本發(fā)明屬于納米生物醫(yī)藥材料領(lǐng)域，涉及一種新型的含三氯生聚合物膠束的制備及其在口腔變形鏈球菌選擇性殺滅中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

從理論上講，口腔微生物不斷與含有唾液涂層的(或防護(hù)薄膜)表面進(jìn)行著相互作用。在這些表面上，有的微生物可以先行附著，隨后再引導(dǎo)其它的微生物附著。宿主的飲食習(xí)慣，免疫反應(yīng)等系統(tǒng)因素將決定著整個(gè)口腔環(huán)境健康與否。例如，頻繁并過(guò)多地?cái)z入糖分會(huì)促進(jìn)毒性生物膜的發(fā)展。在這些生物膜中存在著高度致酸的微生物群落。這些微生物產(chǎn)生的酸會(huì)破壞牙釉質(zhì)，導(dǎo)致齲齒的形成。

為了應(yīng)對(duì)上述危機(jī)，近年來(lái)納米技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于對(duì)抗致病的口腔細(xì)菌。納米顆?？梢宰鳛榭咕鷦┑妮d體，在酸性ph下具有靶向細(xì)菌的功能性能，或者增強(qiáng)生物膜滲透和停留能力，或者在細(xì)菌分泌酶的作用下響應(yīng)性藥物釋放細(xì)菌酶，或者利用納米顆粒強(qiáng)陽(yáng)性表面電荷誘導(dǎo)直接細(xì)胞裂解。在大多數(shù)情況下，抗菌劑通常通過(guò)疏水相互作用封裝在納米載體中。因此，在體內(nèi)儲(chǔ)存，運(yùn)輸或循環(huán)期間的藥物泄漏是不可避免的。藥物共軛聚合物或使用含藥物的結(jié)構(gòu)單元來(lái)構(gòu)建聚合物可以很好解決藥物泄露問(wèn)題。而這樣的解決方案在抗癌藥物遞送系統(tǒng)中有很好的應(yīng)用。而在抗菌領(lǐng)域，人們急需開發(fā)一種利用含有抗菌劑的單體合成聚合物的新方法，并且用于防治致病的口腔細(xì)菌。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有封裝在納米載體中的抗菌劑在體內(nèi)儲(chǔ)存、運(yùn)輸或循環(huán)期間存在藥物泄漏的問(wèn)題，提供一種含三氯生的聚(β-氨酯)制備方法及在選擇性殺滅口腔變形鏈球菌生物被膜中的應(yīng)用。本發(fā)明同時(shí)利用活體成像技術(shù)對(duì)本發(fā)明體系中合成的新型含三氯生的聚(β-氨酯)對(duì)口腔變形鏈球菌(s.mutansatcc700610)的殺菌效率進(jìn)行評(píng)估。

本發(fā)明的聚合物膠束體系具備以下一些優(yōu)勢(shì)：1)利用含有三氯生的單體將極大提高抗菌劑的負(fù)載率；2)通過(guò)膠束的表面自適應(yīng)可以滲透和停留在生物被膜內(nèi)部，并增強(qiáng)和細(xì)菌的相互作用；3)在生物膜內(nèi)部酶的作用下，連接抗菌劑和聚合物之間的酯鍵發(fā)生斷裂，釋放抗菌劑；4)可以選擇性地殺滅口腔變形鏈球菌而不會(huì)殺滅口腔正常菌群唾液鏈球菌(s.salivariushb)。

本發(fā)明的技術(shù)方案：

一種含三氯生的聚乙二醇-b-聚(β-氨酯)聚合物膠束的制備方法，步驟如下：

1)將10-50毫克含三氯生的聚(β-氨酯)溶解于2-5毫升二甲基亞砜中，配制得到5-10毫克/毫升的溶液；

2)將步驟1)配制的聚合物有機(jī)溶液逐滴緩慢地加入到2500轉(zhuǎn)/分鐘攪拌條件下的5毫升去離子水中，水溶液逐漸由無(wú)色透明變?yōu)榉褐⑷跛{(lán)色乳光，證明膠束的形成；

