本發(fā)明涉及一種化學(xué)修飾的糖胺聚糖(特別地，糖胺聚糖羧基化衍生物)、其制備方法，及其用于抑制腫瘤生長和/或轉(zhuǎn)移的用途。

背景技術(shù)：

1、隨著經(jīng)濟的快速發(fā)展、環(huán)境污染的加劇及人民生活方式的變化，惡性腫瘤已經(jīng)成為嚴重危害國人生命健康、制約社會經(jīng)濟發(fā)展的疾病。在全死因順位中，惡性腫瘤已經(jīng)成為近年來我國死因順位首位。

2、在大多數(shù)惡性腫瘤的發(fā)展進程中，腫瘤發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致癌癥患者死亡的主要原因。腫瘤轉(zhuǎn)移的步驟主要有腫瘤從原發(fā)部位脫離、血管浸潤、血管內(nèi)的運輸、與血管內(nèi)皮發(fā)生粘附、外滲出血管最終形成遠處轉(zhuǎn)移。有文獻報道，腫瘤微環(huán)境中的血管內(nèi)皮細胞，成纖維細胞，腫瘤相關(guān)免疫細胞、細胞外基質(zhì)、炎癥相關(guān)細胞因子等成分在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移和進展過程中扮演重要的角色，但具體機制尚未完全明晰。

3、乙酰肝素酶，又名類肝素酶，是一種β-葡萄糖醛酸內(nèi)切酶，其能夠斷裂硫酸乙酰肝素蛋白聚糖中的硫酸乙酰肝素(heparan?sulfate,hs)，例如多配體聚糖-1(syndecan-1)，從而釋放與硫酸乙酰肝素結(jié)合的生長因子。

4、過去二十年的大量研究工作表明，乙酰肝素酶表達在各種人類癌癥、肉瘤和血液惡性腫瘤中上調(diào)。還有研究表明升高的乙酰肝素酶水平可能與許多腫瘤類型的晚期進展和轉(zhuǎn)移相關(guān)。例如，高水平的乙酰肝素酶與患者較短的手術(shù)后存活時間相關(guān)。在vlodavsky和sanderson的實驗室已證明乙酰肝素酶在腫瘤轉(zhuǎn)移中的直接作用。

5、肝素是糖胺聚糖家族中的一種線形多分散的硫酸化多糖，其具有抗凝血和抗血栓形成活性。肝素的糖鏈由交替的糖醛酸和d-葡糖胺組成，主要的重復(fù)單元是2-o-硫酸化l-艾杜糖醛酸(idoa2s)和α(1→4)n-,6-o-二硫酸化d-葡糖胺(glcn6s)；較少組分是非硫酸化l-艾杜糖醛酸和d-葡萄糖醛酸，以及n-乙?；鵧-葡糖胺和n-,3-o-,6-o-三硫酸化d-葡糖胺(casu?b.,2005.“structure?and?active?domains?of?heparin.”in:chemistry?andbiology?of?heparin?and?heparan?sulfate.amsterdam:elsevier.1-28；casu?b.和lindahl?u.,2001,“structure?and?biological?interactions?of?heparin?and?heparansulfate.”adv?carbohydr?chem?biochem,57:159-206)。肝素可有效地抑制乙酰肝素酶，但由于肝素具備較強的抗凝血活性，將肝素以高劑量作為腫瘤治療劑使用是不可能的。出血風(fēng)險是評估抗凝藥物特別是肝素類似物安全性的必要指標(biāo)。

6、現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)公開了一類可作為乙酰肝素酶抑制劑的非抗凝血肝素，其中大部分包含結(jié)構(gòu)改造后的非硫酸化糖醛酸殘基，此類結(jié)構(gòu)可通過斷裂糖胺聚糖殘基上的2位-3位碳-碳鍵(二醇裂解)而使糖苷環(huán)開環(huán)獲得，但現(xiàn)有技術(shù)中的非抗凝血肝素療效或安全性相對較低，還有進一步提高的空間。

7、綜上，提供一種安全性高、腫瘤轉(zhuǎn)移抑制活性高的藥物是亟待解決的技術(shù)問題。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種化學(xué)修飾的糖胺聚糖，其具有良好的抗腫瘤活性，具體地，具有良好的抗腫瘤生長活性、抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性和安全性，特別是具有優(yōu)異的抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性和安全性。

2、化學(xué)修飾的糖胺聚糖

3、本發(fā)明提供一種化學(xué)修飾的糖胺聚糖，其包含式(i)的結(jié)構(gòu)單元、式(ii)的結(jié)構(gòu)單元、式(iii)的結(jié)構(gòu)單元和式(iv)的結(jié)構(gòu)單元：

