟已經(jīng)將氯代硝基苯確定為特別有害的化合物。
目前，國內(nèi)外對氯代硝基苯類化合物降解的研究報道較少，只有個別報道了有關(guān)對氯硝基苯的微生物降解，而將這些微生物運用于實際的生物修復(fù)中則更少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種受對氯硝基苯類化合物污染的環(huán)境的修復(fù)方法。
本發(fā)明所提供的受對氯硝基苯類化合物污染的環(huán)境的修復(fù)方法，是將萌發(fā)出根芽的苜蓿種子浸泡于OD600值為1.8-2.2的睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonastestosteroni)CNB-l CGMCC No.1028的菌懸液中進行包被，再將經(jīng)睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028包被的苜蓿種子植入受氯硝基苯類化合物污染的環(huán)境中進行培養(yǎng)，隨著苜蓿的生長，環(huán)境中的硝基苯類化合物逐步得到降解，起到修復(fù)作用。
睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028已在專利“一種降解對氯代硝基苯的睪丸酮叢毛單胞菌及其用途”中公開，專利申請?zhí)?00310114337.7。
在上述修復(fù)方法中，睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCCNo.1028菌懸液的OD600值優(yōu)選為2.0；睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonastestosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028的菌懸液的制備方法可為將睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028菌體重懸于質(zhì)量百分濃度為0.9％NaCl溶液中。
苜蓿種子萌發(fā)的條件可為將苜蓿種子置于濕潤濾紙上，在30℃下暗培養(yǎng)。
包被時間為50-70min，優(yōu)選為60min。
本發(fā)明的修復(fù)方法既適用于受對氯硝基苯類化合物污染的土壤環(huán)境，也適用于受此類化合物污染的無土基質(zhì)。所述對氯硝基苯類化合物為對氯硝基苯。
可按常規(guī)方法對睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCCNo.1028菌進行培養(yǎng)，具體過程可包括以下步驟1)將睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028接種于以對氯硝基苯為底物的無機鹽培養(yǎng)基中，在28-30℃下振蕩培養(yǎng)12-18h，得到種子液；所述無機鹽培養(yǎng)基配方為磷酸氫二鈉1.0g，磷酸二氫鉀0.5g，MgSO4·7H2O 0.03g，微量元素溶液5mL，對氯硝基苯200mg，用水定容至1000mL，pH6.8-7.2，所述儆量元素溶液含EDTA 0.5g，ZnSO4·7H2O 0.22g，CaCl20.055g，MnCl2·4H2O 0.051g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.0499g，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.011g，CuSO4·5H2O 0.0157g，CoCl2·6H2O 0.0161g，用水定容至1000mL，pH6.0；2)將步驟1)獲得的睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCCNo.1028的種子液接種于LB液體培養(yǎng)基中，在28-30℃下振蕩培養(yǎng)。
所述步驟1)中無機鹽培養(yǎng)基的pH值優(yōu)選為7.0；所述振速為100-150rpm，優(yōu)選為130rpm。
步驟2)中睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028種子液的接種量為1-2％；所述培養(yǎng)溫度優(yōu)選為30℃，振速為100-150rpm，優(yōu)選為130rpm，培養(yǎng)時間為12-24h，優(yōu)選為12-18h。
