本發(fā)明屬于納米材料和功能性物質(zhì)的控制釋放領(lǐng)域，具體涉及一種利用同軸靜電紡絲技術(shù)制備負(fù)載活性物質(zhì)的結(jié)腸靶向控釋體系的制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

近年來(lái)，隨著人們對(duì)食品改善人類(lèi)營(yíng)養(yǎng)及健康功能的日益關(guān)注，功能性食品的研究與開(kāi)發(fā)成為現(xiàn)代食品工業(yè)發(fā)展的新潮流。功能性食品中發(fā)揮作用的物質(zhì)稱(chēng)為生物活性物質(zhì)，如活性蛋白與多肽、微生態(tài)調(diào)節(jié)劑、黃酮類(lèi)與多酚類(lèi)物質(zhì)、功能性油脂、生物堿、維生素以及其它生理活性物質(zhì)等。然而，活性物質(zhì)在生產(chǎn)加工及儲(chǔ)存過(guò)程中穩(wěn)定性差；口服后也易受上消化道影響(如胃酸及小腸中的蛋白酶)而失活或者發(fā)生首過(guò)效應(yīng)被肝臟代謝消除，導(dǎo)致其生物利用度低。因此，亟需構(gòu)建一個(gè)有效的運(yùn)輸體系來(lái)提高活性物質(zhì)的穩(wěn)定性和生物利用度。

小腸是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要場(chǎng)所，近年來(lái)，隨著腸道菌群的發(fā)現(xiàn)及其促進(jìn)健康功能的明確，證明了結(jié)腸亦可作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的場(chǎng)所。結(jié)腸功能性食品的研究與開(kāi)發(fā)成為熱點(diǎn)。與小腸相比，結(jié)腸中蛋白酶水平和活力低；結(jié)腸壁蠕動(dòng)緩慢，食物在結(jié)腸中運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)間長(zhǎng)，而且結(jié)腸壁對(duì)蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的穿透阻力比小腸壁小；經(jīng)結(jié)腸吸收還可避免肝臟的首過(guò)效應(yīng)，提高活性物質(zhì)的生物利用度；另外結(jié)腸存在大量的有益菌群，能夠促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用。因此，利用結(jié)腸靶向控釋體系將活性物質(zhì)運(yùn)載并釋放于結(jié)腸，不僅可以提高其生物利用度，而且可大幅度提高諸如腸易激綜合癥、潰瘍性結(jié)腸炎等結(jié)腸相關(guān)疾病的治療效果。

目前，構(gòu)建結(jié)腸靶向控釋體系將活性物質(zhì)運(yùn)載并釋放于結(jié)腸的方法有噴霧干燥法、冷凍干燥法、流化床包衣法、擠出滾圓法、復(fù)凝聚法、微膠囊法及溶劑蒸發(fā)法等，但噴霧干燥法對(duì)壁材要求高且不適用于熱敏性物質(zhì)，冷凍干燥法成本高且效率低，流化床包衣法對(duì)包衣內(nèi)核要求較高，擠出法不適于大規(guī)模生產(chǎn)，復(fù)凝聚法操作過(guò)程復(fù)雜、活性成分易溶于凝聚溶劑中，溶劑蒸發(fā)法采用的有機(jī)溶劑易造成環(huán)境污染等。因此，負(fù)載活性物質(zhì)的結(jié)腸靶向控釋體系的研究具有廣闊的發(fā)展前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)活性物質(zhì)的應(yīng)用中存在穩(wěn)定性差和生物利用度低的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供了一種基于靜電紡絲法制備的負(fù)載活性物質(zhì)的結(jié)腸靶向控釋體系及制備方法和其在功能性食品中的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提出以下技術(shù)方案：

