本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種可用于藥物加載和釋放的、可注射型自愈合凝膠生物材料及其制備方法和應(yīng)用。具體而言，本發(fā)明涉及一種基于明膠顆粒的、生物相容性的、可降解膠體凝膠材料，可直接施用于外科手術(shù)(含微創(chuàng)手術(shù))以及外傷等原因造成的人及其他哺乳動(dòng)物的組織器官創(chuàng)面或缺損的修復(fù)填充及再生重建。

背景技術(shù)：

自愈合材料為一類新型功能材料，這類材料在受到外力破壞后能自動(dòng)修復(fù)愈合，可完全或部分恢復(fù)破壞前的結(jié)構(gòu)和力學(xué)強(qiáng)度，已成為非常重要的一類新型、智能化、工程材料。其中，具有自愈合能力的水凝膠材料因其自修復(fù)能力、具有生物相容性、和人體組織類似的高含水率等特點(diǎn)，在生物醫(yī)藥工程領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。近來，科學(xué)家們借助可逆的高分子鏈間相互作用，即高分子間的鍵合可被打破和重建這一特性，開發(fā)出多種具有自愈合效應(yīng)的新型水凝膠材料。然而這些自愈合材料因普遍采用高分子鏈間的分子間相互作用，包括氫鍵、金屬離子配體的配位作用、靜電作用或疏水性作用等，易產(chǎn)生微觀相分離，且這類水凝膠高分子網(wǎng)絡(luò)無法實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物分子的可控加載和釋放。同時(shí)傳統(tǒng)的自修復(fù)高分子水凝膠材料存在諸多難以克服的瓶頸，包括力學(xué)強(qiáng)度較弱，無法對(duì)藥物釋放進(jìn)行準(zhǔn)確控制，同時(shí)難以兼顧生物相容性和生物降解性。這些都限制了其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其是作為可植入生物材料的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于上述所述的自愈合材料在現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供一種可用于藥物加載和釋放的可注射型自愈合凝膠生物材料及其制備方法。該凝膠生物材料具有自愈合功能，并可加載水溶性小分子化學(xué)藥物、蛋白藥物或活細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)藥物或生物因子的可控釋放，可誘導(dǎo)組織再生，適用于皮膚組織、牙周組織、軟骨組織等病缺損組織的修復(fù)，也可作為3d生物打印墨水。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種可注射型自愈合膠體凝膠的制備方法，包括以下步驟：

(1)以明膠為原料，使其在去離子水中加熱溶解，配置濃度為0.1～20w/v％的明膠水溶液，調(diào)ph值為1-6或8-14，向溶液中加入>2倍體積的極性有機(jī)溶劑，生成明膠微凝膠顆粒分散液，加入交聯(lián)劑交聯(lián)反應(yīng)1～12h，離心、清洗得到明膠微凝膠顆粒；

其中，所述明膠微凝膠顆粒的zeta電勢(shì)為-30～+30mv，所述明膠微凝膠顆粒的直徑為20nm～5μm；

(2)將步驟(1)制備得到的表面zeta電勢(shì)>+10mv的明膠微凝膠顆粒，分散在ph<5的酸性水溶液或ph>9的堿性水溶液中，得明膠微凝膠顆粒的分散液，再與帶負(fù)電荷的有機(jī)高分子顆粒分散液按照顆粒數(shù)比1:1000～1000:1共混，用ph調(diào)節(jié)劑調(diào)ph至7.0，冷凍干燥，得到明膠微凝膠顆粒凍干粉末i；

(3)將步驟(1)制備得到的表面zeta電勢(shì)<-10mv的明膠微凝膠顆粒，分散在ph<5的酸性水溶液或ph>9的堿性水溶液中，得明膠微凝膠顆粒的分散液，再與帶正電荷的有機(jī)高分子顆粒分散液按照顆粒數(shù)比1:1000～1000:1，混合，用ph調(diào)節(jié)劑調(diào)ph至7.0，冷凍干燥，得到明膠微凝膠顆粒凍干粉末ii；

(4)將步驟(1)制備得到的表面zeta電勢(shì)為-10～+10mv的明膠微凝膠顆粒分散在中性水溶液中，再與另一種表面zeta電勢(shì)在-10～+10mv的有機(jī)高分子顆粒分散液按照顆粒數(shù)比1:1000～1000:1共混，冷凍干燥，得明膠微凝膠顆粒凍干粉末ⅲ；

(5)明膠微凝膠顆粒凍干粉末i、明膠微凝膠顆粒凍干粉末ii或明膠微凝膠顆粒凍干粉末ⅲ分別與水性溶液共混，攪拌混合，得可注射型自愈合膠體凝膠；

其中，所述的帶正電荷的有機(jī)高分子顆粒的表面電荷為+5～+60mv，帶負(fù)電荷的有機(jī)高分子顆粒的表面電荷為-5～-60mv；所述有機(jī)高分子顆粒的直徑為20nm～500μm，優(yōu)選20nm～50μm。

本發(fā)明上述可注射型自愈合膠體凝膠的制備方法中，將步驟(1)制備得到的明膠微凝膠顆粒，冷凍干燥得到的明膠微凝膠顆粒凍干粉末與水性溶液共混，也可以得到本發(fā)明所述的可注射型自愈合膠體凝膠，但其性能差于本發(fā)明中其他方法制備得到的可注射型自愈合膠體凝膠。

本發(fā)明上述可注射型自愈合膠體凝膠的制備方法中，在步驟(1)中，根據(jù)調(diào)整明膠水溶液的濃度、極性有機(jī)溶劑的加入量、交聯(lián)反應(yīng)時(shí)間等，可以制備得到帶有不同zeta電勢(shì)和直徑大小的明膠微凝膠顆粒。本發(fā)明上述技術(shù)方案中，明膠水溶液濃度優(yōu)選為0.1～20w/v％，更優(yōu)選為2.5～10w/v％；極性有機(jī)溶劑的加入量?jī)?yōu)選為明膠水溶液的>2倍，更優(yōu)選為3～6倍。明膠微凝膠顆粒的尺寸優(yōu)選為20nm～5μm，更優(yōu)選為100nm～2000nm。

