本發(fā)明涉及一種活性氧和活性氮級聯(lián)抗腫瘤納米藥物及其制備方法和應(yīng)用，具體是一種單紅色上轉(zhuǎn)換熒光成像指導(dǎo)的腫瘤微環(huán)境酸響應(yīng)釋放的植物醛和天然氨基酸的納米藥物及其在腫瘤診斷治療中作為化學(xué)-氣療-鐵死亡級聯(lián)治療試劑和上轉(zhuǎn)換熒光成像劑的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)。

背景技術(shù)：

1、一氧化氮(no)氣體與細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子結(jié)合產(chǎn)生對癌癥有毒性的·n或?·o，在腫瘤治療中發(fā)揮著重要作用。隨著納米醫(yī)學(xué)的發(fā)展，通過物理包埋或化學(xué)偶聯(lián)的方式將no供體包埋到多功能納米載體中的策略被廣泛報道，但no供體的血液循環(huán)難以控制且半衰期小于5?s，因此如何將其遞送成為一個非常具有挑戰(zhàn)性的問題。

2、no生成試劑與活性氧(ros)釋放劑的有效聯(lián)合策略可以充分利用ros與no在藥代動力學(xué)上的互補(bǔ)性。ros具有較短的擴(kuò)散距離和較高的氧化還原電位，會破壞致密的細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)短壽命、高毒性的no從細(xì)胞間隙自由擴(kuò)散到細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而殺死癌細(xì)胞。但腫瘤微環(huán)境(tme)中ros水平往往不夠高，且分布不均勻。因此，ros自我供給的靶向治療策略可以通過選擇性地放大腫瘤中ros的水平來解決上述問題。

3、診斷方式和治療方法集合到一個納米平臺中的診療一體化是近年發(fā)展起來的一種高特異性的新型診療理念。迄今為止，光誘導(dǎo)的腫瘤成像技術(shù)中，上轉(zhuǎn)換熒光成像具有優(yōu)異的成像效果，故而引起了科研工作者的廣泛關(guān)注。尤其是單紅色上轉(zhuǎn)換熒光成像，由于組織的散射或吸收較低，在降低背景噪聲和實現(xiàn)深層組織穿透方面具有廣泛的應(yīng)用前景。因此，迫切需要開發(fā)一種單紅色上轉(zhuǎn)換熒光成像劑。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種活性氧和活性氮級聯(lián)抗腫瘤納米藥物及其制備方法和應(yīng)用，該藥物為水分散性的負(fù)載單紅色上轉(zhuǎn)換熒光成像劑、植物醛和天然氨基酸的納米診療探針，可用于腫瘤診斷時的上轉(zhuǎn)換熒光造影劑，以及腫瘤治療時的化學(xué)-氣療-鐵死亡級聯(lián)治療試劑。

2、本發(fā)明提供一種活性氧和活性氮級聯(lián)抗腫瘤納米藥物，包括單紅色上轉(zhuǎn)換發(fā)光介孔納米顆粒，以所述介孔納米顆粒為載體，接枝植物醛和負(fù)載天然氨基酸，為了防止藥物泄漏和增加腫瘤靶向性，在所述載體外包裹生物相容性材料。本發(fā)明以植物醛和天然氨基酸的協(xié)同作用作為抗腫瘤治療的核心內(nèi)容。它是在腫瘤微環(huán)境中過量表達(dá)的乳酸激活的條件下，實現(xiàn)活性氧活性氮的順序激活響應(yīng)機(jī)制，植物醛受腫瘤細(xì)胞中過量表達(dá)的乳酸激活后，產(chǎn)生高毒性羥基自由基，實現(xiàn)活性氧治療。同時植物醛還會緩慢釋放過氧化氫，進(jìn)而引發(fā)天然氨基酸向一氧化氮的轉(zhuǎn)化，實現(xiàn)活性氮治療，并且兩種治療方法充分利用活性氧和活性氮在藥物動力學(xué)上的互補(bǔ)性，產(chǎn)生強(qiáng)大的抗腫瘤效應(yīng)。

