本發(fā)明屬于腫瘤免疫治療。更具體地，涉及一種納米疫苗及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、胰腺癌是發(fā)生在胰腺外分泌腺中一類預(yù)后極差的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，五年存活率僅為10％左右，被稱為的“癌中之王”。近年來，以程序性死亡受體-1(pd-1)及其配體pd-l1、細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白-4(ctla-4)為代表的免疫檢查點(diǎn)在多種腫瘤的治療中均取得突破性進(jìn)展，使得免疫療法在腫瘤臨床治療中展示出廣闊前景。然而，受限于免疫抑制的腫瘤微環(huán)境，免疫治療或聯(lián)合治療在胰腺癌中的客觀緩解率(orr)并不理想。其中，胰腺癌的免疫微環(huán)境是造成其對免疫療法不敏感和相關(guān)不良預(yù)后的重要因素。

2、t細(xì)胞耗竭是癌癥期間出現(xiàn)的一種t細(xì)胞功能障礙狀態(tài)，表現(xiàn)為一系列抑制性免疫檢查點(diǎn)分子的持續(xù)高表達(dá)以及效應(yīng)功能進(jìn)行性缺陷。如tim-3高表達(dá)表示t細(xì)胞處于嚴(yán)重耗竭狀態(tài)。但耗竭性t細(xì)胞(exhausted?t?cell，tex)并非不可逆轉(zhuǎn)，利用單克隆抗體抑制免疫負(fù)調(diào)控受體能夠在一定程度上逆轉(zhuǎn)腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumor?infiltratinglymphocytes，tils)效應(yīng)無能狀態(tài)，恢復(fù)tils的增殖和效應(yīng)能力。目前，臨床研究逆轉(zhuǎn)tex最熱門的抑制性靶點(diǎn)是pd-1/pd-l1信號通路。遺憾的是，許多腫瘤類型對這類治療無響應(yīng)，或者在治療初期響應(yīng)后出現(xiàn)耐藥。如由于胰腺癌免疫微環(huán)境的低免疫原性和缺乏共刺激信號，抗pd-1抗體并不能獲得與其他“熱”腫瘤相當(dāng)?shù)寞熜АＥR床研究數(shù)據(jù)表明，僅靠免疫檢查點(diǎn)抑制仍難以逆轉(zhuǎn)胰腺癌的t細(xì)胞耗竭現(xiàn)象。

3、tim-3在多種腫瘤cd8+tils上的持續(xù)表達(dá)與耗竭狀態(tài)相關(guān)，其同時(shí)也在cd4+treg細(xì)胞上高表達(dá)。在許多癌癥中，tim-3+cd8+tils是功能障礙最嚴(yán)重的一群t細(xì)胞。tim-3作為新興的免疫腫瘤靶標(biāo)，其在聯(lián)合治療上具有很好的轉(zhuǎn)化前景，在克服免疫治療抗性上至關(guān)重要。但常見的tim-3抑制劑為單克隆抗體，胰腺癌異常致密的細(xì)胞外基質(zhì)會阻礙多數(shù)藥物和免疫細(xì)胞的浸潤，使tim-3的單克隆抗體并不能有效到達(dá)腫瘤部位并得到應(yīng)用的局部劑量。

4、主要組織相容性復(fù)合體i類分子(mhc-i)在腫瘤免疫監(jiān)視和免疫治療中扮演著重要角色。腫瘤可能通過失去mhc-i抗原呈遞機(jī)制(apm)來逃避免疫控制，這不僅損害了自然免疫反應(yīng)控制腫瘤的能力，也阻礙了通過重新激活抗腫瘤cd8+t細(xì)胞來工作的免疫療法。胰腺癌組織的腫瘤細(xì)胞低表達(dá)mhc-i，其低免疫原性造成抗原提呈細(xì)胞(apcs)呈遞效率和共刺激信號不足，進(jìn)而減弱t細(xì)胞活化。

5、樹突狀細(xì)胞(dcs)是機(jī)體最強(qiáng)的apcs，其介導(dǎo)的免疫應(yīng)答是固有免疫與適應(yīng)性免疫之間重要的橋梁。鑒于dcs是唯一能夠激活靜息t細(xì)胞的固有免疫細(xì)胞，dc細(xì)胞療法已成為抗腫瘤的強(qiáng)大武器。如研究人員制備的腫瘤細(xì)胞裂解物致敏的dc疫苗在臨床試驗(yàn)中降低了肝癌患者的轉(zhuǎn)移率，并延長了生存期(sun?t,yan?w,yang?c,et?al.clinical?researchon?dendritic?cell?vaccines?to?prevent?postoperative?recurrence?and?metastasisof?liver?cancer[j].genetics?and?molecular?research,2015,14(4):16222-32.)。但肝癌屬于浸潤型“熱”腫瘤，免疫細(xì)胞能夠進(jìn)入到肝癌組織中，而胰腺癌的細(xì)胞外基質(zhì)異常致密，細(xì)胞級尺寸(～18μm)卻難以穿越胰腺癌的基質(zhì)屏障，使得dc細(xì)胞療法在胰腺癌臨床試驗(yàn)結(jié)果不盡人意。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明針對胰腺癌低免疫原性和t細(xì)胞耗竭導(dǎo)致的免疫應(yīng)答不足以及胰腺癌基質(zhì)屏障會影響藥物遞送效率的問題，提供了一種納米疫苗及其制備方法。