本發(fā)明上述可注射型自愈合膠體凝膠的制備方法中，步驟(2)、(3)和(4)中，明膠微凝膠顆粒的分散液和各有機(jī)高分子顆粒分散液中的顆粒數(shù)的比例影響所制備膠體凝膠的彈性模量和自修復(fù)效率，本發(fā)明中兩種分散液中顆粒數(shù)的比例優(yōu)選為1:10～10:1，更優(yōu)選為1:5～5:1，共混的兩種顆粒直徑比為1:5～5:1時(shí)，可得到具有更高彈性模量和自修復(fù)效率的可注射型自愈合凝膠，若直徑的差異過大，則所得到的膠體凝膠彈性模量下降，自修復(fù)效率降低。

進(jìn)一步地，在上述技術(shù)方案中，所述的帶正電荷的有機(jī)高分子顆粒分散液以殼聚糖、a型明膠、聚丙烯酰胺、聚(n-異丙基丙烯酰胺)、聚乙烯亞胺中的一種或幾種作為原料制備得到，所述的帶負(fù)電荷的有機(jī)高分子顆粒分散液以透明質(zhì)酸、海藻酸、a型明膠、b型明膠或聚丙烯酸中的一種或幾種作為原料制備得到，所述的表面zeta電勢(shì)在-10～+10mv的有機(jī)高分子顆粒分散液以膠原蛋白、白蛋白、明膠中的一種或幾種作為原料制備得到。所述帶正電荷的高分子顆粒分散液、帶負(fù)電荷的高分子顆粒分散液或表面zeta電勢(shì)在-10～+10mv的高分子顆粒分散液，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)高分子顆粒的常規(guī)制備技術(shù)來制備得到，在本申請(qǐng)中不再詳細(xì)陳述。

進(jìn)一步地，在上述技術(shù)方案中，在步驟(1)中所述的極性有機(jī)溶劑為甲醇、乙醇、異丙醇、丁醇、丙酮、乙腈、四氫呋喃中的一種或幾種的組合；所述的交聯(lián)劑為戊二醛、甘油醛、甲醛、碳二亞胺、二鹵代烷、異氰酸酯、二異氰酸酯、谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶、京尼平中的一種或幾種。

進(jìn)一步地，在上述技術(shù)方案中，在步驟(1)中所述的交聯(lián)反應(yīng)的反應(yīng)體系中交聯(lián)劑與明膠中氨基基團(tuán)的摩爾比>0.1；優(yōu)選0.5～5。交聯(lián)劑與明膠中氨基基團(tuán)的摩爾比影響所形成的明膠微凝膠顆粒的交聯(lián)度，交聯(lián)度過高明膠微流強(qiáng)度更高、表面電荷更傾向于帶負(fù)電，交聯(lián)度過低明膠微球強(qiáng)度低、表面電荷取決于明膠原料的等電點(diǎn)，本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案中交聯(lián)度較低時(shí)較為好，優(yōu)選的，本發(fā)明中所述交聯(lián)劑與明膠中氨基基團(tuán)的摩爾比要控制在0.5～5。

進(jìn)一步地，在上述技術(shù)方案中，在步驟(2)和步驟(3)中所述的酸性水溶液和堿性水溶液中所含有的離子濃度均小于200mm。所述的酸性水溶液和堿性水溶液中所含有的離子的種類不特別限定，可以采用本領(lǐng)域常規(guī)的用于調(diào)節(jié)酸性或堿性的試劑，如鹽酸、硫酸、醋酸、氫氧化鈣、氫氧化鉀、氨水、碳酸鈉等。

進(jìn)一步地，在上述技術(shù)方案中，在步驟(2)和步驟(3)中所述的ph調(diào)節(jié)劑包括酸性物質(zhì)和堿性物質(zhì)，所述酸性物質(zhì)為葡萄糖酸內(nèi)酯、hcl、hno3、h2so4中的一種或幾種，所述堿性物質(zhì)為尿素和脲酶的組合、或者氫氧化鈉、氫氧化鈣、氫氧化鉀、氨水中的一種或幾種。

進(jìn)一步地，在上述技術(shù)方案中，在步驟(5)中制備得到的可注射型自愈合膠體凝膠中膠體顆粒占膠體凝膠總體積的百分比為2.5vol％～150vol％，優(yōu)選50vol％～100vol％；膠體顆粒占凝膠總質(zhì)量的百分比為2.5wt％-50wt％，優(yōu)選10wt％～25wt％；相應(yīng)的膠體凝膠儲(chǔ)存(彈性)模量為1pa～100kpa，優(yōu)選1kpa～100kpa。

進(jìn)一步地，在上述技術(shù)方案中，在步驟(5)中所述的水性溶液是任意離子濃度<1000mm、ph值為5～9的水溶液、親水性高分子的水溶液、非水溶性的納米顆粒分散液中的一種或幾種的組合，優(yōu)選離子濃度<150mm，ph值為7。