一種核-殼結(jié)構(gòu)納米纖維膜的制備方法，包括如下步驟：

(1)紡絲溶液的制備

將海藻酸鈉、聚氧化乙烯和泊洛沙姆F127溶于蒸餾水/乙醇(體積比為90:10)，攪拌均勻，得到殼層紡絲溶液；

將負(fù)載活性物質(zhì)的殼聚糖納米粒子溶液與聚乙烯醇溶液混合均勻，得到核層紡絲溶液；

(2)同軸靜電紡絲

將殼層紡絲液和核層紡絲液分別注入含有同軸針頭的靜電紡絲裝置中，在室溫下進(jìn)行同軸靜電紡絲，紡絲過(guò)程中溶劑揮發(fā)，得到負(fù)載納米粒子的核-殼結(jié)構(gòu)納米纖維膜。

所述殼層紡絲溶液中海藻酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.4％～12％，聚氧化乙烯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.6％～3％，泊洛沙姆F127的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2％。

所述海藻酸鈉與聚氧化乙烯的質(zhì)量比為4:1。

所述負(fù)載活性物質(zhì)的殼聚糖納米粒子溶液與聚乙烯醇溶液的體積比為1:1～3:1。

所述負(fù)載活性物質(zhì)的殼聚糖納米粒子溶液采用離子交聯(lián)法制備，其制備方法為：首先將殼聚糖溶于1％，v/v的乙酸溶液，攪拌得到1.5～6mg/ml的殼聚糖溶液；然后向其中加入0.5～3mg/ml的活性物質(zhì)溶液，攪拌；最后將0.5～4mg/ml的三聚磷酸鈉溶液以300～800μl/min的速率滴加到上述溶液中，獲得負(fù)載活性物質(zhì)的殼聚糖納米粒子溶液。

所述殼聚糖納米粒子對(duì)活性物質(zhì)的包埋率≥75％。

所述負(fù)載活性物質(zhì)的殼聚糖納米粒子，單個(gè)納米粒子的直徑為15-30nm。

所述的生物活性物質(zhì)包括功能蛋白與多肽、微生態(tài)調(diào)節(jié)劑(益生菌及益生元)、黃酮類(lèi)與多酚類(lèi)物質(zhì)、功能性油脂、生物堿、維生素、礦物元素。

所述同軸紡絲的工藝參數(shù)為：殼層紡絲液的流速為0.25～0.8ml/h，核層紡絲液的流速為0.2～0.75ml/h，內(nèi)層針頭直徑0.4～0.6mm，外層針頭直徑0.85～1.26mm，施中加電壓為15～30kv，接收距離為8-20cm。

所述的殼聚糖納米粒子溶液的pH為5～5.5；所述的聚乙烯醇溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6％～14％。

上述方法制備的核-殼結(jié)構(gòu)納米纖維膜，核層纖維直徑為200-300nm，殼層纖維直徑為300-500nm。

所述的核-殼結(jié)構(gòu)納米纖維膜在制備結(jié)腸靶向運(yùn)輸活性物質(zhì)中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

(1)本發(fā)明首次將同軸靜電紡絲技術(shù)應(yīng)用在活性物質(zhì)的結(jié)腸靶向控釋體系中，其顯著提高了活性功能物質(zhì)在結(jié)腸部位的釋放率，在16h內(nèi)可實(shí)現(xiàn)在結(jié)腸75％的釋放，在胃和小腸的釋放率較少，分別為4％和14％左右。

(2)本發(fā)明所制備的負(fù)載各種活性物質(zhì)的多糖基靜電紡結(jié)腸靶向控釋體系，以海藻酸鈉為主要?dú)硬牧?、殼聚糖為主要核層材料，材料?lái)源廣泛、具有良好的生物相容性、可降解性及酶解響應(yīng)性，能保證控釋體系結(jié)腸的靶向釋放。此外，負(fù)載納米粒子的核-殼結(jié)構(gòu)具有更優(yōu)良的釋放性能。

