本發(fā)明屬于再生醫(yī)學(xué)，尤其涉及一種促進(jìn)毛發(fā)再生的復(fù)合成膜液的制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、脫發(fā)是一種常見(jiàn)的毛發(fā)疾病，全球范圍內(nèi)發(fā)病率逐年上升，尤其在中年人群中更為普遍，并有逐漸年輕化的趨勢(shì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國(guó)成年男性的脫發(fā)發(fā)病率已超過(guò)20%，女性發(fā)病率也達(dá)到10%以上。脫發(fā)不僅影響患者的外貌和心理健康，還可能導(dǎo)致自信心下降、社交障礙等社會(huì)問(wèn)題，嚴(yán)重時(shí)甚至引發(fā)焦慮和抑郁等精神疾病。脫發(fā)的病因復(fù)雜，主要包括遺傳因素、激素水平失衡、氧化應(yīng)激、營(yíng)養(yǎng)不良、環(huán)境污染、精神壓力以及不良生活習(xí)慣等。

2、目前，脫發(fā)的治療方法主要包括藥物治療、物理治療和手術(shù)治療。藥物治療中，米諾地爾和非那雄胺是常用的藥物。米諾地爾通過(guò)擴(kuò)張血管促進(jìn)毛囊血液循環(huán)，非那雄胺則通過(guò)抑制5α-還原酶降低二氫睪酮水平，從而減緩脫發(fā)。然而，這些藥物存在一定的局限性，如米諾地爾可能引發(fā)頭皮刺激和過(guò)敏反應(yīng)，非那雄胺則可能導(dǎo)致性功能障礙等副作用。物理治療如低能量激光療法和微針治療雖然在一定程度上能夠刺激毛囊再生，但療效十分有限且需要長(zhǎng)期堅(jiān)持。手術(shù)治療如毛發(fā)移植雖然具有一定效果，但費(fèi)用高昂且存在術(shù)后感染和瘢痕形成的風(fēng)險(xiǎn)?？偟膩?lái)說(shuō)，現(xiàn)有治療方法的主要缺陷在于其作用機(jī)制單一，難以綜合解決脫發(fā)的復(fù)雜病因與環(huán)境。例如，藥物治療主要針對(duì)激素水平和血液循環(huán)，而忽視了氧化應(yīng)激和毛囊微環(huán)境的修復(fù)。此外，現(xiàn)有治療方法往往缺乏對(duì)活性成分的穩(wěn)定控制，導(dǎo)致局部作用濃度波動(dòng)很大，影響治療效果。因此，開(kāi)發(fā)一種能夠抗氧化、修復(fù)毛囊微環(huán)境、穩(wěn)定活性成分的局部作用濃度并實(shí)現(xiàn)活性物質(zhì)緩釋的新型促毛發(fā)再生體系具有重要的臨床意義。

3、近年來(lái)，隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，外源干細(xì)胞來(lái)源的活性物質(zhì)在組織修復(fù)和再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用日益廣泛。干細(xì)胞分泌的生長(zhǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白等活性成分具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化和血管生成的作用，能夠有效修復(fù)受損毛囊并促進(jìn)毛發(fā)再生。然而，外源干細(xì)胞來(lái)源的活性物質(zhì)在應(yīng)用過(guò)程中面臨穩(wěn)定性差、易降解等問(wèn)題，限制了其療效的發(fā)揮。因此，目前迫切需要發(fā)展能夠通過(guò)固定化技術(shù)穩(wěn)定活性成分，并實(shí)現(xiàn)其在脫發(fā)局部長(zhǎng)時(shí)間緩釋的新技術(shù)。