4、

5、其中：

6、r1m、r1n、r1q在每次出現(xiàn)時各自獨立地選自h、-so3-和-(c＝o)ch3，并且r1m和r1n在每次出現(xiàn)時優(yōu)選為-so3-或-(c＝o)ch3；

7、r2m、r2n、r2q和r2x在每次出現(xiàn)時各自獨立地選自h和-so3-；

8、r3n在每次出現(xiàn)時各自獨立地選自h和-so3-；

9、r4m和r4n在每次出現(xiàn)時各自獨立地選自h和-so3-。

10、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述的化學(xué)修飾的糖胺聚糖的重均分子量為12000da-20000da，優(yōu)選為14000da-19000da、14500da-18800da、15000da-18700da，例如14500da、15000da、15200da、15500da、16000da、16200da、16500da、17000da、17500da、18000da、18500da。

11、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述的化學(xué)修飾的糖胺聚糖的艾杜糖醛酸含量為10.0％-70.0％，優(yōu)選20.0％-35.0％，優(yōu)選21.0％-26.0％，例如20.0％、21.0％、21.3％、22.0％、23.0％、25.0％、25.6％、26.0％、28.5％、30％、31.0％、32.0％、34.5％、35.0％、36.0％、37.0％、40.0％、43.0％、45.0％、50.0％、55.0％、6.00％。

12、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述的化學(xué)修飾的糖胺聚糖的糖醛酸開環(huán)度為25％-45％，優(yōu)選27％-44％，進一步優(yōu)選35％-44％，例如27.5％、28.5％、31％、32％、35％、36％、37％、43％、44％。

13、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述的化學(xué)修飾的糖胺聚糖的磺羧比(so3-/coo-)為1.2-1.8，優(yōu)選1.2-1.7，例如1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7。

14、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述的化學(xué)修飾的糖胺聚糖的羧基增量為1.1-1.8，優(yōu)選為1.15-1.60，例如1.15、1.20、1.25、1.30、1.35、1.40、1.45、1.50、1.55、1.60。

15、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述的化學(xué)修飾的糖胺聚糖的多分散系數(shù)為1.05-1.20，優(yōu)選1.10-1.19，例如1.12、1.13、1.14、1.15、1.16、1.17、1.18、1.19。

16、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述化學(xué)修飾的糖胺聚糖的分子量分布如下：

17、大于19000da?20％～38％(例如21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、35％)；

18、6000-19000da?62％～78％(例如64％、65％、66％、67％、68％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％)；

19、小于6000da?0％～1.5％(例如0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％)。

20、上述各百分比之和為100％。

21、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述化學(xué)修飾的糖胺聚糖的分子量分布如下：

22、 分子量范圍(da) 比例(重量％) 大于19000 21-37 6000-19000 64～78 小于6000 0～1.4

23、。

24、優(yōu)選地，所述化學(xué)修飾的糖胺聚糖的分子量分布如下：

25、 分子量范圍(da) 比例(重量％) 大于19000 23-36 6000-19000 64-77 小于6000 0.1～1.2

26、。

27、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，式(i)的結(jié)構(gòu)單元、式(ii)的結(jié)構(gòu)單元、式(iii)的結(jié)構(gòu)單元和式(iv)的結(jié)構(gòu)單元是沿著多糖鏈統(tǒng)計學(xué)分布的。

28、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述化學(xué)修飾的糖胺聚糖任選的進一步包含式(v)的結(jié)構(gòu)單元：

29、

30、其中：

31、r2t和r3t在每次出現(xiàn)時各自獨立地選自h和-so3-。

32、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述化學(xué)修飾的糖胺聚糖任選的進一步包含式(vi)的結(jié)構(gòu)單元：

33、

34、????????????

35、其中：

36、r2p在每次出現(xiàn)時各自獨立地選自h和-so3-。

37、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述化學(xué)修飾的糖胺聚糖任選的進一步包含式(vii)的結(jié)構(gòu)單元：

38、

39、其中：

40、r2r和r3r在每次出現(xiàn)時各自獨立地選自h和-so3-。

41、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述化學(xué)修飾的糖胺聚糖，任選的進一步包含式(viii)的結(jié)構(gòu)單元：

42、

43、其中：

44、r1s在每次出現(xiàn)時各自獨立地選自h、-so3-和-(c＝o)ch3，并且優(yōu)選為-so3-或-(c＝o)ch3；

45、r2s和r4s在每次出現(xiàn)時各自獨立地選自h和-so3-；

46、r3s在每次出現(xiàn)時為-so3-。

47、任選地，所述化學(xué)修飾的糖胺聚糖的一條或多條多糖鏈可以各自包含m個所述式(i)的結(jié)構(gòu)單元，其中m選自1-20的任意整數(shù)，包括端值；優(yōu)選選自1-15的任意整數(shù)，包括端值。

