本發(fā)明涉及醫(yī)用配制品，尤其涉及一種放射增敏的功能化益生菌雜化材料及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、癌癥作為全球最致命的疾病之一，已經(jīng)嚴(yán)重威脅人類生命健康。目前，放射療法已在臨床中廣泛使用，并在抑制腫瘤增殖和延長(zhǎng)患者存活方面取得了一定的成功。然而，由于腫瘤的復(fù)雜性、致密性和異質(zhì)性，目前的臨床放射治療只能取得有限的成功。例如，腫瘤細(xì)胞能夠通過異常的細(xì)胞周期調(diào)控，逃避放射敏感的g2/m期，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生輻射抗性，從而降低放射治療的療效。同時(shí)，傳統(tǒng)的放射增敏劑依賴于血管的增強(qiáng)滲透和滯留作用被動(dòng)的沉積在腫瘤部位，腫瘤部位致密的細(xì)胞外基質(zhì)阻礙了放射增敏劑在腫瘤內(nèi)的滲透，從而極大程度的降低了放射增敏的效果。

2、為了彌補(bǔ)放射增敏劑在腫瘤內(nèi)的積累不足，常用的策略是增加放射增敏劑的劑量或輻射強(qiáng)度，這不可避免地會(huì)對(duì)正常組織產(chǎn)生毒副作用。同時(shí)，放射治療不可避免的促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，對(duì)放射治療的愈后造成極大影響。因此，探索有別于傳統(tǒng)治療策略的腫瘤治療新途徑和新策略顯得尤為迫切。

3、黑磷納米片（black?phosphorus?nanosheets，bps）材料因其良好的導(dǎo)電性和細(xì)胞周期調(diào)控能力而成為近年來研究的熱點(diǎn)。

4、例如公開號(hào)為cn107638568a的中國(guó)發(fā)明專利提供了一種可生物降解的黑磷基放療增敏劑及其制備方法與應(yīng)用。該發(fā)明的光敏劑在黑磷表面生長(zhǎng)了三氧化二鉍量子點(diǎn)，保留了黑磷的特性，同時(shí)增加了黑磷的穩(wěn)定性，由于鉍原子序數(shù)較高，對(duì)x射線有很強(qiáng)的吸收能力，三氧化二鉍量子點(diǎn)和黑磷直接接觸，x射線照射時(shí)，三氧化二鉍吸收x射線并直接將部分能量轉(zhuǎn)移給黑磷納米片，而黑磷納米片中的電子再轉(zhuǎn)移給周圍的氧，同時(shí)三氧化二鉍作為半導(dǎo)體也可將電子轉(zhuǎn)移給周圍的氧，形成單線態(tài)氧，從而實(shí)現(xiàn)了協(xié)同的光動(dòng)力效果。然而，黑磷基納米材料不具備主動(dòng)靶向腫瘤的能力，在血液循環(huán)中會(huì)被降解和破壞，容易擴(kuò)散累積至體內(nèi)其他臟器中，造成全身性放射毒性。

5、值得慶幸的是，某些益生菌已被證實(shí)具有特異性靶向腫瘤乏氧區(qū)域的能力，并優(yōu)先定植于富營(yíng)養(yǎng)和免疫抑制的腫瘤部位，并能滲透到更深的腫瘤核心。此外，細(xì)菌含有豐富的病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated?molecular?patterns。pamps），經(jīng)過x射線照射后可被免疫系統(tǒng)識(shí)別并觸發(fā)免疫應(yīng)答，提高腫瘤部位的免疫原性。因此，益生菌可以作為一種可靠的遞送放射增敏劑的藥物載體，并在放射治療和免疫治療之間搭建橋梁，以獲得更好的癌癥治療效果。

6、例如公開號(hào)為cn112755184a的中國(guó)發(fā)明專利提供了一種用于低劑量放射治療的腫瘤靶向性載體及其制備方法和腫瘤靶向藥物。該發(fā)明用于低劑量放射治療的腫瘤靶向性載體具有厭氧菌，借助于厭氧菌的厭氧趨向性，使得該腫瘤靶向性載體能夠精確定位到腫瘤細(xì)胞。該用于低劑量放射治療的腫瘤靶向性載體采用了黑磷量子點(diǎn)（black?phosphorusquantum?dot，bpqd），具有高的光熱轉(zhuǎn)換效率，通過光熱作用達(dá)到靶向治療低氧腫瘤細(xì)胞的效果。類似的，公開號(hào)為cn112516309a的中國(guó)發(fā)明專利公開了一種用于低劑量放射治療的腫瘤靶向性載體、藥物及制備方法。其方案采用超聲剝離方法將黑鱗制備成黑鱗量子點(diǎn)，對(duì)厭氧菌進(jìn)行表面氨化處理，并將兩者混合，將黑鱗量子點(diǎn)靜電吸附到氨化處理的厭氧細(xì)菌表面，得到腫瘤靶向性載體。但在不同的應(yīng)用環(huán)境下，具體厭氧細(xì)菌類型的響應(yīng)機(jī)制需結(jié)合需求進(jìn)行設(shè)計(jì)。不僅于此，黑磷量子點(diǎn)在應(yīng)用中穩(wěn)定性有待優(yōu)化，可能存在易被氧化的缺陷，其在體內(nèi)血液循環(huán)中的存在時(shí)間較短，而較低的比表面積對(duì)放療增敏強(qiáng)度的增益程度亦十分有限。