2、本發(fā)明的第一個目的是提供一種納米疫苗。

3、本發(fā)明的第二個目的是提供所述納米疫苗的制備方法。

4、本發(fā)明的第三個目的是提供所述納米疫苗在制備用于改善腫瘤中t細(xì)胞耗竭狀態(tài)的制劑中的應(yīng)用。

5、本發(fā)明的第四個目的是提供所述納米疫苗在制備癌癥的免疫治療藥物中的應(yīng)用。

6、本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

7、本發(fā)明通過將表面偶聯(lián)(通過ph敏感化學(xué)鍵偶聯(lián))有抑制性免疫檢查點(diǎn)的抑制劑的脂質(zhì)體，與利用腫瘤細(xì)胞裂解物和鑰孔血藍(lán)蛋白培養(yǎng)得到的腫瘤抗原致敏樹突狀細(xì)胞的細(xì)胞膜經(jīng)fnc技術(shù)混合后通過擠出器擠出，制備得到了粒徑均一且外層有細(xì)胞膜包裹的，具備優(yōu)異的靶向作用和呈遞抗原作用的納米疫苗。如本發(fā)明用表面偶聯(lián)有tim-3單克隆抗體(atim-3抗體)的脂質(zhì)體與腫瘤抗原致敏樹突狀細(xì)胞的細(xì)胞膜制得的納米疫苗可以靶向tim-3高表達(dá)的t細(xì)胞，納米疫苗表面的pmhc和b7-1/2分子分別與t細(xì)胞表面的tcr-cd3、cd28分子結(jié)合，直接呈遞腫瘤抗原；同時(shí)，基于腫瘤微酸條件，ph敏感化學(xué)鍵發(fā)生斷裂釋放atim-3抗體，從兩方面逆轉(zhuǎn)t細(xì)胞耗竭，恢復(fù)耗竭性t細(xì)胞的細(xì)胞毒性和增殖能力。

8、即本發(fā)明提供了一種通過atim-3抗體逆轉(zhuǎn)t細(xì)胞耗竭以及通過腫瘤抗原致敏樹突狀細(xì)胞的細(xì)胞膜增強(qiáng)原位t細(xì)胞活性和增殖能力的策略，以此從根本上改變胰腺癌內(nèi)t細(xì)胞應(yīng)答無能狀態(tài)。當(dāng)本發(fā)明所述納米疫苗進(jìn)入血液循環(huán)后，其合適的表面電位、尺寸大小和結(jié)構(gòu)柔性有助于脂質(zhì)體在腫瘤內(nèi)聚集。到達(dá)腫瘤組織后，一方面通過腫瘤抗原致敏樹突狀細(xì)胞的細(xì)胞膜高效直接呈遞抗原給t淋巴細(xì)胞，充分提供t細(xì)胞活化必要的共刺激信號；另一方面在納米疫苗上通過ph敏感化學(xué)鍵引入免疫檢查點(diǎn)抑制劑(atim-3抗體)，按需釋放逆轉(zhuǎn)t細(xì)胞耗竭，重新激發(fā)被抑制的t細(xì)胞功能。這種雙管齊下的策略，能夠有效地、特異性地恢復(fù)原位t細(xì)胞的細(xì)胞毒功能和增殖能力，從根本上解決胰腺癌t細(xì)胞數(shù)量少、質(zhì)量差的問題。因此，本發(fā)明請求保護(hù)所述納米疫苗及其制備方法。

9、本發(fā)明所述納米疫苗的制備方法包括以下步驟：

10、s1.制備負(fù)載有抑制性免疫檢查點(diǎn)的抑制劑的脂質(zhì)體；

11、s2.利用腫瘤細(xì)胞裂解物和鑰孔血藍(lán)蛋白培養(yǎng)得到腫瘤抗原致敏的樹突狀細(xì)胞；

12、s3.將s1所得脂質(zhì)體與s2所得樹突狀細(xì)胞的細(xì)胞膜通過fnc技術(shù)混合，所得混合物再通過擠出器擠出，得所述納米疫苗。

13、具體地，s1中所述的抑制劑為抑制性免疫檢查點(diǎn)tim-3的抑制劑。

14、更具體地，所述tim-3的抑制劑為抗tim-3單克隆抗體。

15、具體地，s1中所述的抑制劑通過ph敏感化學(xué)鍵偶聯(lián)于脂質(zhì)體表面。

16、可選地，所述ph敏感化學(xué)鍵為酰亞胺鍵、縮醛鍵或苯甲酸亞胺鍵。

17、在本發(fā)明具體的實(shí)施例中，所述ph敏感化學(xué)鍵為酰亞胺鍵。

18、可選地，所述酰亞胺鍵由二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇-氨基與2,3-二甲基馬來酸酐開環(huán)反應(yīng)得到。