48、任選地，所述化學(xué)修飾的糖胺聚糖的一條或多條多糖鏈可以各自包含n個所述式(ii)的結(jié)構(gòu)單元，其中n選自1-10的任意整數(shù)，包括端值；優(yōu)選選自1-8的任意整數(shù)，包括端值。

49、任選地，所述化學(xué)修飾的糖胺聚糖的一條或多條多糖鏈可以各自包含q個所述式(iii)的結(jié)構(gòu)單元，其中q選自1-15的任意整數(shù)，包括端值；優(yōu)選選自1-10的任意整數(shù)，包括端值。

50、任選地，所述化學(xué)修飾的糖胺聚糖的一條或多條多糖鏈可以各自包含x個所述式(iv)的結(jié)構(gòu)單元，其中x選自0-10的任意整數(shù)，包括端值；優(yōu)選選自0-8的任意整數(shù)，包括端值；更優(yōu)選選自1-8的任意整數(shù)，包括端值。

51、任選地，所述化學(xué)修飾的糖胺聚糖的一條或多條多糖鏈可以各自包含t個所述式(v)的結(jié)構(gòu)單元，其中t選自0-6的任意整數(shù)，包括端值；優(yōu)選選自0-4的任意整數(shù)，包括端值；更優(yōu)選選自1-3的任意整數(shù)，包括端值。

52、任選地，所述化學(xué)修飾的糖胺聚糖的一條或多條多糖鏈可以各自包含p個所述式(vi)的結(jié)構(gòu)單元，其中p選自0-8的任意整數(shù)，包括端值；優(yōu)選選自0-4的任意整數(shù)，包括端值；更優(yōu)選選自1-3的任意整數(shù)，包括端值。

53、任選地，所述化學(xué)修飾的糖胺聚糖的一條或多條多糖鏈可以各自包含r個所述式(vii)的結(jié)構(gòu)單元，其中r選自0-8的任意整數(shù)，包括端值；優(yōu)選選自0-4的任意整數(shù)，包括端值。

54、任選地，所述化學(xué)修飾的糖胺聚糖的一條或多條多糖鏈可以各自包含s個所述式(viii)的結(jié)構(gòu)單元，其中s選自1-25的任意整數(shù)，包括端值；優(yōu)選選自1-15的任意整數(shù)，包括端值。

55、在本發(fā)明的化學(xué)修飾的糖胺聚糖的每條多糖鏈中，各結(jié)構(gòu)單元以任意順序排列。

56、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述化學(xué)修飾的糖胺聚糖中的式(i)的結(jié)構(gòu)單元的個數(shù)大于式(v)和式(vi)的結(jié)構(gòu)單元的個數(shù)的總和。

57、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述化學(xué)修飾的糖胺聚糖中的式(i)的結(jié)構(gòu)單元的個數(shù)與式(i)、式(v)和式(vi)的結(jié)構(gòu)單元的個數(shù)的總和的比值大于0.9。

58、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述化學(xué)修飾的糖胺聚糖中的式(i)的結(jié)構(gòu)單元的個數(shù)與式(i)和式(ii)的結(jié)構(gòu)單元的個數(shù)的總和的比值為0.1-0.4。

59、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述化學(xué)修飾的糖胺聚糖中的式(iv)的結(jié)構(gòu)單元的個數(shù)與式(i)、式(ii)、式(iii)和式(iv)的結(jié)構(gòu)單元的個數(shù)的總和的比值小于0.1。

60、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，糖醛酸環(huán)氧度小于25％，例如糖醛酸環(huán)氧度為0.001％-10％，優(yōu)選為0.001％-1％，如0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.010％、0.015％、0.018％。

61、本發(fā)明涵蓋各個實施方案的任意組合。

62、本文中的術(shù)語“硫酸化程度”是指磺羧比(so3-/coo-摩爾比率)，其通過根據(jù)casub.和gennaro?u.,1975,carbohydr?res?39,168-176的電導(dǎo)滴定來測定。

63、本文中的術(shù)語“羧基增量”是指原料的硫酸化程度與羧基化衍生物的硫酸化程度的比率。更具體地，原料的硫酸化程度是將原料經(jīng)第一個氧化步驟后獲得的糖胺聚糖中間體的樣品用nabh4還原后測定的硫酸化程度。

64、本文中的術(shù)語“糖醛酸開環(huán)度”是指開環(huán)的糖醛酸殘基數(shù)量/總的糖醛酸殘基數(shù)量，并且術(shù)語“糖醛酸環(huán)氧度”是指式(v)的具有環(huán)氧結(jié)構(gòu)的糖醛酸結(jié)構(gòu)單元占總糖醛酸殘基的比例。它們的檢測和計算參考文獻guerrini,m.,guglieri,s.,naggi,a.,sasisekharan,r.,&torri,g.(2007).low?molecular?weight?heparins:structuraldifferentiation?by?bidimentional?nuclear?magnetic?resonancespectroscopy.seminars?in?thrombosis?and?hemostasis,33,478–487中的核磁方法進行。