本發(fā)明提供了一種受對氯硝基苯類化合物污染的環(huán)境的修復(fù)方法。該方法利用了睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028對對氯硝基苯類化合物的降解作用，同時與豆科植物苜蓿建立組合可對受到對氯硝基苯污染的環(huán)境進行生物修復(fù)。該菌株可定植在苜蓿根系并與其相互促進，從而發(fā)揮高效降解污染物-對氯硝基苯類化合物的效能，達到對受此類化合物污染的環(huán)境的生物修復(fù)作用，使其恢復(fù)生態(tài)功能。本發(fā)明具有以下優(yōu)點1)在污染環(huán)境的生物修復(fù)過程中，微生物因其具有廣泛的代謝途徑，以及能夠降解多種類型的污染物而起到關(guān)鍵作用，是生物修復(fù)的主體，而植物在污染環(huán)境的生物修復(fù)中也起到重要作用，植物具有發(fā)達的根系，不僅能夠改善土壤的物理性質(zhì)，還能夠分泌大量有機物質(zhì)，不僅為微生物提供了生長繁殖所需的營養(yǎng)物質(zhì)，而且其中一些有機化合物能夠誘導(dǎo)或增強微生物的某些代謝途徑，促進微生物對污染物的利用和降解，或通過共代謝作用將污染物降解，因此將具有對氯硝基苯類化合物高效降解能力的菌株與具有發(fā)達根系的豆科植物苜蓿形成組合可提高生物修復(fù)能力；2)將植物根系與高效降解菌株聯(lián)合，克服了單一的微生物修復(fù)技術(shù)或植物修復(fù)技術(shù)的不足首先，采用植物根系-微生物系統(tǒng)能較好地延長降解菌株在土壤中的存活時間，由于植物根系能分泌大量營養(yǎng)物質(zhì)，為降解菌株提供了生長所必須的一些要素或生長因子，根系周圍的微觀環(huán)境優(yōu)于非根系土壤，延長了降解菌株的存活周期，有利于其發(fā)揮降解活性；其次，植物發(fā)達的根系能夠吸收土壤中的水分，使得一些水溶性的污染物隨著水的流動向植物根系靠近，這將有利于降解菌株于污染物接觸，加速降解過程，而且植物根系能夠進入土壤深處，有利于降解菌株在土壤中的廣泛分布；另外，微生物通過降解污染物，降低了土壤中污染物對植物的毒性，間接地增強了植物對污染物的耐受性，使得植物能夠更好的生長，從而促進降解菌株的存活，二者通過這種相互作用，起到了相互促進、互利互惠的效果，有利于污染物的降解；3)所采用的高效降解菌株為從污染源分離得到的野生型菌株，沒有經(jīng)過基因工程改造，因此不會引起生物安全問題，容易被社會接受；4)該方法應(yīng)用簡便，無需大量資金投入，經(jīng)濟實用，適合大面積的污染環(huán)境的修復(fù)，且不會產(chǎn)生二次污染。
基于上述優(yōu)點，本發(fā)明將在受對氯硝基苯類化合物污染的環(huán)境的生物修復(fù)中發(fā)揮巨大作用，并為開發(fā)新型的污染土壤生物修復(fù)技術(shù)以及污水土地處理技術(shù)具有重要的實際應(yīng)用意義。
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。


圖1為實驗組和對照組植株在受不同濃度對氯硝基苯污染的土壤中的生長情況圖2為經(jīng)綠色熒光蛋白標記的降解菌-睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonastestosteroni)CNB-1::gfp2在苜蓿根系定植的共聚焦激光掃描顯微照片具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
無機鹽培養(yǎng)基磷酸氫二鈉1g，磷酸二氫鉀0.5g，MgSO4·7H2O 0.03g，微量元素溶液5mL，對氯硝基苯200mg，用蒸餾水定容至1000mL，pH7.0；微量元素溶液EDTA 0.5g，ZnSO4·7H2O 0.22g，CaCl20.055g，MnCl2·4H2O 0.051g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.0499g，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.011g，CuSO4·5H2O 0.0157g，CoCl2·6H2O 0.0161g，用水定容至1000mL，pH6.0；121℃滅菌30min。
LB液體培養(yǎng)基蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，用蒸餾水定容至1000mL，pH7.2。
實施例1、檢測本發(fā)明方法對受對氯硝基苯類化合物污染的無土基質(zhì)的修復(fù)能力以對氯硝基苯為例，檢測本發(fā)明方法對受對氯硝基苯類化合物污染的無土基質(zhì)的修復(fù)能力，具體過程包括以下步驟1)將睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028接種于以對氯硝基苯為底物的無機鹽培養(yǎng)基中，在28℃、130rpm下振蕩培養(yǎng)16h，得到種子液；2)將步驟1)獲得的睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCCNo.1028的種子液按1％的接種比例接種于LB液體培養(yǎng)基中，在30℃下振蕩培養(yǎng)18h；3)6000rpm離心收集菌體，將其重懸于無菌的質(zhì)量百分濃度為0.9％NaCl溶液中，使其OD600達到2.0，得到睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCCNo.1028的菌懸液；4)將苜蓿種子置于濕潤濾紙上，30℃避光萌發(fā)2天，待長出根芽(約5mm)后，將其浸泡于步驟3)獲得的睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCCNo.1028的菌懸液中進行包被，浸泡時間為60min；5)將經(jīng)睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028包被的苜蓿種子移栽于營養(yǎng)基質(zhì)(KNO318.5mg，KH2PO424.8mg，MgSO4·7H2O 