本發(fā)明還提供一種可注射型自愈合凝膠載體，該凝膠載體是將本發(fā)明所述的方法制備得到的明膠微凝膠顆粒凍干粉末i、明膠微凝膠顆粒凍干粉末ii、明膠微凝膠顆粒凍干粉末ⅲ或可注射型自愈合膠體凝膠與含有生物活性物質(zhì)或活細(xì)胞的水性溶液按照一定比例共混而制備得到，所述的水性溶液的離子濃度優(yōu)選100～200mm，ph值優(yōu)選6.5～7.8。其中，所述的生物活性物質(zhì)為天然藥物成分、合成的化合物或蛋白類藥物分子，所述的活細(xì)胞選自原代培養(yǎng)細(xì)胞、傳代培養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)胞株培養(yǎng)細(xì)胞和雜合體中的一種。含有活細(xì)胞的水性溶液中細(xì)胞的濃度優(yōu)選為1～10⁹個(gè)/ml，所述的蛋白類藥物分子為骨形態(tài)發(fā)生蛋白、凝血viii因子、成血管生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、類胰島素生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、血小板來源增殖因子、生長(zhǎng)激素釋放抑制因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子tgfα和tgfβ、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、白細(xì)胞介素類生長(zhǎng)因子、紅細(xì)胞生長(zhǎng)素、集落刺激因子中的一種或幾種；成骨誘導(dǎo)因子，生長(zhǎng)因子、蛋白藥物的濃度在10ng/ml-1mg/ml范圍。加載有生物活性物質(zhì)的凝膠載體中，生物活性物質(zhì)在高分子微凝膠膠體料在注射和固化過程無需引入化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)，不同于化學(xué)高分子，也沒有引入小分子交聯(lián)劑，生物相容性好，可降解吸收，無毒副作用，安全性好，使其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用成為可能。

2.與傳統(tǒng)自愈合材料的區(qū)別

傳統(tǒng)自愈合材料主要分為兩類。一類是將包埋有交聯(lián)劑或交聯(lián)反應(yīng)引發(fā)劑的微膠囊分散在水凝膠的連續(xù)相網(wǎng)絡(luò)中，當(dāng)材料發(fā)生破壞，微膠囊在剪切力作用下破裂而釋放出交聯(lián)劑而誘發(fā)進(jìn)一步的交聯(lián)或固化反應(yīng)實(shí)現(xiàn)材料的自愈合；另一類是利用高分子間的物理相互作用構(gòu)建的水凝膠材料，基于分子鏈間可逆的物理交聯(lián)形成穩(wěn)定的凝膠網(wǎng)絡(luò)，當(dāng)材料受力被破壞后分子鏈間相互作用斷裂，但由于鍵合的可逆性，分子鏈間相互作用可以快速重建，實(shí)現(xiàn)材料的自愈合(cn201610538145.6)。

本發(fā)明的自愈合水凝膠是以微納米尺寸的微凝膠膠體顆粒為基本單元，通過利用膠體顆粒表面形成可逆的靜電作用和氫鍵作用，實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的凝膠網(wǎng)絡(luò)的制備，這樣以膠體顆粒為基本單元構(gòu)建的水凝膠體系成為膠體凝膠。這種膠體凝膠的自修復(fù)性能來源于微凝膠膠體顆粒間的可逆相互作用。當(dāng)凝膠被剪切力破壞時(shí)，膠體顆粒間物理鍵合斷裂，但隨著外力取消后，膠體顆粒重新分布排列，膠體間鍵合重新形成，使水凝膠重新恢復(fù)其結(jié)構(gòu)和力學(xué)強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)材料的自愈合。與傳統(tǒng)自愈合水凝膠依托分子鏈間的可逆鍵合不同，自愈合膠體凝膠是依托凝膠顆粒間的可逆相互作用實(shí)現(xiàn)自修復(fù)。

3.在蛋白釋放方面的優(yōu)勢(shì)

生物活性藥物，例如蛋白類大分子藥物的可控釋放一直是生物醫(yī)藥領(lǐng)域的難題。尤其是在組織工程應(yīng)用方面，生物活性分子，例如生長(zhǎng)因子、激素等蛋白藥物有著誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化和進(jìn)一步組織修復(fù)再生的功效。然而，這些生長(zhǎng)因子類蛋白藥物在體內(nèi)易失活，并且生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)細(xì)胞和組織修復(fù)再生的作用是與藥量和給藥時(shí)間緊密相關(guān)的。生長(zhǎng)因子的可控釋放有利于組織修復(fù)再生，反之則會(huì)出現(xiàn)不可控的副作用，包括組織增生肥大、異位成骨、甚至發(fā)生腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)。傳統(tǒng)的組織工程技術(shù)通常利用預(yù)加工好的支架材料，通過蛋白藥物在支架的表面物理吸附實(shí)現(xiàn)藥物的加載，這種方式往往導(dǎo)致支架植入體內(nèi)后，蛋白藥物的暴釋，不能實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期的持續(xù)的釋放。并且，由于蛋白藥物的快速不可控釋放，容易造成不可預(yù)期的負(fù)面效果。凍干溶脹過程中，在高滲透壓納米級(jí)的高分子網(wǎng)絡(luò)中，緩慢釋放，實(shí)現(xiàn)在植入部位中藥物緩釋，通過藥物持續(xù)的作用，提高治療效果。要加載活細(xì)胞時(shí)，將懸浮有活細(xì)胞的水性溶液按照適當(dāng)?shù)谋壤苯优c本發(fā)明的可注射型自愈合凝膠生物材料的凍干粉混合，得到加載活細(xì)胞的凝膠載體，活細(xì)胞分布在膠體凝膠內(nèi)部，膠體凝膠為細(xì)胞提供力學(xué)支撐和生長(zhǎng)繁殖的空間。加載生物活性物質(zhì)或活細(xì)胞的膠體凝膠可作為用于皮膚組織、骨軟骨組織、牙周組織等組織缺損修復(fù)填充和治療的可注射型組織工程支架材料、可植入填充材料來應(yīng)用，也可以作為3d生物打印墨水來應(yīng)用。

