本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容涉及將多能干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞的方法。本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容還涉及通過(guò)此類(lèi)方法制備的內(nèi)皮細(xì)胞、包含此類(lèi)內(nèi)皮細(xì)胞的類(lèi)器官及其使用方法。本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容還涉及供在上述中使用的分化培養(yǎng)基。

背景技術(shù)：

1、多能干細(xì)胞(psc)是未分化或部分分化的細(xì)胞，其可以分化為多種其他細(xì)胞類(lèi)型。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(ipsc)是一種源自成體體細(xì)胞的多能干細(xì)胞類(lèi)型，所述體細(xì)胞通過(guò)表達(dá)對(duì)維持胚胎干細(xì)胞(esc)最典型特性十分重要的基因及因子經(jīng)基因重編程為類(lèi)胚胎干細(xì)胞(esc)的狀態(tài)。ipsc最近在醫(yī)學(xué)界引起了關(guān)注，因?yàn)樗鼈兘鉀Q了許多與使用胚胎干細(xì)胞相關(guān)的障礙，并且能夠生成患者特異性的psc，這些細(xì)胞可以進(jìn)行基因校正、分化為成體細(xì)胞譜系，并作為自體移植物回輸?shù)酵换颊?。yamanaka?et?al.,cell?stem?cell.1(1):39-49(2007)；nishikawa?et?al.,nat.rev.mol.cell?biol.9:725(2008).除了用于遺傳性疾病外，ipsc還可用于組織再生和疾病建模。kogut?et?al.,methods?mol.biol.1195:1-12(2014)。psc和ipsc可以分化為許多不同的細(xì)胞類(lèi)型，包括內(nèi)皮細(xì)胞(ec)。jang?et?al.,am.j.pathol.189(3):502-512(2019)；gu?et?al.,curr.protoc.hum.genet.publishedonline?2018jul.6.doi:10.1002/cphg.64。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容提供用于將多能干細(xì)胞(psc)分化為內(nèi)皮細(xì)胞(ec)的方法。

2、在一些方面，所述方法包括：(i)在包含含有rho相關(guān)卷曲螺旋蛋白激酶(rock)抑制劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中涂覆膠原蛋白iv的表面上培養(yǎng)多能干細(xì)胞(例如，ipsc)；(ii)在包含糖原合成酶激酶3(gsk3)抑制劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中涂覆膠原蛋白iv的表面上培養(yǎng)(i)中的細(xì)胞；(iii)在包含成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(fgf2)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vegf)以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(bmp4)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中涂覆膠原蛋白iv的表面上培養(yǎng)(ii)中的細(xì)胞約4天；(iv)在包含fgf2和vegf的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中涂覆膠原蛋白iv的表面上培養(yǎng)(iii)中的細(xì)胞約2天，其中所述培養(yǎng)基不包含bmp4；以及(v)分離(iv)中具有cd144表達(dá)的細(xì)胞以形成內(nèi)皮細(xì)胞。

3、在一些方面，所述方法進(jìn)一步包括：(vi)在包含轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(tgfβ)抑制劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)(v)中所述具有cd144表達(dá)的細(xì)胞。

4、在一些方面，所述方法包括：(i)在包含rock抑制劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中涂覆膠原蛋白iv的表面上培養(yǎng)psc(例如，ipsc)；(ii)在包含gsk3抑制劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中涂覆膠原蛋白iv的表面上培養(yǎng)(i)中的細(xì)胞；(iii)在包含fgf2、vegf以及bmp4的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中涂覆膠原蛋白iv的表面上培養(yǎng)(ii)中的細(xì)胞；(iv)分離(iii)中具有cd144表達(dá)的細(xì)胞；以及(v)在包含tgfβ抑制劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中涂覆膠原蛋白i的表面上培養(yǎng)(v)中具有cd144表達(dá)的細(xì)胞以形成內(nèi)皮細(xì)胞。