7、綜上所述，提供一種放射增敏的功能化益生菌雜化材料，解決傳統(tǒng)放射增敏劑精準(zhǔn)性差、腫瘤細(xì)胞放射抗性強(qiáng)等問題，從而為腫瘤提供了高效、精準(zhǔn)的靶向治療，具有重要的意義和廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，在本發(fā)明的第一方面，提供了一種工藝步驟簡(jiǎn)單便捷、可操作性高的放射增敏的功能化益生菌雜化材料的制備方法，包括如下步驟：

2、（1）將黑磷分散于甲基吡咯烷酮（n-methyl?pyrrolidone，nmp）中，經(jīng)超聲處理，得到黑磷納米片；

3、（2）將十二烷基硫酸鉍分散于十八烯中，加入十二烷基硫醇（dodecanethiol，ddt）和三正辛基膦并進(jìn)行反應(yīng)，得到鉍納米粒子；

4、（3）水溶液環(huán)境下，將鉍納米粒子與黑磷納米片共混，加入nh2-peg2000-mal和mmp-2酶響應(yīng)多肽并進(jìn)行反應(yīng)，得到黑磷基放射增敏劑；

5、（4）水溶液環(huán)境下，將丁酸梭菌（ clostridium?butyricum）與黑磷基放射增敏劑共混，隨后加入n-羥基琥珀酰亞胺（n-hydroxysuccinimide，nhs）和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽（1-ethyl-3-(3-dimethyllaminopropyl)carbodiie?hydrochlide，edc）并進(jìn)行孵育，得到放射增敏的功能化益生菌雜化材料。

6、優(yōu)選的，所述步驟（1）采用冰浴超聲法，具體操作如下：將塊狀黑磷分散于甲基吡咯烷酮中，以50~2000?w的功率進(jìn)行冰浴超聲破碎12~72?h，隨后經(jīng)離心和洗滌，獲得黑磷納米片。

7、上述操作在冰浴環(huán)境下（反應(yīng)溫度為0?℃）的原因在于，防止黑磷納米片溫度過高加速被氧氣氧化，由于黑磷納米片易被氧氣氧化，若反應(yīng)溫度過高將會(huì)促進(jìn)黑磷納米片被氧化的過程，從而導(dǎo)致黑磷納米片的形貌不規(guī)整。超聲破碎時(shí)間為12~72?h能夠獲得粒徑為200~400?nm的單層黑磷納米片，若超聲時(shí)間小于12?h，黑磷納米片的尺寸過大，且無法形成單片層結(jié)構(gòu)，若超聲時(shí)間大于72?h，黑磷納米片的粒徑較小，容易聚集，不利于后續(xù)與鉍納米粒子的結(jié)合。

8、優(yōu)選的，所述步驟（2）采用控速滴定法，具體操作如下：將十二烷基硫酸鉍加至十八烯溶液中超聲分散；隨后以10~30?ml/h的速度加入十二烷基硫醇并于50~200?℃反應(yīng)1~8h，直至溶液呈棕黃色，再以10~30?ml/h的速度加入三正辛基膦并于30~100?℃反應(yīng)0.5~4h，完成后經(jīng)離心和洗滌，獲得鉍納米粒子。

9、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述十二烷基硫酸鉍、十八烯、十二烷基硫醇、三正辛基膦的體積比為（4~8）ml:（20~40）ml:（8~16）ml:（4~8）ml。

10、十二烷基硫醇、三正辛基膦的加入速率控制在10~30?ml/h的原因在于控制鉍納米粒子的粒徑大小。若加入速率小于10?ml/h，合成的鉍納米粒子粒徑將會(huì)變小，不利于其放療增敏的效果；若加入速率大于30?ml/h，鉍納米粒子粒徑會(huì)很大，不利于將其與黑磷納米片的結(jié)合。三正辛基膦的添加量同樣適宜控制在本發(fā)明優(yōu)選的范圍內(nèi)，三正辛基膦的體積若小于4?ml，鉍納米粒子粒徑可能會(huì)變小；若大于8?ml，鉍納米粒子粒徑可能會(huì)變大。