4、本發(fā)明旨在提供一種新型的促毛發(fā)再生復(fù)合成膜液，通過(guò)加強(qiáng)抗氧化作用，補(bǔ)充外源干細(xì)胞來(lái)源的活性物質(zhì)，固定化有效治療成分，穩(wěn)定有效成分的局部作用濃度，實(shí)現(xiàn)有效治療成分的緩釋來(lái)提高對(duì)毛發(fā)再生的促進(jìn)效果。該復(fù)合成膜液涂抹于脫發(fā)皮膚表面之后，可快速成膜，固定化并緩釋有效成分，從而能夠有效中和自由基，修復(fù)毛囊微環(huán)境，延長(zhǎng)活性成分的作用時(shí)間，減少治療頻率，更好地促進(jìn)毛發(fā)再生。本發(fā)明將為脫發(fā)患者提供一種安全、有效且便捷的促毛發(fā)再生的復(fù)合成膜液，具有廣闊的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種促進(jìn)毛發(fā)再生的復(fù)合成膜液的制備方法和應(yīng)用，旨在在脫發(fā)部位強(qiáng)化固定化和緩釋有效活性成分，通過(guò)中和自由基，修復(fù)毛囊微環(huán)境以及延長(zhǎng)活性成分的作用時(shí)間來(lái)進(jìn)一步促進(jìn)毛發(fā)再生。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案。

3、本發(fā)明公開(kāi)了一種促進(jìn)毛發(fā)再生的復(fù)合成膜液的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

4、s1.?收集干細(xì)胞培養(yǎng)上清液，利用0.22微米濾膜進(jìn)行過(guò)濾除雜質(zhì)，之后利用中空纖維膜過(guò)濾裝置進(jìn)行膜過(guò)濾和濃縮，然后將濃縮液放置于-80℃冷凍，之后進(jìn)行冷凍干燥，得到凍干的干細(xì)胞來(lái)源活性物質(zhì)a；

5、s2.?將s1所制備的凍干活性物質(zhì)a分別溶解于堿性明膠和酸性明膠溶液，攪拌混合均勻，之后再分別加入京尼平，攪拌混合均勻，然后將兩種混合液分別放置于-80℃冷凍，之后進(jìn)行冷凍干燥，分別得到含有干細(xì)胞來(lái)源活性物質(zhì)的堿性明膠-京尼平的凍干產(chǎn)物b及酸性明膠-京尼平的凍干產(chǎn)物c；

6、s3.?利用研磨機(jī)將s2所制備的兩種凍干產(chǎn)物b和c分別研磨成粉末，并利用篩網(wǎng)過(guò)篩，分別得到含有干細(xì)胞來(lái)源活性物質(zhì)的堿性明膠-京尼平顆粒d以及酸性明膠-京尼平顆粒e；

7、s4.?將聚乙烯吡咯烷酮加入殼聚糖溶液中，攪拌混合均勻制得混合液f；

8、s5.?將維生素e加入到甘油中，攪拌混合均勻制得混合液g；

9、s6.?將s5所制備的混合液g加入s4所制備的f液，攪拌混合均勻制得混合液h;

10、s7.?將s3所制備的兩種顆粒d和e加入s6所制備的混合液h，攪拌混合均勻，獲得用于促進(jìn)毛發(fā)再生的復(fù)合成膜液。

11、進(jìn)一步地，所述步驟s1中所述干細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞、皮膚干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、ips細(xì)胞中的一種。

12、進(jìn)一步地，所述步驟s1中所述培養(yǎng)上清液為培養(yǎng)干細(xì)胞24～96h后獲得的培養(yǎng)液。

13、進(jìn)一步地，所述步驟s1中所述中空纖維膜過(guò)濾裝置的過(guò)濾膜的截留分子量為1.5～5?kda。

14、進(jìn)一步地，所述步驟s2中所述凍干活性物質(zhì)a分別溶解于堿性明膠和酸性明膠溶液時(shí)其濃度為5～25mg/ml。

15、進(jìn)一步地，所述步驟s2中所述加入京尼平的濃度為0.02～0.08%（w/v,?g/ml）。

16、進(jìn)一步地，所述步驟s3中所述篩網(wǎng)的目數(shù)為220～500目，所述顆粒的最長(zhǎng)尺寸為30～70μm。

17、進(jìn)一步地，所述步驟s4中所述聚乙烯吡咯烷酮的分子量為20～400kda，所述殼聚糖的脫乙酰度為90%及以上，所述殼聚糖的分子量為80～400kda。

