本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種多工程化干細(xì)胞制劑及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、肝臟纖維化是一種慢性疾病，特點(diǎn)是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的過度積累，可能引發(fā)肝硬化和肝癌等嚴(yán)重疾病。迄今為止，已有多種方法被提出用于治療肝纖維化，包括生活方式的改進(jìn)、抗纖維化藥物的應(yīng)用、外泌體治療以及干細(xì)胞療法等。在這些方法中，干細(xì)胞療法因其治療效果、可行性和安全性成為研究熱點(diǎn)。間充質(zhì)干細(xì)胞是一類具備免疫調(diào)節(jié)和組織修復(fù)能力的多能基質(zhì)細(xì)胞，也是應(yīng)用最廣的一類干細(xì)胞。研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞能夠分泌大量生物活性因子，以緩解肝臟炎癥并促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，被認(rèn)為是治療肝纖維化的潛在候選者。盡管取得了顯著進(jìn)展，但基于間充質(zhì)干細(xì)胞的療法仍面臨重大挑戰(zhàn)。一方面，干細(xì)胞療法通常采用系統(tǒng)性的給藥方式，這會導(dǎo)致大量細(xì)胞在血液循環(huán)中流失，降低其在肝臟中的滯留數(shù)量。另一方面，間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的活性生長因子的數(shù)量有限，持續(xù)時(shí)間短，且不同批次干細(xì)胞分泌的生長因子具有顯著差異，進(jìn)一步限制了干細(xì)胞療法的生物學(xué)應(yīng)用。因此，開發(fā)高效的基于間充質(zhì)干細(xì)胞的療法仍備受期待。

2、細(xì)胞膜修飾技術(shù)是一種通過對細(xì)胞膜進(jìn)行物理或化學(xué)改造的技術(shù)，旨在改善細(xì)胞的功能，增強(qiáng)靶向性或提高其在體內(nèi)的穩(wěn)定性。常見的修飾方法包括通過脂質(zhì)體、聚合物、納米顆?；蚱渌锊牧?，將特定分子嵌入細(xì)胞膜，以促進(jìn)細(xì)胞與特定靶標(biāo)的相互作用?；蚬こ碳夹g(shù)通過在細(xì)胞內(nèi)引入特定的基因，如dna、mrna、環(huán)狀rna等，從而修改細(xì)胞功能以實(shí)現(xiàn)特定疾病的治療。不同于dna療法，環(huán)狀rna療法的一個(gè)顯著優(yōu)勢在于不會改變細(xì)胞的遺傳特性。而相比于線性rna，環(huán)狀rna具有更長的半衰期，這一特性使其在細(xì)胞內(nèi)展現(xiàn)出更強(qiáng)和更持久的表達(dá)能力。此外，環(huán)狀rna在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性使其能夠克服傳統(tǒng)rna治療中常見的降解問題，確保其在治療過程中提供穩(wěn)定的生物學(xué)活性。因此，將細(xì)胞膜修飾技術(shù)與基因工程技術(shù)協(xié)同用于干細(xì)胞的改造，不僅可以增強(qiáng)干細(xì)胞靶向能力，還可以大幅度提升干細(xì)胞的表達(dá)水平。這類創(chuàng)新的整合方式有望開發(fā)出一種更具潛力的治療策略，能夠精準(zhǔn)地作用于肝臟纖維化的病變區(qū)域，從而有效促進(jìn)肝臟的修復(fù)與再生。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的：本發(fā)明旨在解決干細(xì)胞流失、分泌生長因子數(shù)量不足、作用持續(xù)時(shí)間短，以及不同批次干細(xì)胞分泌生長因子不一致等問題，提供了一種多工程化干細(xì)胞制劑及其制備方法和應(yīng)用。

2、為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種多工程化干細(xì)胞制劑及其制備方法和應(yīng)用。具體技術(shù)方案如下：

3、一種多工程化干細(xì)胞制劑的制備方法，包括如下步驟：

4、(1)制備肝素-脂質(zhì)偶聯(lián)物：將肝素和第一脂質(zhì)通過縮合反應(yīng)偶聯(lián)得到；優(yōu)選地，此處考慮到肝素的免疫調(diào)節(jié)功效及對肝臟的親和力，將其與第一脂質(zhì)偶聯(lián)。通過膜修飾技術(shù)，可以將合成的肝素-脂質(zhì)偶聯(lián)物插入干細(xì)胞的細(xì)胞膜，改善其在體內(nèi)的生物學(xué)命運(yùn)。