3)將得到的膠束溶液在去離子水中用截留分子量為7000的透析袋透析一天，以除去有機(jī)溶劑。最后加入去離子水定容到10毫升，得到濃度為1毫克/毫升的膠束溶液。

其中，所述的含三氯生的聚(β-氨酯)制備步驟如下：

1)將聚乙二醇單丙烯酸酯(一倍量)溶解在干燥的氯仿中并置于schlenk瓶中；

2)加入含有三氯生的單體(五倍量或者十倍量)和tdp(五倍量或者十倍量)；

3)氮?dú)獗Ｗo(hù)下于55℃的油浴中反應(yīng)三天；

4)反應(yīng)完畢后冷至室溫，加入適量二氯甲烷稀釋，然后在冰乙醚中沉淀。待沉淀完全后，抽濾，濾餅用冰乙醚洗滌三次，真空干燥后所得到的白色粉末狀固體即為含三氯生的聚(β-氨酯)。

進(jìn)一步的，所述的含有三氯生的單體制備步驟如下：

1)將28.9克三氯生和31.5克3-(丙烯酰氧基)-2-((丙烯酰氧基)甲基)-2-甲基丙酸加入到干燥過(guò)的schlenk瓶中，并加入200毫升二氯甲烷進(jìn)行溶解；

2)加入24.9克edc·hcl和15.9克dmap；

3)體系在室溫下反應(yīng)12小時(shí)；

4)反應(yīng)完畢后加入1000毫升二氯甲烷將體系稀釋；

5)分別用1000毫升飽和碳酸鈉溶液和1000毫升稀鹽酸溶液洗滌；

6)分離得到有機(jī)相后用無(wú)水硫酸鎂干燥，過(guò)濾，真空除去有機(jī)溶劑；

7)粗產(chǎn)品用200-300目硅膠，石油醚/乙酸乙酯(5:1)做淋洗劑純化；

8)產(chǎn)品為無(wú)色液體。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：

本發(fā)明利用便宜易得的抗菌劑三氯生為原料，能夠以高于80％的收率合成含有三氯生的可聚合單體，通過(guò)不同單體的投入比例得到具有不同藥物負(fù)載率的聚合物。本發(fā)明有如下的優(yōu)勢(shì)：1)原料簡(jiǎn)單易得；2)合成收率高，容易大批量制備；3)有很好的生物膜滲透停留能力和細(xì)菌酯酶響應(yīng)性；4)可以選擇性地殺滅口腔變形鏈球菌而不會(huì)殺滅口腔正常菌群唾液鏈球菌(s.salivariushb)。

附圖說(shuō)明

圖1為聚乙二醇-b-聚(β-氨酯)聚合物膠束自組裝，響應(yīng)性機(jī)制示意圖及合成路線圖。

圖2為聚乙二醇-b-聚(β-氨酯)聚合物膠束對(duì)口腔變形鏈球菌生物膜的滲透能力測(cè)試結(jié)果。

圖3為聚乙二醇-b-聚(β-氨酯)聚合物膠束對(duì)口腔變形鏈球菌生物被膜選擇性殺滅。

圖4為聚乙二醇-b-聚(β-氨酯)聚合物膠束對(duì)唾液鏈球菌生物被膜殺滅效果圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：含三氯生的聚乙二醇-b-聚(β-氨酯)聚合物膠束的制備方法

(一)含有三氯生的單體制備，步驟如下：

1)將28.9克三氯生和31.5克3-(丙烯酰氧基)-2-((丙烯酰氧基)甲基)-2-甲基丙酸加入到干燥過(guò)的schlenk瓶中，并加入200毫升二氯甲烷將其溶解；

