本發(fā)明涉及抗體和適體，尤其涉及一種雙特異性納米抗體-核酸適體偶聯(lián)物、衍生物、及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、雙特異性抗體作為一種創(chuàng)新的治療藥物，具有能夠同時(shí)結(jié)合兩個(gè)抗原或兩個(gè)不同表位的特點(diǎn)，這可以增強(qiáng)靶向性，減少免疫逃逸，并抑制疾病的發(fā)展。然而，盡管已取得一定的成功，但雙特異性抗體仍然面臨一些挑戰(zhàn)，包括制備工藝復(fù)雜、成本高、穩(wěn)定性差、組織穿透力差和免疫原性高等缺點(diǎn)。這些挑戰(zhàn)限制了雙特異性抗體在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用。因此迫切需要發(fā)展一種易于合成且腫瘤穿透能力強(qiáng)的雙特異性分子。

2、納米抗體是一種由駱駝體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的重鏈抗體的抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域，具有小尺寸、低免疫原性。它能夠滲透腫瘤組織更為高效，并可以結(jié)合傳統(tǒng)抗體無(wú)法進(jìn)入的位點(diǎn)，具有制備簡(jiǎn)單且穩(wěn)定，易于進(jìn)行化學(xué)修飾等特點(diǎn)。這為納米抗體在生物醫(yī)學(xué)研究和臨床應(yīng)用中展現(xiàn)出廣闊的潛力，并有望為更有效的治療策略提供新的可能性。

3、核酸適體是一種被稱為“化學(xué)抗體”的分子，由單鏈核酸(如dna或rna)構(gòu)成。它們特異性地與目標(biāo)分子結(jié)合，類似于抗體與抗原的結(jié)合。核酸適體具有多種優(yōu)點(diǎn)，包括高度特異性、穩(wěn)定性和合成簡(jiǎn)單等。它們被廣泛應(yīng)用于檢測(cè)、診斷和治療多種疾病。

4、非專利文獻(xiàn)《bispecific?aptamer?induced?artificial?protein-pairing：astrategy?for?selective?inhibition?of?receptor?function》公開(kāi)了雙特異性適配體探針作為分子介質(zhì)與目標(biāo)受體蛋白和配對(duì)蛋白結(jié)合，從而使兩種蛋白在細(xì)胞膜上緊密結(jié)合。配對(duì)蛋白不僅可以作為癌癥生物標(biāo)志物，增強(qiáng)細(xì)胞的選擇性，還可通過(guò)強(qiáng)大的立體阻礙作用抑制靶受體功能。與單適配體介導(dǎo)的調(diào)控相比，雙特異性適配體探針在選擇性和高效調(diào)控受體功能及下游限號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面有很大改進(jìn)。但關(guān)于雙特異性納米抗體-核酸適體尚未有公開(kāi)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中所存在的不足，本發(fā)明提供了一種雙特異性納米抗體-核酸適體偶聯(lián)物、衍生物、及其制備方法與應(yīng)用。其解決了現(xiàn)有技術(shù)中存在的容易脫靶、穩(wěn)定性差、制造復(fù)雜、腫瘤穿透性不足和非特異性效應(yīng)的問(wèn)題。

2、本發(fā)明一方面，提供一種雙特異性納米抗體—核酸適體偶聯(lián)物，包括納米抗體和核酸適體，所述納米抗體和核酸適體通過(guò)共價(jià)連接形成雙特異性納米抗體—核酸適體偶聯(lián)物；

3、所述納米抗體靶向第一靶標(biāo)受體，所述核酸適體靶向第二靶標(biāo)受體，所述第一靶標(biāo)受體和第二靶標(biāo)受體不同。

4、本發(fā)明一實(shí)施例中，所述第一靶標(biāo)受體和/或第二靶標(biāo)受體為細(xì)胞膜上的跨膜蛋白；更優(yōu)選地，所述第一靶標(biāo)受體和/或第二靶標(biāo)受體為腫瘤細(xì)胞膜上的跨膜蛋白，所述腫瘤細(xì)胞膜上的跨膜蛋白的表達(dá)量高于正常細(xì)胞膜上的跨膜蛋白的表達(dá)量；