19、在利用腫瘤細(xì)胞裂解物培養(yǎng)腫瘤抗原致敏的樹突狀細(xì)胞時(shí)，根據(jù)想要治療的腫瘤來選擇使用何種腫瘤細(xì)胞裂解物。如在本發(fā)明具體的實(shí)施例中，本發(fā)明利用胰腺癌細(xì)胞(panc02-ova)的裂解物來培養(yǎng)腫瘤抗原致敏的樹突狀細(xì)胞，進(jìn)而利用樹突狀細(xì)胞的細(xì)胞膜制備能夠改善胰腺癌中t細(xì)胞耗竭狀態(tài)的納米疫苗。

20、具體地，s2中用腫瘤細(xì)胞裂解物和鑰孔血藍(lán)蛋白培養(yǎng)腫瘤抗原致敏的樹突狀細(xì)胞時(shí)，所用液體培養(yǎng)基中的腫瘤細(xì)胞裂解物的終濃度為50～200μg/ml，鑰孔血藍(lán)蛋白的終濃度為20～50μg/ml。

21、更具體地，所述腫瘤細(xì)胞裂解物的終濃度為200μg/ml，所述腫瘤細(xì)胞裂解物的終濃度為50μg/ml。

22、可選地，s3中所述的細(xì)胞膜是通過將培養(yǎng)的樹突狀細(xì)胞低滲裂解后差速離心得到。

23、具體地，s3中所述的脂質(zhì)體與細(xì)胞膜按脂質(zhì)與膜蛋白的質(zhì)量比為2.5～1.5:1的比例通過fnc技術(shù)混合。

24、具體地，通過fnc技術(shù)混合所得混合物依次通過400nm、200nm和100nm的聚碳酸酯膜共擠出。

25、具體地，每個聚碳酸酯膜各擠出14～16次。

26、更具體地，每個聚碳酸酯膜各擠出15次。

27、具體地，通過fnc技術(shù)混合時(shí)，脂質(zhì)體與細(xì)胞膜混合液的流速為2～3ml/min，緩沖液的流速為8～10ml/min。

28、可選地，所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液、純凈水或生理鹽水。

29、在本發(fā)明具體的實(shí)施例中，所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液。

30、本發(fā)明同時(shí)請求保護(hù)上述所述方法制備所得納米疫苗。

31、本發(fā)明還請求保護(hù)所述納米疫苗在制備用于改善腫瘤中t細(xì)胞耗竭狀態(tài)的制劑中的應(yīng)用。

32、本發(fā)明還請求保護(hù)所述納米疫苗在制備癌癥的免疫治療藥物中的應(yīng)用。

33、具體地，所述腫瘤/癌癥為胰腺癌。

34、本發(fā)明具有以下有益效果：

35、本發(fā)明通過將表面偶聯(lián)(通過ph敏感化學(xué)鍵偶聯(lián))有抑制性免疫檢查點(diǎn)的抑制劑的脂質(zhì)體，與利用腫瘤細(xì)胞裂解物和鑰孔血藍(lán)蛋白培養(yǎng)得到的腫瘤抗原致敏樹突狀細(xì)胞的細(xì)胞膜經(jīng)fnc技術(shù)混合后通過擠出器擠出，制備得到了粒徑均一且外層有細(xì)胞膜包裹的，具備優(yōu)異的靶向作用和呈遞抗原作用的納米疫苗。本發(fā)明所述納米疫苗具有合適的表面電位、尺寸大小和結(jié)構(gòu)柔性，有助于其在腫瘤內(nèi)聚集，到達(dá)腫瘤組織后，可通過腫瘤抗原致敏樹突狀細(xì)胞的細(xì)胞膜高效直接呈遞抗原給t淋巴細(xì)胞，充分提供t細(xì)胞活化必要的共刺激信號，同時(shí)可通過免疫檢查點(diǎn)抑制劑逆轉(zhuǎn)t細(xì)胞耗竭，重新激發(fā)被抑制的t細(xì)胞功能，通過雙管齊下的策略，有效地、特異性地恢復(fù)原位t細(xì)胞的細(xì)胞毒功能和增殖能力。

36、本發(fā)明有利于腫瘤的免疫治療和相關(guān)免疫治療藥物的開發(fā)。