65.9mg，CaCl260mg，F(xiàn)eSO4·7H2O 30mg，EDTA·2Na 20mg，微量元素溶液(同上)1mL，H2O 1000mL，pH 6.8-7.0，蛭石若干)上進行無土栽培，同時設(shè)未包被的苜蓿作為對照，在營養(yǎng)基質(zhì)中添加終濃度分別為0、50、100、200μg/mL的對氯硝基苯，在25℃溫室中進行培養(yǎng)，每天光照培養(yǎng)(光照強度為1400lux)18h，避光培養(yǎng)6h，考查苜蓿的生長情況以及對氯硝基苯的降解情況。實驗進行8天后進行數(shù)據(jù)分析，采用菌落計數(shù)法(CFU法)對培養(yǎng)體系中苜蓿根系和非根系土壤基質(zhì)的降解菌數(shù)量進行計數(shù)，采用HPLC法分析對氯硝基苯的降解情況，結(jié)果如表1所示，苜蓿根系區(qū)域的降解菌數(shù)量明顯高于非根系區(qū)域，經(jīng)包被處理的苜蓿其生長量在污染物存在的情況下要明顯高于未包被的對照組，表明其本發(fā)明的方法對無土基質(zhì)中的污染物-對硝基苯具有較好的降解效果，可起到環(huán)境修復(fù)作用。該結(jié)果說明本發(fā)明方法中所形成的微生物-植物體系中，睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028和苜蓿具有相互促進的作用關(guān)系，苜蓿根系為降解菌提供某種有利因素，而降解菌的存在可以很好地保護植物免受污染物的危害，使系統(tǒng)處理污染物的能力充分發(fā)揮。
表1對受對氯硝基苯類化合物污染的無土基質(zhì)的修復(fù)能力檢測結(jié)果

實施例2、檢測本發(fā)明方法對受對氯硝基苯類化合物污染的土壤的修復(fù)能力以對氯硝基苯為例，用盆栽實驗檢測本發(fā)明方法對受對氯硝基苯類化合物污染的土壤的修復(fù)能力，具體過程包括以下步驟1)將睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028接種于以對氯硝基苯為底物的無機鹽培養(yǎng)基中，在30℃、130rpm下振蕩培養(yǎng)16h，得到種子液；2)將步驟1)獲得的睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCCNo.1028的種子液按1％的接種比例接種于LB液體培養(yǎng)基中，在28℃下振蕩培養(yǎng)18h；3)7000rpm離心收集菌體，將其重懸于無菌的質(zhì)量百分濃度為0.9％NaCl溶液中，使其OD600達到2.0，得到睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCCNo.1028的菌懸液；4)將苜蓿種子置于濕潤濾紙上，30℃避光萌發(fā)2天，待長出根芽(約5mm)后，將其浸泡于步驟3)獲得的睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCCNo.1028的菌懸液中進行包被，浸泡時間為60min；5)將經(jīng)睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028包被的苜蓿種子以10粒為一組進行盆載種植作為實驗組；以未經(jīng)包被處理的苜蓿種子10粒為一組進行盆載作為對照組。盆載所用的土壤為沙土+花卉營養(yǎng)土+蛭石(混合比例1∶1∶1)，每盆土壤350g，所有盆載都在室外自然光照環(huán)境條件下進行培養(yǎng)。待苜蓿生長5天后，對照組和實驗組中的植株再分為不同濃度處理組，每天分別用15mL含不同濃度(0，50，100，200mg/L)對氯硝基苯的水溶液澆灌一次。經(jīng)過15天的培養(yǎng)后，測定苜蓿的生長情況以及對氯硝基苯的降解情況。
苜蓿的生長情況如圖1所示，數(shù)據(jù)如表2所示，經(jīng)包被處理的實驗組，在經(jīng)過10天不同濃度對氯硝基苯澆灌后，各盆苜蓿的平均株高、根長以及總生長量沒有明顯的差異，特別是經(jīng)50mg/L對氯硝基苯溶液澆灌的實驗組，苜蓿的平均根長和總生長量還略高于其他實驗組；而經(jīng)未包被的對照組，在經(jīng)過10天不同濃度對氯硝基苯溶液澆灌后，各盆苜蓿的平均株高和根長以及總生長量存在明顯差異，且隨污染物濃度的提高長勢呈現(xiàn)明顯的下降趨勢。上述檢測結(jié)果表明在所實驗的對氯硝基苯濃度范圍內(nèi)，該降解菌的存在完全可以保護苜蓿免受污染物的危害，也說明了睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028對對氯硝基苯類化合物具有降解作用。