3、本發(fā)明以介孔納米顆粒為載體，以單紅色上轉(zhuǎn)換熒光材料為成像劑，同時負(fù)載植物醛和天然氨基酸，并通過生物相容性材料進(jìn)行包覆，合成酸敏型納米藥物。本發(fā)明引入了肉桂醛，肉桂醛是一種大量存在于肉桂等植物體內(nèi)具有反式結(jié)構(gòu)的丙烯醛衍生物，其暴露在腫瘤環(huán)境乳酸條件下，迅速生成大量高毒性羥基自由基(·oh)，有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，進(jìn)行化學(xué)療法。同時釋放的過氧化氫(h2o2)，引發(fā)l-精氨酸向no的轉(zhuǎn)化，實現(xiàn)活性氮(rns)治療。并且，腫瘤微環(huán)境中的谷胱甘肽(gsh)被ros和rns耗竭，gsh依賴過氧化物酶4(gpx4)蛋白失活，進(jìn)行鐵死亡治療。這種化學(xué)-氣療-鐵死亡的順序激活響應(yīng)機(jī)制，充分利用ros和rns在藥物動力學(xué)上的互補(bǔ)性，產(chǎn)生強(qiáng)大的抗腫瘤效應(yīng)?？傊?，本發(fā)明的肉桂醛和l-精氨酸在腫瘤治療中具有突出的化學(xué)-氣療-鐵死亡級聯(lián)治療效果。

4、作為本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)化的技術(shù)方案如下：

5、進(jìn)一步的，所述多孔納米載體顆?？梢詾槎嗫捉饘儆袡C(jī)骨架納米顆粒、聚合物納米顆粒、脂質(zhì)體納米顆粒等；所述熒光材料可以使用具有熒光性能的量子點、有機(jī)小分子和共軛聚合物等，本發(fā)明使用單紅發(fā)光上轉(zhuǎn)換納米粒子@介孔二氧化硅作進(jìn)一步闡述；所述植物醛為肉桂醛；所述天然氨基酸為l-精氨酸；所述生物相容性材料為人血清白蛋白。

6、本發(fā)明還提供一種活性氧和活性氮級聯(lián)抗腫瘤納米藥物的制備方法，包括以下步驟：

7、步驟1、合成單紅色上轉(zhuǎn)換發(fā)光并具有合適介孔的納米顆粒作為載體；

8、步驟2、制備包覆生物相容性材料的納米顆粒：將步驟1獲得的介孔納米顆粒分散于去離子水中，再加入生物相容性材料，劇烈攪拌下滴入丙酮，得到包覆生物相容性材料的納米顆粒；

9、步驟3、制備負(fù)載或接枝植物醛的納米顆粒：將步驟2獲得的納米顆粒分散于丙酮中，加入植物醛，攪拌后，得到接枝植物醛的納米顆粒；

10、步驟4、制備封裝天然氨基酸的納米顆粒：選用合適的天然氨基酸，封裝擴(kuò)散到步驟3獲得的接枝植物醛的納米顆粒的介孔中，得到封裝天然氨基酸的納米顆粒。

11、本發(fā)明的步驟1中為了制備單紅光上轉(zhuǎn)換納米粒子，可以選取以natmf4為基質(zhì)，摻雜er3+離子并調(diào)節(jié)f源和na源比例，并外包naluf4惰性殼以增強(qiáng)發(fā)光強(qiáng)度。為了制備小孔徑msio2，可以使用短鏈表面活性劑作為孔形成劑。熒光材料與介孔材料的摩爾比可以根據(jù)最終需要的納米顆粒的大小進(jìn)行調(diào)控。步驟2中可供選擇的生物相容性材料有許多，如已報道的牛血清白蛋白等，以去離子水洗滌離心分離，轉(zhuǎn)速為9000～12000?rpm。

12、所述步驟2中，將10～50?mg步驟1獲得的納米顆粒超聲分散于1～5?ml去離子水中，然后加入2～10?ml(5?mg/ml)人血清白蛋白，用注射器緩慢推入5～30?ml丙酮，劇烈攪拌10～24?h，高速離心后收集產(chǎn)物用去離子水洗滌，得到負(fù)載人血清白蛋白的納米顆粒。

13、所述步驟?3中，將步驟2獲得的納米顆粒超聲分散于1～5?ml丙酮中，隨后在室溫攪拌下緩慢滴入5～15?ml溶液(v肉桂醛:v丙酮=?1:9)，室溫下避光攪拌12～24?h后，得到負(fù)載肉桂醛的納米顆粒。