5、優(yōu)選地，所述第一靶標(biāo)受體和/或第二靶標(biāo)受體的受體激活方式為配體依賴的受體二聚化、寡聚化或多聚化；

6、優(yōu)選地，所述雙特異性納米抗體—核酸適體偶聯(lián)物與第一靶標(biāo)受體、第二靶標(biāo)受體結(jié)合后，可使第一靶標(biāo)受體和第二靶標(biāo)受體的空間距離縮小至形成阻礙所述第一靶標(biāo)受體或第二靶標(biāo)受體激活的空間位阻；更優(yōu)選地，所述雙特異性納米抗體—核酸適體偶聯(lián)物與第一靶標(biāo)受體、第二靶標(biāo)受體結(jié)合后，可使第一靶標(biāo)受體和第二靶標(biāo)受體的空間距離縮小至形成異二聚體。

7、本發(fā)明一實(shí)施例中，所述納米抗體和所述核酸適體通過(guò)連接子共價(jià)連接；

8、優(yōu)選地，所述連接子包括含腙鍵連接子、含二硫(硒)鍵連接子、含硼酸酯連接子、含硫縮酮連接子、偶氮苯、偶氮化小分子、四嗪-聚乙二醇-巰基；

9、本發(fā)明一實(shí)施例中，所述納米抗體經(jīng)第一修飾基團(tuán)修飾；

10、優(yōu)選地，第一修飾基團(tuán)包括純化標(biāo)簽、短肽標(biāo)簽；更優(yōu)選地，所述純化標(biāo)簽包括his標(biāo)簽、gst標(biāo)簽、strep標(biāo)簽；所述短肽標(biāo)簽包括谷氨酰胺標(biāo)簽；進(jìn)一步優(yōu)選，所述谷氨酰胺標(biāo)簽包括疊氮基團(tuán)。

11、本發(fā)明一實(shí)施例中，所述核酸適體經(jīng)第二修飾基團(tuán)修飾；

12、優(yōu)選地，所述第二修飾基團(tuán)包括馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)、四嗪基團(tuán)、反式環(huán)辛烯基團(tuán)、巰基基團(tuán)、疊氮基團(tuán)、二苯并環(huán)辛炔。

13、本發(fā)明一具體實(shí)施例中，所述納米抗體的氨基酸序列如seq?id?no:1所示；

14、所述連接子為氨基-聚乙二醇-疊氮；

15、所述核酸適體的核苷酸序列序列如seq?id?no:3所示。

16、本發(fā)明第二方面，提供所述雙特異性納米抗體—核酸適體偶聯(lián)物的制備方法，包括將所述納米抗體與所述核酸適體通過(guò)連接子共價(jià)連接形成所述雙特異性納米抗體—核酸適體偶聯(lián)物。

17、優(yōu)選地，所述納米抗體和核酸適體通過(guò)微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶和點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行共價(jià)連接。

18、本發(fā)明一實(shí)施例中，所述納米抗體：連接子：核酸適體的摩爾比為1∶10～50∶1.2～5。例如，可以為1∶10∶1.2、1∶20∶1.2、1∶30∶1.2、1∶40∶1.2、1∶50∶1.2、1∶10∶2、1∶10∶3、1∶10∶4、1∶10∶5、1∶20∶2、1∶20∶3、1∶20∶4、1∶20∶5、1∶30∶2、1∶30∶3、1∶30∶4、1∶30∶5、1∶40∶2、1∶40∶3、1∶40∶4、1∶40∶5、1∶50∶2、1∶50∶3、1∶50∶4、1∶50∶5；優(yōu)選為1∶50∶1.2。

19、本發(fā)明第三方面，提供一種雙特異性納米抗體—核酸適體偶聯(lián)物衍生物，包括對(duì)上述的雙特異性納米抗體—核酸適體偶聯(lián)物進(jìn)行修飾或偶聯(lián)改造，得到與所述的雙特異性納米抗體—核酸適體偶聯(lián)物具有相同功能的衍生物。