(3)本發(fā)明將靜電紡絲的應(yīng)用拓展到制備負(fù)載活性物質(zhì)的結(jié)腸靶向控釋體系的構(gòu)建中，靜電紡絲技術(shù)工藝簡(jiǎn)單、綠色環(huán)保且生產(chǎn)成本低，與其它方法制備活性物質(zhì)結(jié)腸靶向運(yùn)輸體系相比，靜電紡絲溫和的操作方式保證了活性物質(zhì)的生理活性，且所得的納米纖維膜比表面積大、孔隙率高，纖維直徑可控，提高了活性物質(zhì)的包埋率與釋放率。

(4)本發(fā)明適用的生物活性物質(zhì)，特別是對(duì)于功能蛋白和多肽類(lèi)生物大分子，可以避免這類(lèi)大分子在上消化道(低的胃酸環(huán)境及小腸中的蛋白酶)中的失活；還有可以治療哮喘、心絞痛、關(guān)節(jié)炎、結(jié)腸疾病如潰瘍性結(jié)腸炎、出血性結(jié)腸炎、克羅恩病及結(jié)腸癌等疾病的藥物，其可以減少化療藥物對(duì)胃腸道的刺激、提高局部藥物濃度從而提高療效。

(5)本發(fā)明制備的負(fù)載納米粒子的核-殼結(jié)構(gòu)納米纖維膜只需要制備納米粒子和和同軸靜電紡絲兩步即可完成，節(jié)省了時(shí)間和材料成本；同時(shí)還可以控制核-殼結(jié)構(gòu)的尺寸，進(jìn)而有效地控制活性物質(zhì)緩釋速度。

(6)本發(fā)明反應(yīng)條件溫和，對(duì)活性物質(zhì)的緩釋具有很好地控制，且制備的結(jié)腸靶向控釋體系具有明顯的結(jié)腸靶向性，提高了活性物質(zhì)的利用度。該結(jié)腸靶向控釋體系可用于功能性食品領(lǐng)域。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1制備的殼聚糖納米粒子TEM圖。

圖2為實(shí)施例1制備的結(jié)腸靶向控釋體系的SEM圖(a)、直徑分布圖(b)和TEM圖(c)。

圖3為實(shí)施例2制備的結(jié)腸靶向控釋體系的SEM圖。

圖4為實(shí)施例3制備的結(jié)腸靶向控釋體系的SEM圖。

圖5為實(shí)施例4制備的結(jié)腸靶向控釋體系的SEM圖。

圖6為實(shí)施例5制備的結(jié)腸靶向控釋體系的SEM圖。

圖7為實(shí)施例6制備的結(jié)腸靶向控釋體系的SEM圖。

圖8為實(shí)施例7制備的結(jié)腸靶向控釋體系的SEM圖。

圖9為實(shí)施例8制備的結(jié)腸靶向控釋體系的SEM圖。

圖10為實(shí)施例9制備的結(jié)腸靶向控釋體系在連續(xù)模擬消化液中的釋放曲線圖。

圖11為實(shí)施例10制備的結(jié)腸靶向控釋體系在連續(xù)模擬消化液中的代表性SEM圖(a，原纖維膜；b，模擬胃液中2h；c，模擬小腸液中4h；d，模擬結(jié)腸液中3h；e，模擬結(jié)腸液中8h；f，模擬結(jié)腸液中15h)。

圖12為實(shí)施例11制備的結(jié)腸靶向控釋體系在不同釋放介質(zhì)中的釋放曲線(1)及其相應(yīng)的數(shù)學(xué)擬合曲線(2)。

圖13為實(shí)施例12制備的結(jié)腸靶向控釋體系的紅外吸收光譜圖；

圖14為實(shí)施例13制備的結(jié)腸靶向控釋體系的熱重曲線的一階微分圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不限制發(fā)明的范圍。應(yīng)當(dāng)指出，在屬于本發(fā)明構(gòu)思范圍內(nèi)的前提下，可以進(jìn)行多種活性物質(zhì)的更改或變形，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1