11、優(yōu)選的，所述步驟（3）的具體操作如下：將黑磷納米片超聲分散于水中，加入鉍納米粒子水溶液，經(jīng)混合、離心和洗滌，獲得負(fù)載放射增敏劑的黑磷基載體；隨后加入nh2-peg2000-mal和mmp-2酶響應(yīng)多肽并反應(yīng)0.5~4?h，完成后經(jīng)離心和洗滌，獲得黑磷基放射增敏劑。

12、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述鉍納米粒子與黑磷納米片的質(zhì)量比為（5~10）mg:（1~5）mg。

13、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述黑磷納米片、nh2-peg2000-mal、mmp-2酶響應(yīng)多肽的質(zhì)量比為（5~10）mg:（4~8）mg:（1~2）mg。

14、鉍納米粒子與所述黑磷納米片的質(zhì)量比控制在（5~20）mg:（1~5）mg的原因在于，控制黑磷基放射增敏劑的放射增敏強(qiáng)度和材料的穩(wěn)定性。若鉍納米粒子與黑磷納米片的投入比大于20?mg:1?mg，不利于黑磷納米片的穩(wěn)定；若鉍納米粒子與黑磷納米片的投入比小于5mg:5?mg，黑磷基放射增敏劑的放射增敏強(qiáng)度會(huì)變低。

15、nh2-peg2000-mal（氨基聚乙二醇馬來酰亞胺）是一種廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究、藥物釋放、納米技術(shù)和新材料研究、細(xì)胞培養(yǎng)的化合物。負(fù)載鉍納米粒子的黑磷基載體與nh2-peg2000-mal的投入比若高于10?mg:4?mg，nh2-peg2000-mal無法有效地接枝在所述負(fù)載鉍納米粒子的黑磷基載體表面，不利于后續(xù)mmp-2酶響應(yīng)多肽的修飾。負(fù)載鉍納米粒子的黑磷基載體與nh2-peg2000-mal的投入比若低于5?mg:8?mg，會(huì)造成nh2-peg2000-mal的過量，浪費(fèi)實(shí)驗(yàn)原料。

16、nh2-peg2000-mal與mmp-2酶響應(yīng)多肽的投入比若高于8?mg:1?mg，mmp-2酶響應(yīng)多肽與h2-peg2000-mal的反應(yīng)不完全，不利于黑磷基放射增敏劑后續(xù)修飾在丁酸梭菌表面。h2-peg2000-mal與mmp-2酶響應(yīng)多肽的投入比若低于4?mg:2?mg，會(huì)造成mmp-2酶響應(yīng)多肽的過量，浪費(fèi)實(shí)驗(yàn)原料。

17、優(yōu)選的，所述步驟（4）的具體操作如下：將含有丁酸梭菌的水溶液加入到含有黑磷基放射增敏劑的水溶液中混合，隨后向其中加入n-羥基琥珀酰亞胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽并孵育1~24?h，完成后經(jīng)離心和洗滌，獲得放射增敏的功能化益生菌雜化材料。

18、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述含有丁酸梭菌的水溶液中的細(xì)菌菌落數(shù)為107~109cfu/ml；所述含有黑磷基放射增敏劑的水溶液的濃度為10~20?mg/ml。

19、本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)節(jié)上述兩種溶液的用量，例如將含有丁酸梭菌的水溶液中和含有黑磷基放射增敏劑的水溶液以（1~10）ml:（1~10）ml或其他比例混合，以獲得不同丁酸梭菌和黑磷基放射增敏劑的含量的材料，從而滿足不同應(yīng)用下的需求。

20、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述黑磷基放射增敏劑與n-羥基琥珀酰亞胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽的質(zhì)量比為（10~20）mg:（7~70）mg:（12~20）mg。

21、丁酸梭菌溶液、黑磷基放射增敏劑、n-羥基琥珀酰亞胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽的濃度比為上述比例的原因在于，在這個(gè)濃度比條件下，能夠制備功能和形貌良好的放射增敏的功能化益生菌雜化材料；黑磷基放射增敏劑添加過少或過多以及丁酸梭菌溶液添加過多或過少，都會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌表面功能修飾的黑磷基放射增敏劑過多或過少，或影響細(xì)菌本身的生物活性；不利于制備理想的放射增敏的功能化益生菌雜化材料。

22、在本發(fā)明的第二方面，提供了一種腫瘤抑制效率高、靶向精準(zhǔn)性高、脫靶毒副作用小的放射增敏的功能化益生菌雜化材料，采用本發(fā)明第一方面提供的方法制備而成。