20、優(yōu)選地，所述修飾包括磷酸化、甲基化、氨基化、巰基化、同位素化、氟化、用硫取代氧、用硒取代氧等；優(yōu)選地，所述偶聯(lián)改造包括雙特異性納米抗體—核酸適體偶聯(lián)熒光素、雙特異性納米抗體—核酸適體偶聯(lián)核素、雙特異性納米抗體—核酸適體偶聯(lián)反義核酸藥物等。

21、本發(fā)明第四方面，提供一種組合物，包括上述的雙特異性納米抗體—核酸適體偶聯(lián)物或上述的雙特異性納米抗體—核酸適體偶聯(lián)物衍生物。

22、本發(fā)明一實(shí)施例中，所述組合物還包括抗腫瘤藥物；優(yōu)選地，所述抗腫瘤藥物為dox。

23、本發(fā)明第四方面，提供所述雙特異性納米抗體—核酸適體偶聯(lián)物、所述雙特異性納米抗體—核酸適體偶聯(lián)物衍生物在制備藥物中的應(yīng)用，所述藥物可用于抗腫瘤細(xì)胞增殖、抗腫瘤轉(zhuǎn)移、解除免疫細(xì)胞抑制、蛋白功能調(diào)控或生物成像；

24、優(yōu)選地，所述雙特異性納米抗體—核酸適體偶聯(lián)物或其衍生物與抗腫瘤藥物聯(lián)合用藥。

25、相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下有益效果：

26、(1)結(jié)合納米抗體和核酸適體的獨(dú)特特性，本發(fā)明首次提出一種新型雙特異性分子，納米抗體—核酸適體偶聯(lián)物，不僅具有高選擇性，高親和力，同時(shí)還兼具合成簡(jiǎn)單快速，穩(wěn)定性強(qiáng)，組織穿透力強(qiáng)，免疫原性弱等多種優(yōu)點(diǎn)，一定程度上解決了雙特異性抗體目前所存在的問(wèn)題，有望成為癌癥治療領(lǐng)域的有效藥物，推動(dòng)個(gè)性化治療的發(fā)展。解決了傳統(tǒng)抗體在癌癥治療中面臨的常見(jiàn)挑戰(zhàn)，包括穩(wěn)定性差、制造復(fù)雜、腫瘤穿透性不足和非特異性效應(yīng)。

27、(2)在本發(fā)明通過(guò)使用微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶和點(diǎn)擊化學(xué)方法實(shí)現(xiàn)了納米抗體和核酸適體的位點(diǎn)特異性結(jié)合。

28、(3)作為概念驗(yàn)證，cd47-met?nanotamer已經(jīng)構(gòu)建成功，并在體外展示了人工蛋白調(diào)控能力，并有效阻斷了met受體的功能，在體內(nèi)實(shí)體腫瘤中展示了有效的腫瘤滲透和改善化療效果的能力，顯著抑制了腫瘤的生長(zhǎng)。更加重要的是，納米抗體和核酸適體的多樣性表明它們?cè)诙ㄖ苹委煵煌┌Y類型和實(shí)現(xiàn)各種治療目標(biāo)方面具有很大潛力。

29、技術(shù)術(shù)語(yǔ)：

30、所述cd47-sirpα是指在非惡性細(xì)胞和多種癌細(xì)胞表面表達(dá)的cd47與髓系細(xì)胞(尤其是巨噬細(xì)胞)上的sirpα跨膜蛋白結(jié)合，形成的cd47-sirpα信號(hào)復(fù)合物。sirpα的細(xì)胞外igv結(jié)構(gòu)域與cd47結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)itim基序上的酪氨酸磷酸化；sirpα也與含有酪氨酸磷酸酶的sh2結(jié)構(gòu)域結(jié)合，這兩種信號(hào)都能抑制肌球蛋白iia在吞噬突觸中的積累，并促進(jìn)“不要吃我”信號(hào)的釋放，這些信號(hào)抑制巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用，保護(hù)正常細(xì)胞免受免疫系統(tǒng)的損害。相反，當(dāng)cd47的表面表達(dá)減少時(shí)，cd47-sirpα信號(hào)通路減弱，巨噬細(xì)胞可以向這些細(xì)胞移動(dòng)并吞噬它們。cd47及其配體不僅調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，還介導(dǎo)各種病理生理過(guò)程，如中性粒細(xì)胞趨化和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，并在免疫耐受和t細(xì)胞活化中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