5、在一些方面，所述rock抑制劑為y-27632。在一些方面，y-27632在培養(yǎng)基中以約10μm的濃度存在。

6、在一些方面，(i)中的培養(yǎng)為約1天。

7、在一些方面，所述gsk3抑制劑為chir99021。在一些方面，chir99021在培養(yǎng)基中以約36μm的濃度存在。

8、在一些方面，(ii)中的培養(yǎng)為約1天。

9、在一些方面，fgf在培養(yǎng)基中以約50μg/ml的濃度存在。

10、在一些方面，vegf在培養(yǎng)基中以約50μg/ml的濃度存在。

11、在一些方面，bmp4在培養(yǎng)基中以約50μg/ml的濃度存在。

12、在一些方面，細(xì)胞在(iii)和(iv)之間進(jìn)行傳代。

13、在一些方面，(iii)中的培養(yǎng)為約4天至約6天。

14、在一些方面，tgfβ抑制劑為sb431542。在一些方面，sb431542在培養(yǎng)基中以約10μm的濃度存在。

15、在一些方面，(vi)中的培養(yǎng)為約6天。在一些方面，(v)中的培養(yǎng)為約6天。

16、在一些方面，(iv)中的分離是通過(guò)免疫磁珠細(xì)胞分離法進(jìn)行的。在一些方面，(v)中的分離是通過(guò)免疫磁珠細(xì)胞分離進(jìn)行的。

17、在一些方面，(i)和/或(ii)中的培養(yǎng)是在低氧條件下進(jìn)行的。

18、本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容還提供了通過(guò)本文所公開(kāi)的分化方法制備的內(nèi)皮細(xì)胞、包含本文所公開(kāi)的內(nèi)皮細(xì)胞的類(lèi)器官以及它們的某些使用方法。

19、本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容還提供供在上述中使用的分化培養(yǎng)基。

技術(shù)特征：

1.一種將多能干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞的方法，其包括：

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)一步包括：

3.一種將多能干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞的方法，其包括：

4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述rock抑制劑為y-27632。

5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中y-27632在培養(yǎng)基中以約10μm的濃度存在。

6.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中(i)中的培養(yǎng)為約1天。

7.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述gsk3抑制劑為chir99021。

8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中chir99021在培養(yǎng)基中以約36μm的濃度存在。

9.如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的方法，其中(ii)中的培養(yǎng)為約1天。

10.如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的方法，其中fgf在培養(yǎng)基中以約50μg/ml的濃度存在。

11.如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中vegf在培養(yǎng)基中以約50μg/ml的濃度存在。

12.如權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的方法，其中bmp4在培養(yǎng)基中以約50μg/ml的濃度存在。

13.如權(quán)利要求1所述的方法，其中細(xì)胞在(iii)和(iv)之間傳代。

14.如權(quán)利要求3所述的方法，其中(iii)中的培養(yǎng)為約4天至約6天。

15.如權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述tgfβ抑制劑為sb431542。

16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中sb431542在培養(yǎng)基中以約10μm的濃度存在。

17.如權(quán)利要求1所述的方法，其中(vi)中的培養(yǎng)為約6天。

18.如權(quán)利要求3所述的方法，其中(v)中的培養(yǎng)為約6天。

19.如權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述分離是通過(guò)免疫磁珠細(xì)胞分離進(jìn)行的。

20.如權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)所述的方法，其中(i)和/或(ii)中的培養(yǎng)是在低氧條件下進(jìn)行的。

21.如權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述多能干細(xì)胞(psc)為胚胎干細(xì)胞(esc)、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(ipsc)、胚胎生殖細(xì)胞或成體干細(xì)胞。

22.一種內(nèi)皮細(xì)胞，其是通過(guò)如權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)所述的方法制備的。

23.一種類(lèi)器官，其包含如權(quán)利要求22所述的內(nèi)皮細(xì)胞。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容涉及使多能干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞的方法。本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容還涉及通過(guò)此類(lèi)方法制備的內(nèi)皮細(xì)胞、包含此類(lèi)內(nèi)皮細(xì)胞的類(lèi)器官及其使用方法。本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容還涉及供在上述中使用的分化培養(yǎng)基。

技術(shù)研發(fā)人員：A·庫(kù)珀,A·達(dá)瑪萬(wàn),E·費(fèi)德佐尼,K·王
受保護(hù)的技術(shù)使用者：朗格生物技術(shù)公共公益股份有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/8