65、化學(xué)修飾的糖胺聚糖的制備方法

66、本發(fā)明提供上述化學(xué)修飾的糖胺聚糖的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：

67、a)任選地，以糖胺聚糖為起始物質(zhì)，制備得到含c2-羥基糖醛酸殘基的糖胺聚糖衍生物；優(yōu)選地在堿(例如氫氧化鈉、氫氧化鉀)和還原劑(例如硼氫化鈉)存在的條件下，進行冷凍干燥反應(yīng)后得到；

68、b)在將相鄰的二醇(鄰二醇)并任選地將相鄰的oh/nh2有效轉(zhuǎn)化為二醛的條件下，將糖胺聚糖的25％-45％(優(yōu)選30％-40％)的2-o-并任選地將2n-,3-o-非硫酸化殘基氧化；

69、所述氧化在氧化劑存在的條件下進行，所述氧化劑選自高碘酸、高碘酸鹽(例如高碘酸鈉、高碘酸鉀)中的一種；以及

70、c)在將所述二醛有效轉(zhuǎn)化為羧基的條件下，且在無氮氣保護下，將得自步驟b)的產(chǎn)物進一步氧化；

71、所述進一步氧化優(yōu)選通過亞氯酸鹽(例如亞氯酸鈉、亞氯酸鎂mg(clo2)2，亞氯酸鋇ba(clo2)2)進行；

72、d)將步驟c)的產(chǎn)物，通過陰離子交換純化系統(tǒng)進行分離、純化，得到所述化學(xué)修飾的糖胺聚糖。

73、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述化學(xué)修飾的糖胺聚糖的制備方法以糖胺聚糖作為起始原料，在受控條件下進行c2脫硫酸基，保持構(gòu)型不變，通過受控的鄰二醇裂解反應(yīng)將相鄰的二醇和任選的相鄰的oh/nh2有效轉(zhuǎn)化為醛，隨后將相應(yīng)的醛基在合適的氧化條件下形成相應(yīng)的羧基。

74、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述糖胺聚糖為來自任意動物和器官來源的天然肝素或者合成肝素(其任選地被化學(xué)或酶促修飾)，優(yōu)選，選自任選地2-o-和/或2-n-脫硫酸化的肝素、未分級肝素(ufh)、低分子量肝素(lmwh，其分子量為3,500-8,000da)和硫酸類肝素(hs)；所述糖胺聚糖具有0.8-2.8(優(yōu)選0.9-2.5)的磺羧比；所述糖胺聚糖更優(yōu)選選自任選地2-o-和/或2-n-脫硫酸化的未分級肝素和低分子量肝素。

75、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述糖胺聚糖的重均分子量為10000da至30000da，優(yōu)選為15000da至25000da，例如15000da至20000da、15000da至19000da或17000da至19000da。

76、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，肝素鏈可天然地包含約5％至35％的2-o-非硫酸化糖醛酸殘基、0％至50％的n-乙酰化葡萄糖胺殘基和約0％-6％的n-未取代的(既未n-硫酸化也未n-乙酰化)葡萄糖胺殘基。不同的硫酸化程度取決于肝素來源(動物種類、器官來源)以及提取操作。

77、糖胺聚糖的每個2-o-或2-n-非硫酸化殘基(不具有3-o-硫酸根取代基)易于進行開環(huán)(裂解)反應(yīng)，在氧化條件下，鄰位的二醇和oh/nh2可以進行向醛的轉(zhuǎn)化。

78、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述方法步驟a)中在堿(優(yōu)選氫氧化鈉、氫氧化鉀)和還原劑(優(yōu)選硼氫化鈉)存在的條件下，進行冷凍干燥反應(yīng)，脫除糖胺聚糖的糖醛酸結(jié)構(gòu)中c2位硫酸基團，可以得到艾杜糖醛酸結(jié)構(gòu)。

79、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟a)中，還原劑的摩爾量與起始物質(zhì)糖胺聚糖質(zhì)量的比為1.0-20.0mmol/g，優(yōu)選為2.0-10.0mmol/g，例如1.0mmol/g、2.6mmol/g、3.0mmol/g、4.0mmol/g、5.0mmol/g、6.0mmol/g、7.0mmol/g、8.0mmol/g、9.0mmol/g、10.0mmol/g、13.0mmol/g、16.0mmol/g。