31、所述納米抗體具有結(jié)合細(xì)胞表面蛋白質(zhì)或細(xì)胞表面標(biāo)志物的能力。在一些實(shí)施方案中，納米抗體含caplacizumab、ozoralizumab、ciltacabtagene?autoleucel、sonelokimab、sar-442970等藥物，或者indi網(wǎng)站(http://naturalantibody.com/nanobodies)上公布的納米抗體序列。在一些實(shí)施方案中，納米抗體含seq?id?no:1所示的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，納米抗體包含與本文提供的氨基酸序列共有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性的氨基酸序列。

32、所述核酸適體(也稱適配體)具有結(jié)合細(xì)胞表面蛋白質(zhì)或細(xì)胞表面標(biāo)志物的能力。本發(fā)明的適配體可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法合成。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，適配體通過(guò)細(xì)胞-selex(通過(guò)指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化)產(chǎn)生。有利地，細(xì)胞-selex方法允許通過(guò)復(fù)制蛋白質(zhì)細(xì)胞外區(qū)域的天然構(gòu)象和糖基化模式來(lái)產(chǎn)生針對(duì)細(xì)胞表面靶標(biāo)的適配體。在特定實(shí)施方式中，適配體的序列長(zhǎng)度在25與100個(gè)堿基之間，優(yōu)選地在25與70個(gè)堿基之間且更優(yōu)選地在25與55個(gè)堿基之間，從而使得能夠易于化學(xué)合成。在一些實(shí)施方式中，所述核酸適體包括能夠結(jié)合spa蛋白的“spa適體”、能夠結(jié)合clfa蛋白的“clfa適體”、能夠結(jié)合clfb蛋白的“clfb適體”、能夠結(jié)合fnba蛋白的“fnba適體”、能夠結(jié)合fnbb蛋白的“fnbb適體”、能夠結(jié)合isda蛋白的“isda適體”、能夠結(jié)合isdb蛋白的“isdb適體”、能夠結(jié)合isdc蛋白的“isdc適體”、能夠結(jié)合isdh蛋白的“isdh適體”、能夠結(jié)合sasd蛋白的“sasd適體”。在一些實(shí)施方案中，所述核酸適體包含seq?id?no：2所示的序列。在一些實(shí)施方案中，所述核酸適體包含與本文提供的核苷酸序列共有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性的核苷酸序列。

33、所述第一靶標(biāo)受體是腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的一種跨膜受體。這些受體包括間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子受體(met)、表皮生長(zhǎng)因子受體(egfr)、表皮生長(zhǎng)因子受體2(her2)、表皮生長(zhǎng)因子受體3(her3)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(vegfr)等。本發(fā)明一具體實(shí)施例中，所述第一靶標(biāo)受體以間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子受體(met)為例。

34、所述第一靶標(biāo)受體的受體激活方式為配體依賴的受體二聚化、寡聚化或多聚化，其中配體為肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hgf)、表皮生長(zhǎng)因子(egf)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vegf)等；本發(fā)明一具體實(shí)施例中，所述配體以肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hgf)為例。

35、所述第二靶標(biāo)受體為腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)跨膜受體，整合素關(guān)聯(lián)蛋白(cd47)、上皮細(xì)胞粘附分子(epcam)、程序性死亡配體1(pdl1)、表皮生長(zhǎng)因子受體(egfr)等；本發(fā)明一具體實(shí)施例中，所述第二靶標(biāo)受體以整合素關(guān)聯(lián)蛋白(cd47)為例。