5、(2)制備環(huán)狀rna制劑：將環(huán)狀rna溶液與第二脂質(zhì)溶液混合，經(jīng)超濾得到環(huán)狀rna制劑；所述的環(huán)狀rna包括ires序列和目的序列，將ires序列的3’端與目的序列的5’端相連，和ires序列的5’端與目的序列的3’端相連；其中，所述的目的序列由信號肽和抗纖維化生長因子組成；優(yōu)選地，所述的混合，通過微流控設(shè)備進(jìn)行混合。進(jìn)一步優(yōu)選地，混合后加入pbs緩沖液進(jìn)行稀釋后再超濾。

6、(3)制備多工程化干細(xì)胞：培養(yǎng)干細(xì)胞至細(xì)胞融合度為70％～85％，加入步驟(2)制備得到的環(huán)狀rna制劑培養(yǎng)4～72h后更換新鮮培養(yǎng)基，加入步驟(1)制備得到的肝素-脂質(zhì)偶聯(lián)物繼續(xù)培養(yǎng)4～72h，得到多工程化干細(xì)胞制劑。優(yōu)選地，細(xì)胞融合度為80％其中，步驟(1)中，所述的肝素，其重均分子量為10～20kda；優(yōu)選為15kda。所述的第一脂質(zhì)為1,2-十四酰基磷脂酰乙醇胺dmpe、1,2-二棕櫚酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺dppe、1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺dspe、1-棕櫚?；?2-油?；?磷脂酰乙醇胺pope、1,2-二油基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺dope、1-棕櫚?；?2-油?；?卵磷脂-磷脂酰乙醇胺popc-pe或鞘磷脂中的任意一種；優(yōu)選為dmpe、dppe和dspe中的任意一種；進(jìn)一步優(yōu)選為dspe。

7、其中，步驟(1)中，所述的肝素和第一脂質(zhì)的反應(yīng)摩爾比為1:1；所述的縮合反應(yīng)，反應(yīng)溫度為60～70℃，反應(yīng)時(shí)間為12～36h。優(yōu)選65℃反應(yīng)24h。

8、其中，步驟(1)中，所述的肝素-脂質(zhì)偶聯(lián)物，其結(jié)構(gòu)如式i所示：

9、

10、其中，藍(lán)色框內(nèi)為第一脂質(zhì)，n為10～20間的任一偶數(shù)，肝素的重均分子量為10～20kda。n優(yōu)選為12、14或16。其中，肝素和na+相連，肝素的重均分子量為15kda。

11、其中，步驟(2)中，所述的ires序列為cvb3?ires序列，其核苷酸序列如seq?idno.1所示。

12、所述的抗纖維化生長因子為vegf或hgf的任意一種，其序列分別順序?qū)?yīng)于seqidno.2～3；即vegf的序列如seq?id?no.2所示，hgf的序列如seq?id?no.3所示。

13、所述的信號肽，其序列如seq?id?no.4所示。

14、所述的環(huán)狀rna制劑為環(huán)狀hgf?rna制劑或環(huán)狀vegf?rna制劑中的任意一種或兩種的組合。所述的環(huán)狀rna，根據(jù)抗纖維化生長因子的不同，命名為環(huán)狀vegf?rna或環(huán)狀hgfrna。

15、其中，步驟(2)中，所述的環(huán)狀rna，按照如下方法制備得到：將所述的ires序列在切割位點(diǎn)從5’端到3’端切割為兩段，前段為ires片段2，后段為ires片段1，將目的序列的5’端與ires片段1的3’端相連，目的序列的3’端與ires片段2的5’端相連，得到線性rna序列，將所述的線性rna序列經(jīng)環(huán)化即得環(huán)狀rna；所述的切割位點(diǎn)，從5’端到3’端計(jì)，為ires序列的第346位點(diǎn)、359位點(diǎn)、369位點(diǎn)、391位點(diǎn)、401位點(diǎn)或者453位點(diǎn)中的任意一種。優(yōu)選地，所述的切割位點(diǎn)為第391位，ires片段1的序列如seq?id?no.5所示，ires片段2的序列如seqid?no.6所示。優(yōu)選地，所述的環(huán)化，通過t4?rna連接酶實(shí)現(xiàn)。

16、其中，步驟(2)中，所述的環(huán)狀rna溶液中環(huán)狀rna的濃度為0.05～5μg/μl，其溶劑為檸檬酸緩沖液。

17、所述的第二脂質(zhì)溶液，由可電離脂質(zhì)、膽固醇、磷脂和peg修飾脂質(zhì)按摩爾比40～60：30～40：5～15：1～2混合而成，優(yōu)選地，可電離脂質(zhì)、膽固醇、磷脂和peg修飾脂質(zhì)按摩爾比50:38.5:10:1.5混合，所述的第二脂質(zhì)溶液的溶劑為無水乙醇。