18、進(jìn)一步地，所述步驟s7中所述兩種顆粒d和e分別加入s6所制備的混合液h時(shí)濃度為20～100?mg/ml。

19、進(jìn)一步地，所述步驟s7中用于促進(jìn)毛發(fā)再生的復(fù)合成膜液中殼聚糖的濃度為0.5～2%（w/v,?g/ml），聚乙烯吡咯烷酮的濃度為2～15%（w/v,?g/ml），甘油的濃度為3～10%（v/v），維生素e的濃度為0.1～10%（w/v,?g/ml），兩種顆粒d和e的濃度均為20～100mg/ml。

20、本發(fā)明還公開(kāi)了一種上述任一項(xiàng)所述的制備方法制備得到的復(fù)合成膜液在制備促進(jìn)毛發(fā)再生的成膜劑中的應(yīng)用。

21、進(jìn)一步地，所述復(fù)合成膜液與微針治療聯(lián)用，通過(guò)皮膚孔道增強(qiáng)活性物質(zhì)在毛囊區(qū)域的滲透。

22、本發(fā)明還公開(kāi)了一種促進(jìn)毛發(fā)再生的復(fù)合成膜液，其特征在于，由上述任一項(xiàng)所述的制備方法制得；所述復(fù)合成膜液涂抹在脫發(fā)皮膚，促進(jìn)毛發(fā)再生。

23、與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的有益效果。

24、1.?本發(fā)明采用殼聚糖、聚乙烯吡咯烷酮及甘油構(gòu)建緩釋干細(xì)胞來(lái)源活性物質(zhì)及維生素e的復(fù)合成膜液。在脫發(fā)區(qū)域涂抹成膜液形成高分子薄膜有利于促毛發(fā)再生成分的局部固定化，通過(guò)緩釋保持穩(wěn)定的有效濃度。單獨(dú)殼聚糖的成膜性不足，所形成的薄機(jī)械特性低，結(jié)構(gòu)不均勻，不能在脫發(fā)區(qū)域形成均質(zhì)、穩(wěn)定的薄膜。聚乙烯吡咯烷酮與殼聚糖之間具有較強(qiáng)的氫鍵作用，能夠顯著提升殼聚糖基成膜液的成膜性，提高拉伸強(qiáng)度，使得膜更加均勻和穩(wěn)定。甘油可以插入殼聚糖和聚乙烯吡咯烷酮分子鏈中，增加分子鏈的運(yùn)動(dòng)性，改善高分子膜的柔韌性和延展性。此外，甘油與殼聚糖、聚乙烯吡咯烷酮之間也存在氫鍵作用，增強(qiáng)成膜的穩(wěn)定性和機(jī)械特性。另外，甘油的添加增強(qiáng)了復(fù)合膜的保濕特性，使得在脫發(fā)區(qū)域使用時(shí)不會(huì)發(fā)生脫水和碎裂。因此，本發(fā)明利用殼聚糖、聚乙烯吡咯烷酮及甘油制備了三種高分子鏈互穿的成膜液，依靠三種分子之間的相互作用提升了成膜性，改善了膜的特性，使得在脫發(fā)區(qū)域涂抹后，可以形成穩(wěn)定、均質(zhì)及保濕的高分子薄膜，以固定化及緩釋干細(xì)胞來(lái)源活性物質(zhì)和維生素e。