表2對受對氯硝基苯類化合物污染的土壤的修復(fù)能力的盆栽實驗結(jié)果


實施例3、睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028在苜蓿根系定植能力的檢測為了便于觀察對氯硝基苯降解菌株睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028在生物修復(fù)過程中在植物根系的定植情況，現(xiàn)將綠色熒光蛋白(green flouresence protein，GFP)基因整合在睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonastestosteroni)CNB-1的基因組DNA上，具體方法為(1)睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1感受態(tài)細胞的制備將發(fā)明內(nèi)容步驟1)中得到的種子液按照1％的接種量接入LB液體培養(yǎng)基中，在28℃下，130rpm振蕩培養(yǎng)，使其OD600達到0.3-0.4，(以下操作均在4℃進行)4500rpm下離心收集菌體細胞，用4℃預(yù)冷的超純水將菌體細胞重新懸浮，4500rpm下離心收集菌體細胞，重復(fù)上述操作兩次后，用4℃預(yù)冷的10％(v/v)甘油將菌體重新懸浮，4500rpm下離心收集菌體細胞，用10％(v/v)甘油將菌體重新懸浮，使其濃度達到1011個細胞/mL，此即為感受態(tài)細胞，置于-70℃保存；(2)取200μL上述感受態(tài)細胞，加入1μg質(zhì)粒pFAJ1820(該質(zhì)粒含有綠色熒光蛋白基因和卡那霉素抗性基因Xi C，Lambrechts M，VanderleydenJ and Michiels J.Bi-functional gfp-and gusA-containing mini-Tn5 transposonderivatives for combined gene expression and bacterial localization studies.Journal of Microbiological Methods，1999，3585-92.)，混合后置于電擊杯中進行電擊轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化條件為2.5kV，200Ω，25μF；(3)用1.0mL SOC液體培養(yǎng)基將電擊轉(zhuǎn)化的細胞懸浮(SOC液體培養(yǎng)基的組成為蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 0.5g/L，葡萄糖20mM，pH7.0)，置于28℃，130rpm振蕩培養(yǎng)40-60分鐘，取200μL上述細胞懸液涂布于含有150μg/mL卡那霉素的LB固體平板上，置于30℃暗培養(yǎng)24h；(4)將生長出菌落的LB固體平板置于手提式紫外燈下觀察，將具有明顯綠色熒光的菌落挑出，命名為CNB-1::gfp2，經(jīng)檢測該突變株的生長和降解活性與原始菌株相同，并且能穩(wěn)定地表達綠色熒光蛋白，在熒光顯微鏡下可觀察到明顯的綠色熒光。采用與實施例2同樣的處理方法，使用苜蓿與睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonastestosteroni)CNB-1::gfp2對含有對氯硝基苯的污染土壤進行修復(fù)實驗。一定時間后，將苜蓿取出，用無菌水清洗根，取約1cm根組織，放在載玻片上，加幾滴無菌水，蓋上蓋玻片后，在熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描顯微鏡(confocal leaserscanning microscopy，CLSM)下觀察，如圖2所示，可以看到標記菌株能夠定植在根表面，根細胞間隙或死亡的根表皮細胞內(nèi)，表明降解菌睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028能夠在苜蓿根系中定植，這是高效發(fā)揮其降解對氯硝基類污染物功效的基礎(chǔ)。
權(quán)利要求