本發(fā)明還提供可用于多種不同藥物有序釋放的可注射型自愈合藥物載體，具體為：將不同交聯(lián)度的明膠微凝膠顆粒與不同蛋白藥物分子共混，經(jīng)冷凍干燥得到載有不同蛋白分子的微凝膠凍干粉末；再與水性溶液共混，并攪拌混合均勻，得到加載多種蛋白藥物分子且可有序釋放不同藥物分子的、可注射型自愈合藥物載體。

本發(fā)明的有益效果：

1.和傳統(tǒng)可注射材料的區(qū)別和優(yōu)勢(shì)：

傳統(tǒng)的可注射型水凝膠材料多數(shù)是基于高分子水凝膠的前驅(qū)體，在注射器中未發(fā)生聚合/交聯(lián)反應(yīng)，是具有良好流動(dòng)性的液體，因此具有良好的可注射性，當(dāng)水凝膠預(yù)聚體通過針管注射后，通過快速的化學(xué)交聯(lián)/聚合反應(yīng)實(shí)現(xiàn)預(yù)聚體水溶液的固化。例如專利cn105176080a報(bào)道了一種基于聚乙二醇水凝膠的可注射材料，是通過雙鍵和胺基的邁克爾加成反應(yīng)實(shí)現(xiàn)聚合物單體水溶液在注射后固化并形成水凝膠(cn201510452759.8)。這類由化學(xué)反應(yīng)誘導(dǎo)水凝膠固化的反應(yīng)在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用過程中由于難以避免引入化學(xué)交聯(lián)劑或催化劑，因此容易造成細(xì)胞毒性問題，限制了其作為生物醫(yī)用材料的應(yīng)用。

而本發(fā)明的可注射凝膠使用帶表面電荷的高分子微凝膠顆粒，通過顆粒間的靜電相互作用自組裝得到膠體凝膠材料。由于微凝膠之間的靜電作用是物理交聯(lián)且具有可逆性，因此當(dāng)這種膠體凝膠受到破壞性的剪切力破壞時(shí)，微凝膠顆粒間的靜電相互作用被外力破壞，膠體凝膠從具有剛性的固體材料向具有流動(dòng)性的流體材料轉(zhuǎn)變，這一過程被稱為剪切變稀行為。當(dāng)外力取消時(shí)，膠體間的相互作用快速恢復(fù)，膠體顆粒通過重新形成物理交聯(lián)組裝成膠體凝膠。因此本發(fā)明的膠體凝膠具有可注射性和自愈合性能。更重要的是，本發(fā)明的凝膠材

本發(fā)明的膠體凝膠材料對(duì)比與傳統(tǒng)載體材料具有更多優(yōu)勢(shì)。1)凝膠由具有微納米尺寸的微凝膠顆粒為基本單元，相比傳統(tǒng)多孔支架材料具有更高比表面積，因此可表面吸附的蛋白量更高；2)生長(zhǎng)因子的加載是將微凝膠顆粒的凍干粉直接與生長(zhǎng)因子水溶液共混，在顆粒溶脹過程中蛋白分子在滲透壓作用下進(jìn)入微凝膠顆粒網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部，因此蛋白的釋放主要是由微凝膠的降解速率控制的；3)生長(zhǎng)因子的釋放速率主要由明膠微凝膠的降解速率調(diào)控，因此通過控制微凝膠的交聯(lián)度可以實(shí)現(xiàn)對(duì)加載的生長(zhǎng)因子的釋放速率進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)一步將不同的生長(zhǎng)因子加載入不同交聯(lián)度的膠體顆粒，可以實(shí)現(xiàn)多種生長(zhǎng)因子的有序可控釋放。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1所述方法制備的a型明膠微凝膠顆粒的掃描電鏡照片。

圖2為實(shí)施例1所述方法制備的a型明膠微凝膠顆粒的激光粒度儀測(cè)試結(jié)果。

圖3為實(shí)施例2所述方法制備的由帶相反電荷的a型和b型明膠膠體顆粒組成的復(fù)合膠體凝膠的微觀結(jié)構(gòu)的掃描電鏡照片。

圖4為實(shí)施例2所述方法制備的由帶相反電荷的a型和b型明膠膠體顆粒組成的復(fù)合膠體凝膠的自修復(fù)行為的流變學(xué)測(cè)試結(jié)果。

圖5為實(shí)施例5中所述方法制備的可注射膠體凝膠實(shí)現(xiàn)生物活性蛋白藥物的有序釋放。

圖6為實(shí)施例6所述方法制備的載骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bmp-2)的自愈合膠體凝膠作為可注射型凝膠用于骨缺損的填充修復(fù)；其中，右圖①-④是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)手術(shù)過程制造的大鼠膝關(guān)節(jié)骨缺損，及使用本發(fā)明所述凝膠進(jìn)行填充修復(fù)的過程。

圖7為實(shí)施例6所述方法制備的載骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bmp-2)的自愈合膠體凝膠作為骨填充物用于大鼠膝關(guān)節(jié)骨缺損的修復(fù)填充，植入后4周骨再生的組織切片圖。虛線區(qū)域?yàn)楣侨睋p的位置。a：空白對(duì)照組，即制造圓柱狀缺損后不做任何處理；b：膠體凝膠組，即制造缺損后使用實(shí)施例5所述膠體凝膠進(jìn)行填充；c：載bmp-2膠體凝膠組，即制造缺損后使用載生長(zhǎng)因子bmp-2的膠體凝膠進(jìn)行填充修復(fù)。

圖8為實(shí)施例7所述的以明膠基膠體凝膠為3d打印墨水打印出的三維機(jī)構(gòu)支架的照片；其中，a：打印出的三維機(jī)構(gòu)支架整體圖，b和c為三維支架的顯微放大照片。

圖9為實(shí)施例7所述的包埋有細(xì)胞的明膠基膠體凝膠的激光共聚焦顯微圖片；其中，a：細(xì)胞分布在膠體凝膠中，b：細(xì)胞在微凝膠中的三維分布圖。