25、2.本發(fā)明所制備的復(fù)合成膜液中含有維生素e，在脫發(fā)區(qū)域涂抹后維生素e在局部固定，并緩慢釋放，通過(guò)抗氧化等作用來(lái)加速毛發(fā)再生。氧化應(yīng)激是導(dǎo)致毛囊老化和脫發(fā)的重要因素之一，維生素e是一種強(qiáng)效抗氧化劑，能夠中和自由基，減少氧化應(yīng)激對(duì)毛囊的損害。游離狀態(tài)下的維生素e不溶于水，容易流失，在脫發(fā)區(qū)域有效作用濃度低，效果有限。本發(fā)明將維生素e先溶解到甘油中，之后將含有維生素e的甘油和殼聚糖及聚乙烯吡咯烷酮的混合溶液混合均勻，從而使得維生素e在成膜溶液中均勻存在。在脫發(fā)區(qū)域涂抹后，所形成的高分子膜中均勻含有維生素e，并且膜使得維生素e固定于脫發(fā)區(qū)域，尤其是微針處理后的皮膚孔道中，通過(guò)膜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和分子間相互作用可實(shí)現(xiàn)維生素e的緩釋，這種緩釋作用可以延長(zhǎng)維生素e的作用時(shí)間，提高其生物利用度和治療效果。此外，殼聚糖及維生素e之間有氫鍵作用，一方面更有利于維生素e的分散性和穩(wěn)定性，另一方面能夠強(qiáng)化復(fù)合膜的穩(wěn)定性。另外，殼聚糖也具有一定的抗氧化性能，它與維生素e結(jié)合后，可以產(chǎn)生協(xié)同抗氧化效應(yīng)，更有利于毛發(fā)再生。此外，殼聚糖和維生素e還都具有促進(jìn)細(xì)胞再生的作用。殼聚糖通過(guò)其生物活性促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化，而維生素e則通過(guò)抗氧化和修復(fù)作用保護(hù)細(xì)胞免受損傷。兩者的結(jié)合可以更有效地促進(jìn)毛囊細(xì)胞的再生和修復(fù)，從而加速毛發(fā)再生。

26、3.本發(fā)明所制備的復(fù)合成膜液中含有載有干細(xì)胞來(lái)源活性物質(zhì)的明膠-京尼平顆粒，在脫發(fā)區(qū)域涂抹后明膠-京尼平顆粒在局部固定，并緩慢釋放干細(xì)胞來(lái)源活性物質(zhì)，通過(guò)抗氧化、激活毛囊、促血管生成、激活毛囊干細(xì)胞等作用來(lái)加速毛發(fā)再生。干細(xì)胞培養(yǎng)上清液中含有干細(xì)胞分泌的多種生長(zhǎng)因子及活性蛋白，可以改善脫發(fā)部位的炎性微環(huán)境，通過(guò)多種生物學(xué)效應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)毛發(fā)再生。然而，游離狀態(tài)的活性物質(zhì)很容易失活，本發(fā)明首先將凍干的干細(xì)胞來(lái)源活性物質(zhì)分別溶解于堿性明膠和酸性明膠溶液中。由于兩種明膠分別帶負(fù)電和正電，它們可以分別與活性物質(zhì)中帶正電和負(fù)電的物質(zhì)進(jìn)行靜電結(jié)合，從而減少了活性物質(zhì)的失活。之后，本發(fā)明利用京尼平適度交聯(lián)含有活性物質(zhì)的兩種明膠溶液，形成水凝膠態(tài)，并進(jìn)而進(jìn)行凍干、研磨及過(guò)篩，獲得分別含有活性物質(zhì)的堿性及酸性明膠-京尼平微米顆粒。這些顆?？梢栽跍p少失活的條件下實(shí)現(xiàn)活性物質(zhì)的緩釋。京尼平的交聯(lián)可以提高顆粒的穩(wěn)定性與抗降解性，調(diào)控活性物質(zhì)緩釋。之后，本發(fā)明將這兩種顆粒進(jìn)一步混合到殼聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、維生素e及甘油的混合液中，形成了含有顆粒的復(fù)合成膜液。當(dāng)在脫發(fā)區(qū)域涂抹復(fù)合成膜液時(shí)，顆粒被運(yùn)送到脫發(fā)區(qū)域，尤其是微針處理后的皮膚孔道內(nèi)部，從而被局部固定化，在皮膚深層中實(shí)現(xiàn)了活性物質(zhì)的緩釋，從而能夠更持久的發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，促進(jìn)毛發(fā)再生。

27、4.?本發(fā)明提出的復(fù)合成膜液，使用方便，不需要使用特殊裝置，在微針處理后的脫發(fā)部位涂抹均勻即可成膜起效。