1.一種受對氯硝基苯類化合物污染的環(huán)境的生物修復(fù)方法，是將萌發(fā)出根芽的苜蓿種子浸泡于OD600值為1.8-2.2的睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonastestosteroni)CNB-1CGMCC No.1028的菌懸液中進行包被，再將經(jīng)睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1CGMCC No.1028包被的苜蓿種子植入受氯硝基苯類化合物污染的環(huán)境中進行培養(yǎng)，環(huán)境得到修復(fù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物修復(fù)方法，其特征在于所述睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1CGMCC No.1028菌懸液的OD600值為2.0。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的生物修復(fù)方法，其特征在于所述睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1CGMCC No.1028的菌懸液的制備方法為將睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1CGMCC No.1028菌體重懸于質(zhì)量百分濃度為0.9％NaCl溶液中。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物修復(fù)方法，其特征在于所述苜蓿種子萌發(fā)的條件為將苜蓿種子置于濕潤濾紙上，在30℃下暗培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物修復(fù)方法，其特征在于所述包被時間為50-70min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的生物修復(fù)方法，其特征在于所述對氯硝基苯類化合物為對氯硝基苯。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的生物修復(fù)方法，其特征在于所述環(huán)境包括土壤環(huán)境和無土環(huán)境。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的生物修復(fù)方法，其特征在于所述睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1CGMCC No.1028菌的培養(yǎng)方法，包括以下步驟1)將睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028接種于以對氯硝基苯為底物的無機鹽培養(yǎng)基中，在28-30℃下振蕩培養(yǎng)12-18h，得到種子液；所述無機鹽培養(yǎng)基配方為磷酸氫二鈉1.0g，磷酸二氫鉀0.5g，MgSO4·7H2O 0.03g，微量元素溶液5.0mL，對氯硝基苯200mg，用水定容至1000mL，pH6.8-7.2；所述微量元素溶液含EDTA 0.5g，ZnSO4·7H2O 0.22g，CaCl20.055g，MnCl2·4H2O 0.051g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.0499g，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.011g，CuSO4·5H2O 0.0157g，CoCl2·6H2O 0.0161g，用水定容至1000mL，pH6.0；2)將步驟1)獲得的睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCCNo.1028的種子液接種于LB液體培養(yǎng)基中，在28-30℃下振蕩培養(yǎng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的生物修復(fù)方法，其特征在于所述步驟1)中無機鹽培養(yǎng)基的pH值為7.0；所述振速為130rpm。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的生物修復(fù)方法，其特征在于所述步驟2)中睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028種子液的接種量為1-2％；振蕩培養(yǎng)條件為在30℃、130rpm下培養(yǎng)12-18h。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種受對氯硝基苯類化合物污染的環(huán)境的生物修復(fù)方法。該方法是將萌發(fā)出根芽的苜蓿種子浸泡于OD
文檔編號C12N1/20GK1803228SQ200610001778
公開日2006年7月19日 申請日期2006年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月25日
發(fā)明者劉雙江, 劉磊, 劉志培, 姜成英, 吳建峰 申請人:中國科學院微生物研究所