14、所述步驟?4中，將10～50?mg步驟3獲得的納米顆粒超聲分散于2～10?ml去離子水中，隨后在室溫攪拌下緩慢滴入5～25?ml?(5?mg/ml)l-精氨酸水溶液，室溫下避光攪拌10～24?h后，得到封裝l-精氨酸的納米顆粒。

15、所述步驟?1中，所述熒光材料選擇具有上轉(zhuǎn)換單紅色發(fā)光材料，小孔徑的介孔材料選擇介孔二氧化硅，并且選擇包覆方式。所述步驟?2中，所述生物相容性材料選擇包覆方式。

16、本發(fā)明開發(fā)一種單紅色上轉(zhuǎn)換熒光成像引導(dǎo)的腫瘤治療方式，克服傳統(tǒng)上轉(zhuǎn)換熒光成像背景噪聲高和組織穿透差的局限性，提高生物醫(yī)學(xué)診斷能力。

17、所述步驟3中，納米顆粒與肉桂醛的最優(yōu)質(zhì)量比為1:20；室溫下透析純化混合物。

18、所述步驟4中，納米顆粒與l-精氨酸的最優(yōu)質(zhì)量比為1:2；反應(yīng)結(jié)束后以去離子水洗滌并離心收集材料，離心機(jī)轉(zhuǎn)速9000～12000?rpm。

19、本發(fā)明提供的納米藥物用于化學(xué)-氣療-鐵死亡級聯(lián)抗腫瘤治療中。

20、本發(fā)明針對腫瘤內(nèi)過氧化氫不足和超短半衰期rns的治療阻礙，將肉桂醛和l-精氨酸負(fù)載在納米載體中。在腫瘤微環(huán)境中，肉桂醛通過與腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)的乳酸反應(yīng)，產(chǎn)生大量高毒性·oh，實現(xiàn)化學(xué)治療；在產(chǎn)生·oh的同時，肉桂醛還會釋放大量過氧化氫，進(jìn)而快速激活l-精氨酸向一氧化氮的轉(zhuǎn)化，實現(xiàn)活性氮治療。并且，腫瘤微環(huán)境中的gsh被ros和rns耗竭，gpx4蛋白失活，進(jìn)行鐵死亡治療。這種級聯(lián)作用的化學(xué)-氣療-鐵死亡療法，由肉桂醛的控制釋放致使rns釋放得以可控，時空釋放ros和rns的實現(xiàn)，從而充分利用活性氧和活性氮在藥物動力學(xué)上的互補(bǔ)性。l-精氨酸由介孔硅載體實施的控釋和h2o2的消耗得以維持瘤內(nèi)痕量l-精氨酸，在為免疫細(xì)胞提供l-精氨酸的同時，限制微環(huán)境中的腫瘤細(xì)胞對于l-精氨酸的可獲得性，產(chǎn)生強(qiáng)大的抗腫瘤效應(yīng)?？傊?，本發(fā)明以腫瘤微環(huán)境中過表達(dá)的乳酸激活的條件，實現(xiàn)化學(xué)-氣療-鐵死亡的順序激活響應(yīng)機(jī)制，通過將肉桂醛和l-精氨酸兩種天然化合物聯(lián)用，以活性氧和活性氮有效聯(lián)合策略提供一種化學(xué)-氣療-鐵死亡的抗腫瘤級聯(lián)治療方法，為腫瘤藥物研發(fā)提供了新的思路。

21、進(jìn)一步的，所述納米藥物通過腫瘤微環(huán)境酸響應(yīng)釋放肉桂醛和介孔硅控釋l-精氨酸實現(xiàn)化學(xué)-氣療-鐵死亡抗腫瘤聯(lián)合治療，以及單色紅光上轉(zhuǎn)換熒光成像指導(dǎo)的診療一體化。

22、本發(fā)明采用以上技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下技術(shù)效果：選取具有負(fù)載效果的上轉(zhuǎn)換納米粒子@介孔二氧化硅納米顆粒作為載體，在載體中負(fù)載肉桂醛和l-精氨酸。本發(fā)明原料源自于天然產(chǎn)物易獲得，制備過程易操作，制備出負(fù)載肉桂醛和l-精氨酸的納米顆粒具有較好顆粒分散性、化學(xué)穩(wěn)定性和生物相容性，是一種理想的活性氧和活性氮有效聯(lián)合的癌癥治療試劑。