2)加入24.9克edc·hcl和15.9克dmap；

3)體系在室溫下反應(yīng)12小時(shí)；

4)反應(yīng)完畢后加入1000毫升二氯甲烷將體系稀釋；

5)分別用1000毫升飽和碳酸鈉溶液和1000毫升稀鹽酸溶液洗滌；

6)分離得到有機(jī)相后用無(wú)水硫酸鎂干燥，過(guò)濾，真空除去有機(jī)溶劑；

7)粗產(chǎn)品用200-300目硅膠，石油醚/乙酸乙酯(5:1)做淋洗劑純化；

8)所得含有三氯生的單體產(chǎn)品為無(wú)色液體。

(二)含三氯生的聚乙二醇-b-聚(β-氨酯)的制備，步驟如下：

1)將一倍量的聚乙二醇單丙烯酸酯溶解在干燥的氯仿中并置于schlenk瓶中；

2)加入步驟(一)制備的含有五倍量或者十倍量三氯生的單體和tdp；

3)氮?dú)獗Ｗo(hù)下于55℃的油浴中反應(yīng)三天；

4)反應(yīng)完畢后冷至室溫，加入適量二氯甲烷稀釋，然后在冰乙醚中沉淀。待沉淀完全后，抽濾，濾餅用冰乙醚洗滌三次，真空干燥后所得到的白色粉末狀固體即為含三氯生的聚(β-氨酯)。

(三)一種含三氯生的聚乙二醇-b-聚(β-氨酯)聚合物膠束的制備方法，步驟如下：

1)將10-50毫克含三氯生的聚(β-氨酯)溶解于2-5毫升二甲基亞砜中，配制得到5-10mgml^–1的溶液；

2)將聚合物有機(jī)溶液逐滴緩慢地加入到劇烈的攪拌條件下的5-10毫升去離子水中，水溶液逐漸由無(wú)色透明變?yōu)榉褐⑷跛{(lán)色乳光，證明膠束的形成；

3)將得到的膠束溶液在去離子水中用截留分子量為7000的透析袋透析一天，以除去有機(jī)溶劑。最后加入去離子水定容到10毫升，得到濃度為1毫克/毫升的膠束溶液。

實(shí)施例2：聚乙二醇-b-聚(β-氨酯)聚合物膠束對(duì)口腔變形鏈球菌生物膜的滲透能力測(cè)試實(shí)驗(yàn)。滲透能力測(cè)試實(shí)驗(yàn)步驟如下：

1)利用口腔變形鏈球菌在12孔板中培養(yǎng)生物膜48小時(shí)；

2)利用syto9對(duì)所得的生物膜樣品避光染色15分鐘；

3)得到的生物膜樣品與濃度為0.2毫克/毫升含有尼羅紅的聚乙二醇-b-聚(β-氨酯)聚合物膠束混合；

4)在60轉(zhuǎn)/分鐘，37℃下培養(yǎng)2分鐘；

5)生物膜樣品再利用tcssp2型激光共聚焦熒光顯微鏡觀測(cè)。用488納米波長(zhǎng)激發(fā)syto9和尼羅紅，接收波長(zhǎng)設(shè)置為490-540納米(綠色)and583-688納米(紅色)，掃描間隔設(shè)置為2微米；

6)得到的層掃熒光顯微照片利用imagej軟件處理得到每層照片中的熒光強(qiáng)度、熒光面積以及三維疊加照片。

附圖2給出了含三氯生的聚(β-氨酯)聚合物膠束對(duì)口腔變形鏈球菌生物膜的滲透能力測(cè)試結(jié)果：表明含三氯生的聚(β-氨酯)聚合物膠束能夠在2分鐘內(nèi)完全滲透生物膜，并能完全停留在生物膜內(nèi)部。

實(shí)施例3：含三氯生的聚(β-氨酯)聚合物膠束對(duì)口腔變形鏈球菌生物膜的選擇性殺滅能力實(shí)驗(yàn)。

步驟如下：

1)利用口腔變形鏈球菌在12孔板中培養(yǎng)生物膜48小時(shí)；

2)將新制備的聚乙二醇-b-聚(β-氨酯)聚合物膠束膠束或者三氯生溶液(三氯生濃度分別為100和200微克/毫升，唾液緩沖液，ph6.8)混合；

3)在60轉(zhuǎn)/分鐘，37℃下培養(yǎng)2分鐘后除去膠束溶液，再加入300微升唾液緩沖液；

4)在1小時(shí)，3小時(shí)和5小時(shí)后，利用live/dead染色劑對(duì)所得的生物膜樣品避光染色15分鐘；

5)生物膜樣品再利用tcssp2型激光共聚焦熒光顯微鏡觀測(cè)。用488納米波長(zhǎng)激發(fā)和propidiumiodide，接收波長(zhǎng)設(shè)置為490-540納米(綠色)and583-688納米(紅色)，掃描間隔設(shè)置為2微米；