80、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟a)中，堿的摩爾量與起始物質(zhì)糖胺聚糖質(zhì)量的比為5.0-25.0mmol/g，優(yōu)選為8.0-19.0mmol/g，例如8.0mmol/g、9.0mmol/g、10.0mmol/g、11.0mmol/g、12.0mmol/g、13.0mmol/g、14.0mmol/g、15.0mmol/g、16.0mmol/g、17.0mmol/g、18.0mmol/g、19.0mmol/g。

81、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟a)中，冷凍干燥采用低溫真空冷凍干燥機(例如lgj-20f)。

82、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟a)中，冷凍干燥反應(yīng)包括：預(yù)凍步驟、一次干燥步驟、二次干燥步驟。

83、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，預(yù)凍步驟具體為：30-200min將板層溫度降至-20℃～-80℃(例如-30～-40℃)，保持30-300min；例如60min將板層溫度降至-40℃，保持120min。

84、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，一次干燥步驟具體為：40-480min將板層溫度升至-10℃～15℃，保持720-4800min，真空度為5-80pa(優(yōu)選，真空度為10-30pa)；例如90min將板層溫度升至-5℃，保持720min，真空度為25±5pa。

85、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，二次干燥步驟具體為：30-240min將板層溫度升至25-60℃，保持300-1200min，真空度為5-50pa(優(yōu)選，真空度為5-25pa)；例如30min將板層溫度升至25℃，保持480min，真空度為10±5pa。

86、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟a)中，冷凍干燥曲線如表1所示：

87、表1

88、

89、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟a)具體包括以下步驟：

90、a1)將起始物質(zhì)糖胺聚糖的水溶液與還原劑(優(yōu)選硼氫化鈉)反應(yīng)；優(yōu)選地，在室溫下反應(yīng)；優(yōu)選地，反應(yīng)時間為10h-30h；優(yōu)選地，12h-24h攪拌反應(yīng)；

91、a2)向a1)步驟的反應(yīng)液中加入堿，調(diào)節(jié)ph至13.0以上，然后進行冷凍干燥反應(yīng)；

92、任選地，反應(yīng)結(jié)束后，用水溶解冷凍干燥后的固體，調(diào)節(jié)ph至3.8-4.0，繼續(xù)攪拌30min，回調(diào)ph至6.8-7.0；任選地進一步進行超濾除鹽、濾膜過濾。

93、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟b)中，所述氧化劑的摩爾量與起始物質(zhì)糖胺聚糖質(zhì)量之比為1.0-3.6mmol/g；優(yōu)選1.2-3.0mmol/g，例如1.2mmol/g、1.4mmol/g、1.6mmol/g、1.8mmol/g、2.0mmol/g、2.2mmol/g、2.4mmol/g、2.6mmol/g、2.8mmol/g、3.0mmol/g。

94、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟b)中，反應(yīng)溫度為0℃-20℃。

95、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟b)中，反應(yīng)時間為10h-30h，優(yōu)選12h-24h，例如12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h。

96、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟b)在避光條件下反應(yīng)。

97、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟b)中，反應(yīng)結(jié)束后，加入過量的終止試劑終止反應(yīng)；任選的進一步將反應(yīng)液進行透析(用于除鹽)處理。

98、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟b)中，所述終止試劑選自乙二醇、乙醇胺、甘油、葡萄糖、甘露糖、甘油醛、蘇糖、木糖中的一種或多種；優(yōu)選地，所述終止試劑選自乙二醇、乙醇胺、葡萄糖中的一種或多種。

99、所述方法步驟b)中，通過控制鄰二醇的裂解過程，可以特定的將(非硫酸化)艾杜糖醛酸結(jié)構(gòu)片段引入至終產(chǎn)物中。含有非硫酸化艾杜糖醛酸結(jié)構(gòu)片段的酸性糖胺聚糖具有良好的活性、安全性等相關(guān)性質(zhì)。

100、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，所述化學(xué)修飾的糖胺聚糖表現(xiàn)出0.6～1.4的羧基增量，其中所述羧基增量以原料的硫酸化程度與糖胺聚糖的硫酸化程度的比率的形式計算。更具體地，所述原料的硫酸化程度是將原料經(jīng)第一個氧化步驟(步驟b)后獲得的糖胺聚糖中間體的樣品用nabh4還原后測定的硫酸化程度。用于計算羧基增量的具體操作可參見cn105744940a。

101、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟c)中，亞氯酸鹽(例如亞氯酸鈉、亞氯酸鎂mg(clo2)2、亞氯酸鋇ba(clo2)2)摩爾量與起始物質(zhì)糖胺聚糖的質(zhì)量之比為4.0-13.0mmol/g，優(yōu)選6.5-9.0mmol/g，例如4.0mmol/g、4.5mmol/g、5.0mmol/g、5.5mmol/g、6.0mmol/g、6.5mmol/g、7.0mmol/g、7.5mmol/g、8.0mmol/g。