18、所述的可電離脂質(zhì)，包括c12-200、ckk-e12、of-02、dodac、ddab、dlin-mc3-dma、dlinkc2dma、dmrie、dospa、dodac、dmrie、dogs、dodap、dodma、dlindma、dlendma、clindma、dlindap、sm-102、alc-0315和jk-102-ca中的任意一種或幾種的組合；優(yōu)選為alc-0315。

19、所述的磷脂，包括1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿dspc、1,2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿dppc、1,2-二棕櫚酰基-sn-甘油基-3-磷?；视外c鹽dppg、1,2-二油基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺dope、dspe、1,2-二油基-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿dopc、pope、1-棕櫚酰-2-油?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿popc、dppe、1,2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油dopg、dmpe、1-硬脂?；?2-油?；?磷脂酰乙醇胺sope、腦磷脂、神經(jīng)酰胺、二?；视汀⒛X苷脂或鞘磷脂中的任意一種或幾種的組合；優(yōu)選為dspc。所述的peg修飾脂質(zhì)，包括dspe-peg1000、dspe-peg2000、dmg-peg1000、dmg-peg1300、dmg-peg1500、dmg-peg1800、dmg-peg2000、dmg-peg2200、dmg-peg2500、dmg-peg2700、dmg-peg3000、dmg-peg3200、dmg-peg3500、dmg-peg3700、dmg-peg4000、dmg-peg4200、dmg-peg4500、dmg-peg4700、dmg-peg5000或神經(jīng)酰胺-peg2000等中的任意一種或幾種的組合；優(yōu)選為dmg-peg2000。

20、所述的環(huán)狀rna溶液和第二脂質(zhì)溶液的混合體積比為1:1～10:1。優(yōu)選為3:1。

21、所述的超濾，其截留分子量為90～120kda。優(yōu)選為100kda。

22、其中，步驟(3)中，所述的干細(xì)胞包括胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、上皮干細(xì)胞、肌肉干細(xì)胞、肝干細(xì)胞、心臟干細(xì)胞、牙髓干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、羊膜干細(xì)胞，角膜上皮干細(xì)胞、成骨干細(xì)胞、或胎盤干細(xì)胞中的任意一種。優(yōu)選為間充質(zhì)干細(xì)胞，進(jìn)一步優(yōu)選為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞或臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。

23、其中，步驟(3)中，所述的環(huán)狀rna制劑的添加濃度為0.05～10mg/ml(以rna計(jì))，優(yōu)選為0.1～0.3mg/ml；所述的肝素-脂質(zhì)偶聯(lián)物的添加濃度為0.1～10mg/ml，優(yōu)選為1mg/ml。所述的環(huán)狀rna制劑為環(huán)狀hgf?rna制劑或環(huán)狀vegf?rna制劑中的任意一種或兩種的組合；優(yōu)選為環(huán)狀hgf?rna制劑和環(huán)狀vegf?rna制劑的組合，環(huán)狀hgf?rna和環(huán)狀vegf?rna的質(zhì)量比為1:1。

24、第二方面，本發(fā)明提供了第一方面所述的制備方法制備得到的多工程化干細(xì)胞制劑。

25、第三方面，本發(fā)明提供了第二方面所述的多工程化干細(xì)胞制劑在制備肝臟纖維化治療藥物中的應(yīng)用。

26、有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：

27、(1)本發(fā)明開發(fā)了肝素-脂質(zhì)偶聯(lián)物，偶聯(lián)物修飾干細(xì)胞的細(xì)胞膜，賦予了干細(xì)胞更強(qiáng)的肝臟靶向性，減少了干細(xì)胞在血液循環(huán)中的流逝，促使更多細(xì)胞抵達(dá)病灶部位。

28、(2)本發(fā)明利用自主設(shè)計(jì)的環(huán)狀rna改造干細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，以解決分泌生長因子數(shù)量不足、作用持續(xù)時(shí)間短，以及不同批次干細(xì)胞分泌生長因子不一致等問題，賦予了干細(xì)胞高表達(dá)和持續(xù)性表達(dá)抗纖維化生長因子的能力。

29、(3)通過兩步法工程化干細(xì)胞，同時(shí)賦予干細(xì)胞強(qiáng)大的肝臟靶向能力及生物學(xué)功能，分泌的生長因子可有效抑制肝星狀細(xì)胞的活化，降低纖維化指標(biāo)，減輕炎癥反應(yīng)，并促進(jìn)肝組織的修復(fù)和再生，有助于治療肝臟相關(guān)疾病。

30、(4)這種工程化方法操作簡便，易于實(shí)施和推廣，具有廣泛的應(yīng)用前景。