一種基于靜電紡絲法制備的負(fù)載牛血清白蛋白的結(jié)腸靶向控釋體系的制備方法，具體步驟如下：

(1)采用離子交聯(lián)法制備負(fù)載活性物質(zhì)的殼聚糖納米粒子：以牛血清白蛋白為功能蛋白的模型，首先將中粘度的殼聚糖溶于(1％，v/v)的乙酸溶液，攪拌得到4mg/ml的殼聚糖溶液，然后調(diào)pH為5.3并用0.45μm膜過(guò)濾；然后向其中加入1.5mg/ml的牛血清白蛋白溶液，攪拌2h并調(diào)pH為5.3；最后將1mg/ml的三聚磷酸鈉溶液以400μl/min的速率滴加到上述溶液中，獲得殼聚糖納米粒子溶液。透射電鏡結(jié)果可知單個(gè)納米粒子的直徑為15-30nm，而采用粒度儀得到的納米粒子平均直徑為145nm，這主要是因?yàn)榧{米粒子在溶液中易發(fā)生團(tuán)聚(圖1)。

(2)殼層溶液的制備方法為：配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的聚合物溶液(海藻酸鈉：聚氧化乙烯＝8:2,w/w)，然后加入2％質(zhì)量分?jǐn)?shù)的泊洛沙姆F127，常溫下攪拌24h；

(3)核層溶液的制備方法為：首先將8g聚乙烯醇溶于100mL蒸餾水中，80℃下攪拌3h,得到8％聚乙烯醇溶液，然后冷卻至室溫；然后將(1)中所得負(fù)載活性物質(zhì)的殼聚糖納米粒子溶液與聚乙烯醇溶液以2:1的體積比進(jìn)行混合，攪拌均勻；

(4)將殼層紡絲液和核層紡絲液分別注入含有同軸針頭的靜電紡絲裝置中,在室溫下進(jìn)行同軸靜電紡絲,其中殼層紡絲液的流速為0.35ml/h,核層紡絲液的流速為0.3ml/h,內(nèi)層針頭直徑0.5mm，外層針頭直徑1mm，施中加電壓為17kv，接收距離為15cm。紡絲過(guò)程中溶劑揮發(fā)，得到負(fù)載納米粒子的核-殼結(jié)構(gòu)納米纖維膜。其中核層纖維直徑為200nm，殼層纖維直徑為320nm。

上述工藝條件下制備的納米纖維膜的SEM及TEM圖見(jiàn)圖2。

實(shí)施例2

本實(shí)施例與實(shí)施例1的不同之處在于紡絲電壓為10kv。

上述工藝條件下制備的結(jié)腸靶向控釋體系的SEM圖見(jiàn)圖3。

實(shí)施例3

本實(shí)施例與實(shí)施例1的不同之處在于紡絲電壓為25kv。

上述工藝條件下制備的結(jié)腸靶向控釋體系的SEM圖見(jiàn)圖4。

實(shí)施例4

本實(shí)施例與實(shí)施例1的不同之處在于接收距離為10cm。

上述工藝條件下制備的結(jié)腸靶向控釋體系的SEM圖見(jiàn)圖5。

實(shí)施例5

本實(shí)施例與實(shí)施例1的不同之處在于接收距離為18cm。

上述工藝條件下制備的結(jié)腸靶向控釋體系的SEM圖見(jiàn)圖6。

實(shí)施例6

本實(shí)施例與實(shí)施例1的不同之處在于殼層紡絲液的流速為0.65ml/h,核層紡絲液的流速為0.6ml/h。

上述工藝條件下制備的結(jié)腸靶向控釋體系的SEM圖見(jiàn)圖7。

實(shí)施例7

本實(shí)施例與實(shí)施例1的不同之處在于殼層溶液：配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14％的聚合物溶液(海藻酸鈉：聚氧化乙烯＝8:2,w/w)。