具體實(shí)施方式

下述非限制性實(shí)施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。下述實(shí)施例中，如無特殊說明，所使用的實(shí)驗(yàn)方法均為常規(guī)方法，所用材料、試劑等均可從生物或化學(xué)公司購買。

下面實(shí)施例中將膠體顆粒冷凍干燥后得各膠體顆粒的凍干粉末，其中所述冷凍干燥條件為：將膠體顆粒在-60℃、<300pa下冷凍干燥2-3天。

實(shí)施例1

以a型明膠為原料，使其在去離子水中加熱40℃溶解，配置濃度為5w/v％的明膠水溶液，調(diào)節(jié)明膠水溶液ph值為3，隨后向溶液中加入3倍溶液體積的丙酮，生成明膠微凝膠顆粒的分散液；分別向分散液中加入不同量的25wt％戊二醛水溶液，使明膠微凝膠顆粒交聯(lián)，加入戊二醛的量分別為每克明膠對(duì)應(yīng)25wt％戊二醛66μl、132μl、264μl、538μl，交聯(lián)反應(yīng)時(shí)間12hr，隨后加入甘氨酸中和未反應(yīng)的醛基，離心清洗得到a型明膠微凝膠顆粒的分散液。

使用激光粒度儀對(duì)在使用不同交聯(lián)劑用量制備的a型明膠顆粒進(jìn)行顆粒尺寸分析，結(jié)果如表1所示。

表1.a型明膠顆粒尺寸和顆粒表面zeta電勢(shì)隨著戊二醛加入量的變化

圖1為在上述方法中戊二醛加入量為264μl時(shí)的a型明膠微凝膠顆粒的掃描電鏡照片，可見顆粒尺寸分別較均勻，70％以上的顆粒尺寸在200-400nm范圍內(nèi)，比使用激光粒度儀測(cè)試的顆粒尺寸小，這是因?yàn)槔鋬龈稍锖竺髂z顆粒發(fā)生干燥收縮引起的。

圖2為在上述方法中戊二醛加入量為264μl時(shí)的a型明膠微凝膠顆粒的激光粒度儀測(cè)試結(jié)果，可見這一制備參數(shù)得到的明膠膠體顆粒的平均粒徑為376.9±6.5nm，且粒徑分布窄。

實(shí)施例2

分別以a型明膠和b型明膠為原料，使其在去離子水中，在加熱40℃下溶解，配置得到濃度為5w/v％的a型明膠水溶液和濃度為5w/v％的b型明膠水溶液，調(diào)節(jié)兩種明膠水溶液ph值均為3，隨后向溶液中各加入3倍體積的丙酮，生成a型明膠和b型明膠微凝膠顆粒懸浮液；分別向懸浮液中加入25wt％戊二醛水溶液，使明膠微凝膠顆粒交聯(lián)，加入戊二醛的量為每g明膠對(duì)應(yīng)25wt％戊二醛66μl，交聯(lián)反應(yīng)時(shí)間12hr，隨后加入甘氨酸中和未反應(yīng)的醛基，離心清洗分別得到a型明膠顆粒分散液和b型明膠顆粒分散液。利用激光粒度儀測(cè)得制備微凝膠顆粒尺寸和zeta電勢(shì)數(shù)據(jù)如表2所示。經(jīng)冷凍干燥分別得到a型明膠顆粒的凍干粉末(標(biāo)記為gela)和b型明膠顆粒的凍干粉末(標(biāo)記為gelb)。

表2.不同類型明膠顆粒的性能參數(shù)

將gela和gelb分別分散在20mm的naoh堿性水溶液中，分別得到分散有帶正電荷的a型明膠微凝膠顆粒分散液和帶負(fù)電荷的b型明膠微凝膠顆粒的分散液，按照a型明膠顆粒和b型明膠顆粒的顆粒數(shù)量比為1:1將所述兩種明膠的分散液充分混合、攪拌，得分散有兩種不同微凝膠顆粒的分散液；向分散液中加入100mm的鹽酸調(diào)節(jié)ph值至7.0，攪拌混合，冷凍干燥，得到含有兩種不同膠體顆粒的凍干粉末，標(biāo)記為gela+b。通過掃描電鏡觀察到膠體凝膠的微觀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)如圖3所示，膠體凝膠具有多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，且凝膠網(wǎng)絡(luò)由明膠微球組裝堆積而成。

分別將gela、gelb、和gela+b膠體顆粒凍干粉末與不同體積的1mm的nacl鹽溶液共混，并快速攪拌混合均勻得到三種不同可注射型自愈合膠體凝膠，得到含不同微凝膠膠體顆粒體積分?jǐn)?shù)的膠體凝膠。進(jìn)一步通過流變儀對(duì)所得凝膠材料的彈性模量(表3)和剪切破壞后自愈合效率(表4)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

膠體凝膠的自修復(fù)行為是通過流變儀進(jìn)行表征，具體測(cè)試方法如下。對(duì)膠體凝膠進(jìn)行連續(xù)的流變測(cè)試：首先進(jìn)行震蕩時(shí)間掃描，對(duì)樣品施加頻率為1hz和應(yīng)變?yōu)?.5％的外力，測(cè)試樣品的彈性模量(g’)和粘性模量(g”)，此時(shí)凝膠在低剪切力情況下表現(xiàn)出固體的剛性行為，因此彈性模量g’大于粘性模量g”且保持穩(wěn)定。這一階段的g’值即為樣品的初始彈性模量。隨后逐漸增加施加的應(yīng)變從0.1％至1000％，此過程中通過施加外力將樣品破壞，彈性模量g’逐漸降低，最終低于g”，即膠體體系從剛性固體向粘性流體發(fā)生轉(zhuǎn)變，結(jié)構(gòu)被破壞。隨后立即取消外力作用，考察樣品彈性模量的恢復(fù)情況。將外力釋放后，樣品恢復(fù)的彈性模量與其初始彈性模量的百分比(％)定量考察凝膠的自修復(fù)效率。