102、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟c)中，反應(yīng)溫度為0℃-15℃。

103、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟c)中，反應(yīng)ph為3.0-5.0，優(yōu)選3.5-4.5，例如3.5、4.0、4.5。

104、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟c)中，反應(yīng)時間為12h-36h，優(yōu)選18h-30h，例如16h、18h、20h、22h、24h、26h、28h、30h。

105、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟c)反應(yīng)結(jié)束后，調(diào)整反應(yīng)液ph至中性，加入乙醇，靜置后得沉淀。

106、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟c)中，所述沉淀的多分散系數(shù)為1.20-1.40，優(yōu)選1.22-1.30，例如1.22、1.23、1.24、1.25、1.26、1.27、1.28、1.29。

107、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟d)中，將步驟c)的產(chǎn)物用酸性水溶液溶解，上樣，通過陰離子交換純化系統(tǒng)進行分離、純化，即得所述化學(xué)修飾的糖胺聚糖。

108、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟d)中，所述酸性水溶液選自醋酸水溶液、磷酸水溶液、檸檬酸水溶液、磷酸二氫鈉水溶液中的一種或多種；優(yōu)選地，所述酸性水溶液的濃度為0.05％-10％(w/w％)，優(yōu)選地，0.2％-2％(w/w％)。

109、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟d)中，所述陰離子交換純化系統(tǒng)為弱陰離子交換純化系統(tǒng)、強陰離子交換純化系統(tǒng)中的一種；優(yōu)選地，所述陰離子交換純化系統(tǒng)為弱陰離子交換純化系統(tǒng)；優(yōu)選地，所述陰離子交換純化系統(tǒng)的色譜條件包括：填料選自deae?sepharosefast?flow、anx?sepharose?4ff、deae?seplife?ff中的一種。

110、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟d)中，所述陰離子交換純化系統(tǒng)的色譜條件包括：流動相a為酸性溶液；優(yōu)選地，所述酸性溶液中的酸選自醋酸、磷酸、檸檬酸、磷酸二氫鈉中的一種或多種，優(yōu)選地，所述酸性溶液中的酸為醋酸；優(yōu)選地，所述酸性溶液的濃度為0.05％-10％(w/w％)，優(yōu)選地，0.2％-2％(w/w％)，進一步優(yōu)選地，為0.1-0.5％的酸性水溶液；例如，流動相a為0.3％的醋酸水溶液。

111、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟d)中，所述陰離子交換純化系統(tǒng)的色譜條件包括：流動相b為含鹽的酸性溶液；優(yōu)選地，所述鹽選自氯化鈉、醋酸鈉、磷酸氫二鈉、高氯酸鈉中的一種或多種；優(yōu)選地，所述鹽在流動相b中的濃度為0.5-3mol/l；優(yōu)選地，所述酸性溶液中的酸選自醋酸、磷酸、檸檬酸、磷酸二氫鈉中的一種或多種，優(yōu)選地，所述酸性溶液中的酸為醋酸；所述酸性溶液的濃度為0.05％-10％(w/w％)，優(yōu)選地，0.2％-2％(w/w％)，進一步優(yōu)選地，為0.1-0.5％的酸性水溶液；例如，流動相b為含0.5-3mol/l(例如2mol/l)氯化鈉的0.1-0.5％(例如0.3％)醋酸水溶液。

112、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟d)中，所述陰離子交換純化系統(tǒng)的色譜條件包括：檢測器選自紫外檢測器、電導(dǎo)檢測器中的一種。

113、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟d)中，陰離子交換純化系統(tǒng)的色譜條件包括：

114、制備液相色譜儀(例如scg-030)，紫外檢測器(例如dad?600ex紫外檢測器)。

115、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，色譜柱填料為deae?sepharose?fast?flow，粒徑為90μm，尺寸為50mm×100mm；

116、優(yōu)選地，流動相a為0.1-0.5％(例如0.3％)的醋酸水溶液，流動相b為含0.5-3mol/l(例如2mol/l)氯化鈉的0.1-0.5％(例如0.3％)醋酸水溶液；

117、優(yōu)選地，流動相平均線速度為0.1～5.0cm/min；進一步優(yōu)選地，流動相平均線速度為0.5～2.0cm/min；更優(yōu)先地，流動相平均線速度為0.8～1.2cm/min(例如1.0cm/min)；

118、優(yōu)選地，室溫下上樣；

119、優(yōu)選地，運行時間300分鐘；

120、優(yōu)選地，梯度洗脫條件如表2所示：

121、表2

122、

123、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟d)中，洗脫過程2中，流動相b(％)為25％、26％、27％、28％、29％、30％。