6)得到的層掃熒光顯微照片利用imagej軟件處理得到每層照片中的熒光面積以及三維疊加照片。

7)細(xì)菌存活率定義為綠色熒光面積/(紅色熒光面積+綠色熒光面積)×100％

附圖3給出了含三氯生的聚(β-氨酯)聚合物膠束對(duì)口腔變形鏈球菌生物膜的選擇性殺滅能力評(píng)估結(jié)果，由圖可知聚合物膠束能夠有效地殺滅口腔變形鏈球菌，5小時(shí)后，能夠達(dá)到92％的殺菌率，而且鍵合在聚合物中的三氯生比未鍵合的三氯生在殺菌效果上有明顯的優(yōu)勢(shì)。

實(shí)施例4：聚乙二醇-b-聚(β-氨酯)聚合物膠束對(duì)唾液鏈球菌生物膜的選擇性殺滅能力實(shí)驗(yàn)。

步驟如下：

1)利用唾液鏈球菌在12孔板中培養(yǎng)生物膜48小時(shí)；

2)將新制備的聚乙二醇-b-聚(β-氨酯)聚合物膠束膠束或者三氯生溶液(三氯生濃度分別為100和200微克/毫升，唾液緩沖液，ph6.8)混合；

3)在60轉(zhuǎn)/分鐘，37℃下培養(yǎng)2分鐘后除去膠束溶液，再加入300微升唾液緩沖液；

4)在1小時(shí)，3小時(shí)和5小時(shí)后，利用live/dead染色劑對(duì)所得的生物膜樣品避光染色15分鐘；

5)生物膜樣品再利用tcssp2型激光共聚焦熒光顯微鏡觀測(cè)。用488納米波長(zhǎng)激發(fā)和propidiumiodide，接收波長(zhǎng)設(shè)置為490-540納米(綠色)and583-688納米(紅色)，掃描間隔設(shè)置為2微米；

6)得到的層掃熒光顯微照片利用imagej軟件處理得到每層照片中的熒光面積以及三維疊加照片。

7)細(xì)菌存活率定義為綠色熒光面積/(紅色熒光面積+綠色熒光面積)×100％

附圖4給出了含三氯生的聚(β-氨酯)聚合物膠束對(duì)唾液鏈球菌生物膜的選擇性殺滅能力評(píng)估結(jié)果，表明含三氯生的聚(β-氨酯)聚合物膠束對(duì)唾液鏈球菌只有20％左右的殺滅能力。

本發(fā)明由含有三氯生的單體通過(guò)michael加成合成了聚乙二醇-b-聚(β-氨酯)聚合物，其制備及作用機(jī)制參見(jiàn)附圖1。能夠在模擬刷牙過(guò)程的2分鐘內(nèi)完全滲透并停留在生物膜內(nèi)部(參見(jiàn)附圖2)。本發(fā)明中的：聚乙二醇-b-聚(β-氨酯)聚合物膠束可以選擇性地殺滅有害的口腔變形鏈球菌(參見(jiàn)附圖3)而對(duì)有益菌唾液鏈球菌(參見(jiàn)附圖4)則沒(méi)有明顯的殺滅效果。

需要說(shuō)明的是，本發(fā)明是針對(duì)三氯生鍵合的聚合物膠束制備方法，其目的是得到一種三氯生鍵合，具有響應(yīng)性聚合物膠束，同時(shí)將該膠束用于有害細(xì)菌生物膜的滲透和停留并測(cè)試其殺滅效果。本發(fā)明產(chǎn)品所具有的特點(diǎn)，但并非屬于對(duì)疾病的針對(duì)及治療。背景技術(shù)中所描述的相關(guān)治療等內(nèi)容，只是為了起到對(duì)本發(fā)明的背景的了解作用。另外，本發(fā)明不限于這里的實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的揭示，對(duì)于本發(fā)明做出的顯而易見(jiàn)的改進(jìn)和修飾都應(yīng)該在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。