表3和表4顯示，兩種帶相反電荷的膠體顆粒共混的膠體凝膠gela+b的彈性模量最高，剪切破壞后5分鐘內(nèi)自愈合效率最高，彈性模量恢復(fù)率超過80％。并且這樣自修復(fù)行為可以反復(fù)發(fā)生：在對(duì)樣品施加多個(gè)循環(huán)的剪切破壞過程中，每次取消外力后，凝膠的彈性模量都會(huì)快速恢復(fù)，并恢復(fù)到初始彈性模量的80％以上(如圖4所示)。

表3.實(shí)施例2中制備的不同膠體凝膠含有不同體積分?jǐn)?shù)的微凝膠顆粒所得到凝膠材料的彈性模量g'

表4.實(shí)施例2中制備的不同膠體凝膠不同體積分?jǐn)?shù)的微凝膠顆粒所得的凝膠材料的自修復(fù)效率

*注：自修復(fù)效率是采用1000％的應(yīng)變持續(xù)你剪切凝膠材料60s后，檢測(cè)應(yīng)力釋放后5min內(nèi)的彈性模量恢復(fù)的百分比(％)。

實(shí)施例3

以a型明膠為原料，在加熱40℃下溶解，配置得到濃度為5w/v％的a型明膠水溶液，調(diào)節(jié)ph值為11，隨后向溶液中各加入3.5倍體積的乙醇，生成a型明膠微凝膠顆粒懸浮液；向懸浮液中加入25wt％戊二醛水溶液，使明膠微凝膠顆粒交聯(lián)，加入戊二醛的量為每g明膠對(duì)應(yīng)25wt％戊二醛66μl，交聯(lián)反應(yīng)時(shí)間12hr，得到a型明膠微凝膠顆粒，顆粒尺寸和表面zeta點(diǎn)位參數(shù)如表5所示。

通過乳液法制備海藻酸微凝膠顆粒，具體制備方法如下：將1wt％的海藻酸鈉的水溶液加入氯化鈣水溶液中并持續(xù)高速攪拌(攪拌速度>5000rpm)，即得到海藻酸鈣顆粒，顆粒尺寸和表面zeta點(diǎn)位參數(shù)如表5所示。將a型明膠和海藻酸鈣微凝膠顆粒分別分散在10mm的醋酸酸性水溶液中，分別得到帶正電荷的a型明膠微凝膠顆粒的分散液ⅰ、帶負(fù)電荷的海藻酸微凝膠顆粒的分散液ⅱ，將分散液ⅰ和分散液ⅱ充分混合、攪拌，得分散液iii，其中a型明膠和海藻酸微凝膠顆?；旌系念w粒數(shù)量比為2:1；向分散液iii中加入100mm的氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph值至7.0，攪拌混合，冷凍干燥，得到混有兩相不同膠體顆粒的凍干粉末。將上述微凝膠顆粒凍干粉末與一定體積的1mm的nacl鹽溶液共混，并快速攪拌混合均勻得到自愈合膠體凝膠，其中微凝膠膠體顆粒體積分?jǐn)?shù)占膠體凝膠體積的50vol％或100vol％。使用流變儀對(duì)膠體凝膠的力學(xué)參數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果如表6所示，帶相反電荷的海藻酸鈣和a型明膠膠體顆粒共混得到的膠體凝膠的彈性模量隨著膠體顆粒體積分?jǐn)?shù)的增加而增加，體積分?jǐn)?shù)100vol％時(shí)，儲(chǔ)存(彈性)模量g’超過12kpa。剪切破壞后5分鐘內(nèi)自愈合效率同樣隨著膠體顆粒體積分?jǐn)?shù)的增加而增加，體積分?jǐn)?shù)100vol％時(shí)，彈性模量g’自愈合效率超過80％。

將上述膠體凝膠利用成標(biāo)準(zhǔn)抗拉(gb/t1040-1992)和抗壓(gb/t1041-1992)測(cè)試的標(biāo)準(zhǔn)樣條，對(duì)凝膠剪切破壞自修復(fù)前后進(jìn)行抗拉和抗壓測(cè)試，結(jié)果如表7所示。

表5.實(shí)施例3中制備的a型明膠和海藻酸鈣微凝膠的性能參數(shù)

表6.實(shí)施例3中制備的自愈合膠體凝膠在不同膠體體積分?jǐn)?shù)情況下的力學(xué)強(qiáng)度(流變測(cè)試彈性模量g')和自愈合效率。

*注：自修復(fù)效率是采用1000％的應(yīng)變持續(xù)你剪切凝膠材料60s后，檢測(cè)應(yīng)力釋放后5min內(nèi)的彈性模量恢復(fù)的百分比(％)。

表7.對(duì)實(shí)施例3中制備的自愈合膠體凝膠的剪切破壞前后凝膠自愈合行為的力學(xué)性能

表7中的自愈合前是指對(duì)凝膠剪切破壞之前；自愈合后是指對(duì)凝膠剪切破壞后愈合。

實(shí)施例4

以a型明膠為原料，在加熱40℃下溶解，配置得到濃度為10w/v％的a型明膠水溶液，調(diào)節(jié)ph值為11，隨后向溶液中各加入2倍體積的乙醇，生成a型明膠微凝膠顆粒懸浮液；向懸浮液中加入25wt％戊二醛水溶液，使明膠微凝膠顆粒交聯(lián)，加入戊二醛的量為每g明膠對(duì)應(yīng)25wt％戊二醛264μl，交聯(lián)反應(yīng)時(shí)間12hr，反復(fù)離心并在去離子水中重懸，得到a型明膠微凝膠顆粒，顆粒尺寸和表面zeta點(diǎn)位參數(shù)如表8所示。