36、所述靶細(xì)胞可以是癌細(xì)胞。該癌細(xì)胞可來(lái)源于前列腺癌。該癌細(xì)胞可來(lái)源于上皮癌。該癌細(xì)胞可來(lái)源于乳腺癌。該癌細(xì)胞可來(lái)源于腎癌。該癌細(xì)胞可來(lái)源于肺癌。該癌細(xì)胞可來(lái)源于結(jié)腸癌。該癌細(xì)胞可來(lái)源于結(jié)直腸癌。該癌細(xì)胞可來(lái)源于胃癌。該癌細(xì)胞可來(lái)源于腦癌。該癌細(xì)胞可來(lái)源于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。該癌細(xì)胞可來(lái)源于胰腺癌。該癌細(xì)胞可來(lái)源于髓樣白血病。該癌細(xì)胞可來(lái)源于宮頸癌。該癌細(xì)胞可來(lái)源于甲狀腺髓樣癌。該癌細(xì)胞可來(lái)源于基質(zhì)卵巢癌。該癌細(xì)胞可來(lái)源于星形細(xì)胞瘤。該癌細(xì)胞可來(lái)源于上皮癌。該癌細(xì)胞可來(lái)源于神經(jīng)內(nèi)分泌癌。該癌細(xì)胞可來(lái)源于胃腸胰腫瘤。該癌細(xì)胞可來(lái)源于成非霍奇金淋巴瘤。該癌細(xì)胞可來(lái)源于外分泌胰腺癌。該癌細(xì)胞可來(lái)源于尤因肉瘤。該癌細(xì)胞可來(lái)源于皮膚癌。該皮膚癌可以是黑色素瘤。該皮膚癌可以是新生成血管的皮膚癌。該肺癌可以是小細(xì)胞肺癌。具體地，所述靶細(xì)胞為人宮頸癌細(xì)胞hela、小鼠結(jié)直腸癌mc38細(xì)胞、小鼠結(jié)直腸癌細(xì)胞ct26、小鼠乳腺癌細(xì)胞4t1等；本發(fā)明一具體實(shí)施例中，以小鼠結(jié)直腸癌細(xì)胞mc38細(xì)胞為例。

37、所述納米抗體可與連接子偶聯(lián)。所述核酸適體可與連接子偶聯(lián)。納米抗體可通過(guò)共價(jià)鍵、離子鍵或非共價(jià)鍵與連接子偶聯(lián)。核酸適體可通過(guò)共價(jià)鍵、離子鍵或非共價(jià)鍵與連接子偶聯(lián)。連接子可提供納米抗體與核酸適體之間約10至100埃的距離。連接子可提供納米抗體與核酸適體之間等于或小于約50埃的距離。連接子可提供納米抗體與核酸適體之間等于或小于約45埃的距離。連接子可提供納米抗體與核酸適體之間等于或小于約40埃的距離。連接子可提供納米抗體與核酸適體之間等于或小于約30埃的距離。連接子可提供納米抗體與核酸適體之間等于或大于約5埃的距離。

38、所述納米抗體和所述核酸適體之間通過(guò)定點(diǎn)偶聯(lián)方法進(jìn)行連接，包括通過(guò)一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸、谷氨酰胺、非天然氨基酸、短肽標(biāo)簽和多糖實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性偶聯(lián)。所述非天然氨基酸包括對(duì)乙酰苯丙氨酸(pacf)。所述非天然氨基酸包括硒代胱氨酸。所述一個(gè)或多個(gè)非天然氨基酸可包括(a)各種取代的酪氨酸和苯丙氨酸類似物如鄰甲基-l-酪氨酸、對(duì)氨基-l-苯丙氨酸、3-硝基-l-酪氨酸、對(duì)硝基-l-苯丙氨酸、間甲氧基-l-苯丙氨酸和對(duì)異丙基-l-苯丙氨酸；(b)可光交聯(lián)的具有芳基疊氮和二苯甲酮基團(tuán)的氨基酸；(c)具有獨(dú)特化學(xué)反應(yīng)性的氨基酸，包括乙酰基-l-苯丙氨酸和間乙?；?l-苯丙氨酸、鄰烯丙基-l-酪氨酸、鄰-(2-丙炔基)-l-酪氨酸、對(duì)乙基硫代羰基-l-苯丙氨酸和對(duì)-(3-氧代丁酰基)-l-苯丙氨酸；(d)用于在x射線晶體學(xué)中定相的含重原子的氨基酸，包括對(duì)碘和對(duì)溴-l-苯丙氨酸；(e)氧化還原活性的氨基酸二羥基-l-苯丙氨酸；(f)糖基化的氨基酸，包括b-n-乙酰葡糖胺-鄰-絲氨酸和a-n-乙酰半乳糖胺-鄰-蘇氨酸；(g)具有萘基、丹酰和7-氨基香豆素側(cè)鏈的熒光氨基酸；(h)具有偶氮苯和硝基芐基cys、ser和tyr側(cè)鏈的可光裂解和可光異構(gòu)化的氨基酸；(i)磷酸酪氨酸模擬物對(duì)羧甲基-l-苯丙氨酸；(j)谷氨酰胺同系物高谷氨酰胺(homoglutamine)；(k)2-氨基辛酸；(l)或(a)-(k)的組合。所述一個(gè)或多個(gè)非天然氨基酸可包含至少一個(gè)肟、羰基、二羰基、羥胺、環(huán)辛炔、芳基/烷基疊氮、降冰片烯、環(huán)丙烯、反式環(huán)辛烯以及四嗪基團(tuán)。所述一個(gè)或多個(gè)非天然氨基酸可并入所述納米抗體或納米抗體片段中。所述一個(gè)或多個(gè)非天然氨基酸可位點(diǎn)特異性地并入所述納米抗體或納米抗體片段中。