23、在本發(fā)明的第三方面，提供了一種本發(fā)明第二方面的放射增敏的功能化益生菌雜化材料在作為抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

24、基于以上技術(shù)方案，本發(fā)明的設(shè)計(jì)構(gòu)思及原理如下：

25、本發(fā)明的制備方法，首先將黑磷分散在甲基吡咯烷酮溶液中，經(jīng)超聲處理獲得黑磷納米片。相較于黑磷量子點(diǎn)等形式的黑磷材料而言，黑磷納米片具有更大的比表面積，從而有利于后續(xù)鉍納米粒子的搭載以及電荷傳導(dǎo)，并且具有更良好的穩(wěn)定性。將十二烷基硫酸鉍分散在十八烯溶液中，并加入十二烷基硫醇和三正辛基膦，通過反應(yīng)意在獲得尺寸均一（粒徑約為50?nm）的鉍納米粒子。與三氧化二鉍量子點(diǎn)等相比，鉍納米粒子具有更加穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，并且在x射線照射下具有較強(qiáng)的電子沉積和輻射敏化功能。后續(xù)將鉍納米粒子與黑磷納米片共混，加入nh2-peg2000-mal和mmp-2酶響應(yīng)多肽，可反應(yīng)獲得具備mmp-2酶響應(yīng)功能的黑磷基放射增敏劑。mmp-2酶響應(yīng)多肽能夠鏈接黑磷基放射增敏劑和丁酸梭菌，并且只有在過表達(dá)mmp-2酶的腫瘤部位響應(yīng)性斷裂，從而釋放黑磷基放射增敏劑，極大程度的減少了黑磷基放射增敏劑的脫靶可能，從而減少了放射毒性。最后，將具有mmp-2酶響應(yīng)功能的黑磷基放射增敏劑修飾在丁酸梭菌表面，得到放射增敏的功能化益生菌雜化材料。相較于其他厭氧細(xì)菌，丁酸梭菌作為能夠消耗谷氨酰胺并且分泌丁酸的益生菌，可以消耗腫瘤細(xì)胞所需的谷氨酰胺，同時(shí)提供cd8+t細(xì)胞激活所需的丁酸，能夠在一定程度上有利于腫瘤放療后的免疫激活。

26、采用本發(fā)明方法制備的放射增敏的功能化益生菌雜化材料，利用丁酸梭菌的乏氧趨向性能，將攜帶黑磷基放射增敏劑至乏氧腫瘤部位，提高靶向腫瘤治療效果。同時(shí)，放療后細(xì)菌釋放病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated?molecular?patterns，pamps），激活腫瘤部位的免疫原性，為放射治療和免疫治療之間搭建橋梁，提升腫瘤抑制效率。在腫瘤細(xì)胞周期調(diào)控過程中，黑磷納米片能夠通過細(xì)胞周期阻滯，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞滯留在放射敏感的g2/m期，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的放射敏感性增強(qiáng)。同時(shí)，黑磷納米片的高比表面積和優(yōu)異的導(dǎo)電性能夠放大鉍納米粒子的放射增敏效果。這種活性生命體正向驅(qū)動(dòng)的“靶向-細(xì)胞周期調(diào)控-放射增敏”策略解決了傳統(tǒng)放射增敏劑精準(zhǔn)性差、腫瘤細(xì)胞放射抗性強(qiáng)的問題，為腫瘤提供了高效、精準(zhǔn)的靶向治療。

27、通過將具有mmp-2酶響應(yīng)功能的黑磷基放射增敏劑與丁酸梭菌結(jié)合，可在厭氧益生菌的帶動(dòng)下有效提高放射增敏劑的靶向精準(zhǔn)性，減小脫靶毒副作用。通過將黑磷調(diào)控腫瘤細(xì)胞周期與鉍納米粒子放射增敏聯(lián)合，顯著降低了腫瘤細(xì)胞的放療抗性，提高了放射增敏的效果，從而激活了腫瘤部位的免疫原性；實(shí)現(xiàn)放療和免疫治療的聯(lián)合治療，提高腫瘤抑制效率。

28、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

29、本發(fā)明提供了一種放射增敏的功能化益生菌雜化材料的制備方法，其具有工藝步驟簡(jiǎn)單便捷、可操作性高的優(yōu)勢(shì)。

30、本發(fā)明提供了一種放射增敏的功能化益生菌雜化材料，具有腫瘤抑制效率高、靶向精準(zhǔn)性高、脫靶毒副作用小的特點(diǎn)。

31、本發(fā)明提供了一種放射增敏的功能化益生菌雜化材料的應(yīng)用，在抗腫瘤領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。