將聚乙二醇(peg，分子量2kda)溶于去離子水配置濃度為5w/v％peg水溶液。將上述方法制備的a型明膠微凝膠顆粒分散得到的peg水溶液中，進(jìn)一步將peg水溶液與a型明膠微凝膠分散液充分共混，攪拌，得分散液iii，其中a型明膠微凝膠顆粒與peg的質(zhì)量比為1:2。隨后將分散液iii的ph值調(diào)節(jié)至7.0，然后冷凍干燥，得到a型明膠膠體顆粒和peg的復(fù)合凍干粉末。將上述凍干粉末與一定體積的10mm的nacl鹽溶液共混，并快速攪拌混合均勻得到自愈合膠體凝膠，其中明膠微凝膠顆粒體積分?jǐn)?shù)占自愈合凝膠體積分?jǐn)?shù)為100vol％。使用流變儀對(duì)膠體凝膠的力學(xué)參數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果如表9所示，當(dāng)膠體凝膠中a型明膠膠體顆粒體積分?jǐn)?shù)為100vol％時(shí)，儲(chǔ)存(彈性)模量g’約19kpa。剪切破壞后5分鐘內(nèi)自愈合效率在膠體顆粒體積分?jǐn)?shù)為100vol％時(shí)，彈性模量g’自愈合效率約為83％。

表8.實(shí)施例4中制備的a型明膠微凝膠顆粒的性能參數(shù)

表9.實(shí)施例4中制備的a型明膠微凝膠顆粒和peg共混制備的自愈合凝膠的力學(xué)強(qiáng)度(流變測(cè)試彈性模量g')和自愈合效率。

*注：自修復(fù)效率是采用1000％的應(yīng)變持續(xù)你剪切凝膠材料60s后，檢測(cè)應(yīng)力釋放后5min內(nèi)的彈性模量恢復(fù)的百分比(％)。

實(shí)施例5

以a型明膠為原料，通過實(shí)施例2所述反溶劑法制備a型明膠微凝膠顆粒，戊二醛交聯(lián)濃度為每g明膠使用25wt％戊二醛的量為66μl，制備得到帶正電荷的a型明膠微凝膠顆粒；以b型明膠為原料，通過實(shí)施例2所述的反溶劑法制備b型明膠微凝膠顆粒，其中戊二醛交聯(lián)濃度為每g明膠使用25wt％戊二醛的量為264μl，制備得到帶負(fù)電荷的b型明膠微凝膠顆粒，制備參數(shù)和所得微凝膠顆粒尺寸和zeta點(diǎn)位數(shù)據(jù)如表10。

表10.實(shí)施例5中制備的不同類型明膠微凝膠顆粒的性能參數(shù)

將a型明膠顆粒分散在含100ng/ml濃度的堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bfgf)的水溶液中，將b型明膠顆粒分散在含100ng/ml濃度的股形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bmp-2)的水溶液中，分別得到載有bfgf的a型明膠顆粒和載有bmp-2的b型明膠微凝膠顆粒的分散液。將上述兩種明膠顆粒分散液按照顆粒數(shù)比1:1充分混合，并冷凍干燥，得到載有不同生長(zhǎng)因子的兩種明膠顆粒凍干粉末。將上述微凝膠顆粒凍干粉末與一定體積的1mm的nacl鹽溶液共混，并快速攪拌混合均勻，得到載有不同生長(zhǎng)因子的、可注射型自愈合膠體凝膠，其中微凝膠膠體顆粒體積分?jǐn)?shù)占膠體凝膠體積的100vol％。兩種不同的生長(zhǎng)因子從膠體凝膠載體材料中體外釋放動(dòng)力學(xué)的釋放曲線如圖5所示，載有bfgf的a型明膠由于交聯(lián)度低降解速率較快，因此bfgf釋放速率較快，載有bmp-2的b型明膠由于交聯(lián)度高降解速率慢，因此bmp-2釋放速率較為緩慢；結(jié)果表明本發(fā)明所述的膠體凝膠可實(shí)現(xiàn)不同生長(zhǎng)因子藥物的有序釋放。

實(shí)施例6動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

分別以a型明膠或b型明膠為原料，使其在去離子水中加熱40℃溶解，配置濃度為5w/v％的a型明膠水溶液和b型明膠水溶液，調(diào)節(jié)明膠水溶液ph值為11，隨后向溶液中加入4倍體積的丙酮，生成明膠微凝膠顆粒的分散液；分別向分散液中加入25wt％戊二醛水溶液，使明膠微凝膠顆粒交聯(lián)，加入戊二醛的量為每g明膠對(duì)應(yīng)25wt％戊二醛132μl，交聯(lián)反應(yīng)時(shí)間12hr，隨后加入賴氨酸中和未反應(yīng)的醛基，離心清洗分別得到a型明膠和b型明膠微凝膠顆粒的分散液。將a型明膠和b型明膠微凝膠顆粒分別分散在20mm的鹽酸水溶液中，分別得到分散有帶正電荷的a型明膠微凝膠顆粒分散液和帶負(fù)電荷的b型明膠微凝膠顆粒分散液，將兩者充分混合、攪拌，得分散有兩種不同微凝膠顆粒的分散液，其中a型明膠和b型明膠混合的顆粒數(shù)量比為1:1；向分散液中加入80mm的碳酸氫鈉調(diào)節(jié)ph值至7.0，攪拌混合，冷凍干燥，得到含有兩種不同膠體顆粒的凍干粉末。將上述膠體顆粒凍干粉末與一定體積的磷酸緩沖溶液pbs共混，并快速攪拌混合均勻得到可注射型自愈合膠體凝膠，凝膠中膠體顆粒占凝膠總體積的百分比為75vol％。