39、所述短肽標(biāo)簽包括基于醛標(biāo)簽的smartag短肽序列cxpxr、谷氨酰胺的短肽標(biāo)簽llqga，lpxtg短肽標(biāo)簽，這些標(biāo)簽可通過(guò)基因工程定點(diǎn)插入到納米抗體的特定位置并進(jìn)行定點(diǎn)偶聯(lián)。所述一個(gè)或多個(gè)短肽標(biāo)簽可包含至少一個(gè)肟、羰基、二羰基、羥胺、環(huán)辛炔、芳基/烷基疊氮、降冰片烯、環(huán)丙烯、反式環(huán)辛烯以及四嗪基團(tuán)。所述一個(gè)或多個(gè)短肽標(biāo)簽可并入所述納米抗體或納米抗體片段中。所述一個(gè)或多個(gè)短肽標(biāo)簽可位點(diǎn)特異性地并入所述納米抗體或納米抗體片段中。

40、本發(fā)明一具體實(shí)施例中，所述雙特異性納米抗體—核酸適體偶聯(lián)物(cd47-metnanotamer)中包括的納米抗體序列為seq?id?no：1所示的氨基酸序列，融合標(biāo)簽氨基酸序列為hhhhhh(his標(biāo)簽)和llqg(谷氨酰胺標(biāo)簽)；所述核酸適體的序列為seq?id?no:2所示的核苷酸序列，第二修飾物為二苯并環(huán)辛炔-三乙二醇(dbco-teg)；所述共價(jià)連接納米抗體和核酸適體的小分子為氨基-聚乙二醇-疊氮。所述納米抗體和核酸適體通過(guò)氨基-聚乙二醇-疊氮形成共價(jià)結(jié)構(gòu)可使得分別與同一所述雙特異性納米抗體—核酸適體偶聯(lián)物(cd47-metnanotamer)的第一靶標(biāo)受體met、第二靶標(biāo)受體cd47之間的空間距離縮小，形成met與cd47的異二聚體，在met受體周圍形成空間位阻，阻礙hgf與met結(jié)合并誘導(dǎo)形成met二聚體，抑制met下游信號(hào)通路及抑制其功能，同時(shí)所述雙特異性納米抗體—核酸適體偶聯(lián)物選擇性結(jié)合共表達(dá)cd47及met的腫瘤細(xì)胞，降低脫靶效應(yīng)產(chǎn)生的毒副作用。