124、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟d)中，洗脫過程3中，流動相b(％)為50％、51％、52％、53％、54％、55％。

125、根據(jù)本發(fā)明的實施方案，步驟d)中，收集洗脫過程3(210～300min)的洗脫液，調(diào)整ph至6.0-7.0，除鹽，濃縮、乙醇沉淀、加水溶解凍干后，即得所述化學(xué)修飾的糖胺聚糖。

126、本發(fā)明還提供由上述制備方法制備得到的化學(xué)修飾的糖胺聚糖。

127、本發(fā)明中，“本發(fā)明化合物”、“化學(xué)修飾的糖胺聚糖”、“本發(fā)明化學(xué)修飾的糖胺聚糖”可以相互替代使用，均表示如上所述化學(xué)修飾的糖胺聚糖。

128、本文中的術(shù)語“硫酸化程度”是指磺羧比(so3-/coo-摩爾比率)，其通過根據(jù)casub.和gennaro?u.,1975,carbohydr?res?39,168-176的電導(dǎo)滴定來測定。

129、本文中的術(shù)語“羧基增量”是指原料的硫酸化程度與羧基化衍生物的硫酸化程度的比率。更具體地，原料的硫酸化程度是將原料經(jīng)第一個氧化步驟后獲得的糖胺聚糖中間體的樣品用nabh4還原后測定的硫酸化程度。

130、本文中的術(shù)語“糖醛酸開環(huán)度”是指開環(huán)的糖醛酸殘基數(shù)量/總的糖醛酸殘基數(shù)量，并且術(shù)語“糖醛酸環(huán)氧度”是指式(v)的具有環(huán)氧結(jié)構(gòu)的糖醛酸結(jié)構(gòu)單元占總糖醛酸殘基的比例。它們的檢測和計算參考文獻guerrini,m.,guglieri,s.,naggi,a.,sasisekharan,r.,&torri,g.(2007).low?molecular?weight?heparins:structuraldifferentiation?by?bidimentional?nuclear?magnetic?resonancespectroscopy.seminars?in?thrombosis?and?hemostasis,33,478–487中的核磁方法進行。

131、藥物組合物和治療方法

132、本發(fā)明提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包含預(yù)防或治療有效量的本發(fā)明的糖胺聚糖以及一種或多種藥學(xué)上可接受的載體；所述藥物組合物優(yōu)選為固體制劑、半固體制劑、液體制劑或氣態(tài)制劑。

133、在一些實施方案中，所述藥物組合物還可包含一種或多種其它治療劑。

134、本發(fā)明還提供本發(fā)明的糖胺聚糖或者本發(fā)明的藥物組合物在制備用于抑制腫瘤生長和/或轉(zhuǎn)移的藥物中的用途。

135、本發(fā)明提供上述化學(xué)修飾的糖胺聚糖或者藥物組合物在制備用于治療和/或預(yù)防腫瘤/癌癥的藥物中的用途。

136、本發(fā)明提供本發(fā)明的糖胺聚糖或者本發(fā)明的藥物組合物，其用于抑制腫瘤生長和/或轉(zhuǎn)移。

137、本發(fā)明提供上述化學(xué)修飾的糖胺聚糖或者上述藥物組合物，其用于治療和/或預(yù)防腫瘤/癌癥。

138、本發(fā)明提供一種抑制腫瘤生長和/或轉(zhuǎn)移的方法，所述方法包括向需要其的個體給藥有效量的本發(fā)明的糖胺聚糖或者本發(fā)明的藥物組合物。

139、在一些實施方案中，所述腫瘤為實體瘤、血液腫瘤或軟組織腫瘤；優(yōu)選為實體瘤，例如乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、胃癌或肺癌。

140、本發(fā)明提供一種治療和/或預(yù)防腫瘤/癌癥的方法，所述方法包括向需要其的個體給藥有效量的本發(fā)明的糖胺聚糖或者本發(fā)明的藥物組合物。

141、在一些實施方案中，所述腫瘤為實體瘤、血液腫瘤或軟組織腫瘤；優(yōu)選為實體瘤，例如乳腺癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、胃癌或肺癌。

142、本發(fā)明中“藥學(xué)上可接受的載體”是指與治療劑一同給藥的稀釋劑、輔劑、賦形劑或媒介物，并且其在合理的醫(yī)學(xué)判斷的范圍內(nèi)適于接觸人類和/或其它動物的組織，而沒有過度的毒性、刺激、過敏反應(yīng)或與合理的益處/風(fēng)險比相應(yīng)的其它問題或并發(fā)癥。