上述工藝條件下制備的結(jié)腸靶向控釋體系的SEM圖見(jiàn)圖8。

實(shí)施例8

本實(shí)施例與實(shí)施例1的不同之處在于核層溶液中負(fù)載活性物質(zhì)的殼聚糖納米粒子溶液與聚乙烯醇溶液的體積比為1:1。

上述工藝條件下制備的結(jié)腸靶向控釋體系的SEM圖見(jiàn)圖9。

實(shí)施例9

結(jié)腸靶向控釋體系在體外模擬胃腸道環(huán)境下釋放率的考察，具體步驟如下：

(1)按照實(shí)施例1中的方法，制備負(fù)載牛血清白蛋白的結(jié)腸靶向控釋體系；

(2)參考中國(guó)藥典2010版二部附錄體外釋放度測(cè)定法第二法(漿法)并作適當(dāng)修改，條件溫度為37±0.5℃，釋放介質(zhì)為模擬人工胃液750ml,人工腸液1000ml,人工結(jié)腸液900ml,將纖維膜分別置于胃液2h,隨后放入小腸液中4h，最后放入結(jié)腸液16h,于設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)取樣,同時(shí)補(bǔ)加等量等溫的溶出介質(zhì),取出樣品用0.45μm微孔濾膜濾過(guò),采用福林酚法測(cè)蛋白濃度,平行做三組,計(jì)算累積溶出率。

同時(shí)，取特定時(shí)間段的纖維膜通過(guò)SEM觀察纖維形貌的變化。

部分溶液的配制如下：

A人工胃液：量取濃鹽酸適量,利用pH計(jì),加水稀釋至pH1.2，然后加入10mg/ml胃蛋白酶即得。

B人工腸液:配置pH6.8的磷酸緩沖液，然后加入10mg/ml胰蛋白酶即得。

C人工結(jié)腸液：配置pH7.4的磷酸緩沖液，然后加入5U/mlβ-葡萄糖苷酶即得。

參考藥典規(guī)定的釋放度模擬試驗(yàn),模擬胃、小腸及結(jié)腸部位的環(huán)境,并根據(jù)食物在各段胃腸道內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間,研究蛋白質(zhì)的釋放。結(jié)果如圖10所示,由圖可知,納米纖維膜在模擬胃液中基本不釋放(<4％),在模擬小腸液中有部分蛋白釋放(<約14％),在模擬結(jié)腸液中緩慢釋放,累積釋放率約75％。結(jié)果表明制備的納米纖維膜有良好的結(jié)腸靶向性。

進(jìn)一步通過(guò)SEM觀察響應(yīng)時(shí)間段的纖維形貌可知(圖11)，在模擬胃液2h后(圖11b)，所得纖維膜形貌與原纖維膜(圖11a)無(wú)明顯變化；而在模擬小腸液中，由于殼層的溶解及核層聚乙烯醇的溶脹，纖維膜表面變得粗糙且纖維直徑變大(圖11c)；在模擬結(jié)腸液中(圖11d,e,f)，由于β-葡萄糖苷酶對(duì)殼聚糖的降解作用，纖維形貌發(fā)生明顯的改變，纖維直徑變細(xì)且有大量孔洞產(chǎn)生，并且隨著時(shí)間延長(zhǎng),孔洞增大，最終纖維膜崩解。

實(shí)施例10

結(jié)腸靶向控釋體系靶向釋放機(jī)制的研究，具體步驟如下：

(1)按照實(shí)施例1中的方法，制備負(fù)載牛血清白蛋白的結(jié)腸靶向控釋體系；

(2)按照實(shí)施例2中的方法測(cè)定結(jié)腸靶向控釋體系在體外模擬胃腸道環(huán)境下釋放率，不同之處在于分別考察在不同模擬液中的釋放度，胃液10h，小腸液10h，結(jié)腸液16h；

(3)采用一級(jí)釋放動(dòng)力學(xué)模型，Higuchi模型，Weibull模型和Ritger-peppas模型對(duì)纖維膜在不同模擬液中的累積釋放率(圖12a)進(jìn)行數(shù)學(xué)模型擬合(圖12b)，研究釋放機(jī)制。