41、本發(fā)明一具體實(shí)施例中，所述雙特異性納米抗體—核酸適體偶聯(lián)物制備方法包括雙特異性納米抗體-核酸適體偶聯(lián)物通過(guò)微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶和點(diǎn)擊化學(xué)兩步反應(yīng)進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)。在溫和的反應(yīng)條件下，通過(guò)微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的催化作用，可以將含有伯胺(nh2-peg3-n3)的偶氮化小分子與cd47納米抗體融合蛋白末端谷氨酰胺標(biāo)簽連接起來(lái)，形成納米抗體-疊氮。然后，通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)將帶有dbco(二苯并環(huán)辛炔)的met核酸適體和上述帶有疊氮化物的納米抗體連接起來(lái)產(chǎn)生雙特異性納米抗體-核酸適體偶聯(lián)物。

42、其中，cd47納米抗體融合蛋白與連接子氨基-聚乙二醇-疊氮(nh2-peg3-n3)的摩爾濃度比例為1：50，微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(mtgase)的終濃度為1u/ml，37℃震蕩反應(yīng)8-10小時(shí)。

43、其中，cd47納米抗體融合蛋白與偶聯(lián)有dbco-teg的met核酸適體的摩爾濃度比例為1：1.2，反應(yīng)條件為25℃下震蕩反應(yīng)過(guò)夜。

44、所述衍生物是指在不改變上述雙特異性納米抗體—核酸適體偶聯(lián)物的特異性識(shí)別性能的基礎(chǔ)上，通過(guò)任意化學(xué)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的對(duì)上述雙特異性納米抗體—核酸適體偶聯(lián)物的修飾或利用所述雙特異性納米抗體—核酸適體偶聯(lián)物相同連接方法制備的納米抗體偶聯(lián)藥物，納米抗體偶聯(lián)熒光素、納米抗體偶聯(lián)核素、納米抗體偶聯(lián)反義核酸藥物等。

45、所述抗腫瘤藥物包括任何合適的抗腫瘤藥物都能使用，如化療藥物、放射療法或其聯(lián)合。抗腫瘤藥物可以是烷基化類藥物或抗代謝藥物。烷基化類藥物的例子包括但不限于順鉑、環(huán)磷酰胺、美法侖和達(dá)卡巴嗪?？勾x類藥物包括但不限于阿霉素、柔紅霉素、紫杉醇、依立替康(cpt-11)和托泊替康。當(dāng)抗腫瘤劑為放射療法時(shí)，放射源可以在被治療的病人的外部(外部照射放射治療-ebrt)或內(nèi)部(近程治療-bt)?？鼓[瘤藥物的給藥劑量取決與許多因素，包括，例如藥物的類型、被治療的腫瘤的類型、嚴(yán)重程度和給藥途徑。然而，應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是本發(fā)明不限于任何具體劑量。

46、所述組合物還包括藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明中，所述藥學(xué)上可接受的載體可以是選自通常用于抗體制劑的任何載體。例如，藥學(xué)上可接受的載體可以是選自乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯樹(shù)膠、磷酸鈣、藻酸鹽、明膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、糖漿、甲基纖維素、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸鎂、礦物油等中的一種或多種，但不限于此。所述藥物組合物還可以包含選自常用于制造藥物組合物的稀釋劑、賦形劑、潤(rùn)滑劑、潤(rùn)濕劑、甜味劑、風(fēng)味增強(qiáng)劑、乳化劑、懸浮劑、防腐劑等中的一種或多種。所述藥物組合物可以藥學(xué)有效量口服或腸胃外施用。腸胃外施用可以是靜脈內(nèi)注射、皮下注射、肌肉注射、腹膜內(nèi)注射、皮內(nèi)施用、鼻內(nèi)施用、肺內(nèi)施用、直腸施用或病灶內(nèi)局部施用。由于蛋白質(zhì)或肽在口服施用時(shí)被消化，因此用于口服施用的組合物中的活性成分可以被包衣或配制成防止在胃中消化。另外，所述組合物可以使用能夠?qū)⒒钚猿煞诌f送至靶細(xì)胞的任選裝置來(lái)施用。所述藥物組合物可以配制成在油或水性介質(zhì)中的溶液、懸浮液、糖漿、乳化溶液、提取物、粉末、顆粒劑、片劑或膠囊劑的形式，并且還可以包含用于配制的分散劑或穩(wěn)定劑。