143、在本發(fā)明的藥物組合物中可使用的藥學(xué)上可接受的載體包括但不限于無菌液體，例如水和油，包括那些石油、動物、植物或合成來源的油，例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。當(dāng)所述藥物組合物通過靜脈內(nèi)給藥時，水是示例性載體。還可以使用生理鹽水和葡萄糖及甘油水溶液作為液體載體，特別是用于注射液。適合的藥物賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽糖、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。所述組合物還可以視需要包含少量的濕潤劑、乳化劑或ph緩沖劑?？诜苿┛梢园瑯?biāo)準(zhǔn)載體，如藥物級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。適合的藥學(xué)上可接受的載體的實例如在remington’spharmaceuticalsciences(1990)中所述。

144、本發(fā)明的藥物組合物可以系統(tǒng)地作用和/或局部地作用。為此目的，它們可以適合的途徑給藥，例如通過注射(如靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)注射，包括滴注)或經(jīng)皮給藥；或通過口服、含服、經(jīng)鼻、透粘膜、局部、以眼用制劑的形式或通過吸入給藥。

145、對于這些給藥途徑，可以適合的劑型給藥本發(fā)明的藥物組合物。

146、所述劑型包括但不限于片劑、膠囊劑、錠劑、硬糖劑、散劑、噴霧劑、乳膏劑、軟膏劑、栓劑、凝膠劑、糊劑、洗劑、軟膏劑、水性混懸劑、可注射溶液劑、酏劑、糖漿劑。

147、如本文中所使用的術(shù)語“有效量”指被給藥后會在一定程度上緩解所治療病癥的一或多種癥狀的衍生物的量。

148、可調(diào)整給藥方案以提供最佳所需響應(yīng)。例如，可給藥單次推注，可隨時間給藥數(shù)個分劑量，或可如治療情況的急需所表明而按比例減少或增加劑量。要注意，劑量值可隨要減輕的病況的類型及嚴重性而變化，且可包括單次或多次劑量。要進一步理解，對于任何特定個體，具體的給藥方案應(yīng)根據(jù)個體需要及給藥組合物或監(jiān)督組合物的給藥的人員的專業(yè)判斷來隨時間調(diào)整。

149、所給藥的本發(fā)明的糖胺聚糖的量會取決于所治療的個體、病癥或病況的嚴重性、給藥的速率、糖胺聚糖的處置及處方醫(yī)師的判斷。一般而言，有效劑量在每日每kg體重約0.0001mg至約50mg，例如約0.01mg/kg/日至約10mg/kg/日(單次或分次給藥)。對70kg的人而言，這會合計為約0.007mg/日至約3500mg/日，例如約0.7mg/日至約700mg/日。在一些情況下，不高于前述范圍的下限的劑量水平可以是足夠的，而在其它情況下，仍可在不引起任何有害副作用的情況下采用較大劑量，條件是首先將所述較大劑量分成數(shù)個較小劑量以在一整天中給藥。

150、本發(fā)明的糖胺聚糖在藥物組合物中的含量或用量可以是約0.01mg至約1000mg，適合地是0.1mg-500mg，優(yōu)選0.5mg-300mg，更優(yōu)選1mg-150mg，特別優(yōu)選1-50mg，例如1.5mg、2mg、4mg、10mg、25mg等。

151、除非另外說明，否則如本文中所使用，術(shù)語“治療”意指逆轉(zhuǎn)、減輕、抑制這樣的術(shù)語所應(yīng)用的病癥或病況或者這樣的病癥或病況的一或多種癥狀的進展，或預(yù)防這樣的病癥或病況或者這樣的病癥或病況的一或多種癥狀。

152、如本文所使用的“個體”包括人或非人動物。示例性人個體包括患有疾病(例如本文所述的疾病)的人個體(稱為患者)或正常個體。本發(fā)明中“非人動物”包括所有脊椎動物，例如非哺乳動物(例如鳥類、兩棲動物、爬行動物)和哺乳動物，例如非人靈長類、家畜和/或馴化動物(例如綿羊、犬、貓、奶牛、豬等)。

153、有益效果

154、本發(fā)明提供一種化學(xué)修飾的糖胺聚糖，在保留部分糖胺聚糖的六元環(huán)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)下，通過反應(yīng)引入艾杜糖醛酸結(jié)構(gòu)并通過控制合適開環(huán)度得到具備良好抗腫瘤活性、良好安全性和優(yōu)異成藥性的本發(fā)明的化學(xué)修飾的糖胺聚糖，其具有良好的物理/化學(xué)穩(wěn)定性。本發(fā)明的化學(xué)修飾的糖胺聚糖具有良好的抗腫瘤活性，特別是抗腫瘤轉(zhuǎn)移和抗腫瘤生長活性，其穩(wěn)定性好、代謝穩(wěn)定、生物利用度好、毒副作用小、安全性好，可以被制成合適的制劑，提高的藥物安全性，改善患者依從性及給藥便利性。