以大鼠膝關(guān)節(jié)5mm直徑骨缺損為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，通過手術(shù)將制備得到的所述可注射型自愈合膠體凝膠作為填充物，直接用于骨缺損的填充修復(fù)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程如圖6所示，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明本專利所述可注射型膠體凝膠可作為組織器官修復(fù)填充材料用于組織器官的修復(fù)再生。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示?？瞻讓?duì)照組是制造直徑為5mm的圓柱狀缺損后不做任何處理，4周后的缺損部位組織切片圖，結(jié)果顯示：由于制造的缺損是非極限缺損，動(dòng)物自身的骨修復(fù)能力可以實(shí)現(xiàn)一定程度的骨修復(fù)，組織切片圖顯示骨組織有一定程度的修復(fù)。膠體凝膠組，即為制造缺損后，使用膠體凝膠進(jìn)行填充修復(fù)，由于凝膠存在是骨組織自身的修復(fù)受到限制，因此缺損中心部位可見大量的纖維組織長(zhǎng)入，4周后仍未實(shí)現(xiàn)骨缺損的修復(fù)重建。載bmp-2膠體凝膠組，即制造缺損后使用載生長(zhǎng)因子bmp-2的膠體凝膠進(jìn)行填充修復(fù)，由于膠體凝膠可實(shí)現(xiàn)生長(zhǎng)因子的局部緩釋，有骨誘導(dǎo)的作用，因此組織切片結(jié)果顯示4周后骨缺損部位完全實(shí)現(xiàn)了骨修復(fù)。

實(shí)施例7作為3d打印生物墨水的應(yīng)用

以a型明膠為原料，使其在去離子水中加熱40℃溶解，配置濃度為5w/v％的明膠水溶液，調(diào)節(jié)明膠水溶液ph值為10，隨后向溶液中加入3.5倍體積的異丙醇，生成明膠微凝膠顆粒的分散液；向分散液中加入25wt％戊二醛水溶液，使明膠微凝膠顆粒交聯(lián)，加入戊二醛的量為每g明膠對(duì)應(yīng)25wt％戊二醛132μl，交聯(lián)反應(yīng)時(shí)間12hr，隨后加入甘氨酸中和未反應(yīng)的醛基，離心清洗，得到表面zeta電勢(shì)為正的a型明膠微凝膠顆粒。同樣方法，以b型明膠為原料制備得到表面zeta電勢(shì)為負(fù)的b型明膠微凝膠顆粒。將a型明膠和b型明膠微凝膠顆粒分別分散在20mm的naoh水溶液中，分別得到分散有帶正電荷的a型明膠微凝膠顆粒和帶負(fù)電荷的b型明膠微凝膠顆粒的分散液，將兩者充分混合、攪拌，得分散有兩種不同微凝膠顆粒的分散液，其中a型明膠和b型明膠混合的顆粒數(shù)量比為1:1；向分散液中加入100mm的鹽酸調(diào)節(jié)ph值至7.0，攪拌混合，冷凍干燥，得到含有兩種不同明膠膠體顆粒的凍干粉末。將上述混合物凍干粉末與磷酸緩沖液pbs共混，并快速攪拌混合均勻得到可注射型自愈合膠體凝膠。其中膠體凝膠中明膠膠體顆粒占凝膠總體積的百分比為100w/v％。

以上述方法制備的膠體凝膠作為細(xì)胞三維包埋和培養(yǎng)的支架材料，制備載細(xì)胞3d打印“生物墨水”。具體實(shí)施步驟如下：

(i)細(xì)胞培養(yǎng)：以nih3t3(crl-1658^tm)成纖維細(xì)胞培養(yǎng)為例，在增殖培養(yǎng)基(dmem，含有10％的胎牛血清(fbs，gibco)中，在37℃，95％相對(duì)濕度和5％co2。細(xì)胞培養(yǎng)基每三天后更換。使用前，將細(xì)胞用磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)，使用胰蛋白酶/edta溶液中分離(0.25％的胰蛋白酶/0.02％edta)5分鐘，并懸浮于培養(yǎng)基中以備使用。

(ii)載細(xì)胞膠體凝膠的制備：將分散有細(xì)胞的細(xì)胞懸液與上述膠體凝膠混合均勻，從而得到膠體顆粒體積分?jǐn)?shù)為75％的載有活體細(xì)胞的復(fù)合膠體凝膠，凝膠中細(xì)胞濃度為5×10⁵個(gè)/cm³。將上述制備的載細(xì)胞明膠基可注射凝膠使用擠注式生物3d打印機(jī)(沈陽尚賢organp1800)進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)的打印，結(jié)果如圖8所示。結(jié)果表明，本發(fā)明所述的自愈合膠體凝膠可作為3d生物打印的“墨水”材料，制備打印精度為500μm的三維機(jī)構(gòu)支架。

通過使用死活熒光染色(live/dead熒光染色)對(duì)凝膠材料的細(xì)胞毒性進(jìn)行考察。為此，染色前用無菌pbs清洗30分鐘，在室溫下加入2mm鈣黃綠素(綠色熒光標(biāo)記活細(xì)胞)和4mm乙錠同型二聚體(紅色熒光標(biāo)記死細(xì)胞)，并使用共聚焦激光掃描顯微鏡檢查。結(jié)果如圖9所示，nih/3t3成纖維細(xì)胞在明膠基膠體凝膠內(nèi)部均勻分散，且熒光染色顯示包埋細(xì)胞的存活率>90％，證實(shí)使用本發(fā)明所述膠體凝膠作為細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行生物3d打印能保持細(xì)胞的生物活性和正常功能。