根據(jù)擬合相關(guān)系數(shù)選擇相應(yīng)的釋放模型，由圖12b可知，在模擬胃液和小腸液中，釋放數(shù)據(jù)更接近Higuchi模型，說(shuō)明是釋放機(jī)制是Fickian擴(kuò)散；而在模擬結(jié)腸液中，釋放數(shù)據(jù)接近Weibull模型，說(shuō)明釋放機(jī)制是Complex機(jī)制，其包括擴(kuò)散、溶脹和溶蝕等作用。

實(shí)施例11

(1)按照實(shí)施例1中的方法，制備負(fù)載牛血清白蛋白的結(jié)腸靶向控釋體系；

(2)按照實(shí)施例2中的方法將結(jié)腸靶向控釋體系放置在不同模擬胃腸道環(huán)境下，取特定時(shí)間段的纖維膜并冷凍干燥。

(3)將(2)所得的納米纖維膜進(jìn)行紅外光譜掃描，結(jié)果見(jiàn)圖(13)。

由于所制備的納米纖維膜其殼層組成為海藻酸鈉和聚氧化乙烯，由圖5可知，海藻酸鈉的紅外特征吸收峰(1606cm^-1為-COO-的不對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)，1412cm^-1為-COO-對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)，1031cm^-1為C-O-C不對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng))與PEO的特征吸收峰(958,1102和1148cm^-1為-C-O-C的伸縮振動(dòng)三重吸收峰，1342,1240，1275和850cm^-1為C-H的吸收峰)均在纖維膜中呈現(xiàn)；當(dāng)纖維膜進(jìn)入模擬胃液后，由于聚氧化乙烯可溶于水其特征峰消失，而海藻酸鈉不溶于酸性環(huán)境其特征峰仍存在隨著纖維膜進(jìn)入模擬小腸液，殼層全部溶解，而核層殼聚糖的特征吸收峰可被檢測(cè)到(1610cm^-1為酰胺I帶的彎曲振動(dòng)吸收峰，1415cm^-1為酰胺II帶的特征吸收峰，酰胺III帶吸收峰在1339cm^-1，1094cm^-1為C-O的伸縮振動(dòng)峰，845cm^-1為β-糖苷鍵的特征吸收峰；而在模擬結(jié)腸液中，殼聚糖的特征峰下降或消失，表明由于β-葡萄糖苷酶對(duì)殼聚糖的降解作用，從而實(shí)現(xiàn)結(jié)腸靶向性。

實(shí)施例12

(1)按照實(shí)施例1中的方法，制備負(fù)載牛血清白蛋白的結(jié)腸靶向控釋體系；

(2)按照實(shí)施例2中的方法將結(jié)腸靶向控釋體系放置在不同模擬胃腸道環(huán)境下，取特定時(shí)間段的纖維膜并冷凍干燥。

(3)將(2)所得的納米纖維膜進(jìn)行熱重分析,溫度范圍為室溫至700℃,所得數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化熱重曲線的一階微分圖(DTG)。見(jiàn)圖(14)。

由圖14可知，經(jīng)過(guò)不同模擬液處理的纖維膜其DTG圖有明顯差別。實(shí)施例1和經(jīng)過(guò)模擬胃液處理的纖維膜具有相近的降解溫度(228℃ vs 221℃,395℃ vs 402℃),說(shuō)明模擬胃液對(duì)纖維膜影響不大；而經(jīng)過(guò)模擬小腸液和模擬結(jié)腸液處理的纖維膜，其DTG圖與實(shí)施例1有明顯區(qū)別，可以看到經(jīng)過(guò)小腸液處理的纖維膜呈現(xiàn)了殼聚糖和聚乙烯醇的降解溫度，而由于結(jié)腸液中β-葡萄糖苷酶對(duì)殼聚糖的降解作用，經(jīng)過(guò)結(jié)腸液處理的纖維膜其DTG圖的峰面積下降，表明殼聚糖已被降解，間接證明纖維膜的結(jié)腸靶向性。