相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本技術(shù)要求基于2022年9月27日提交的韓國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0-2022-0122187的優(yōu)先權(quán)的權(quán)益，并將相應(yīng)的韓國(guó)專利申請(qǐng)文件中公開的全部?jī)?nèi)容作為本說(shuō)明書的一部分并入。本發(fā)明涉及一種融合蛋白，包含無(wú)定形(無(wú)序、非結(jié)構(gòu)化)肽標(biāo)簽，其中，主要氨基酸由帶電氨基酸和疏水性氨基酸組成；一種包含其的用于純化重組蛋白的組合物；以及一種使用其純化重組蛋白的方法。

背景技術(shù)：

1、通常，his標(biāo)簽(或his6標(biāo)簽)或hat標(biāo)簽(天然組氨酸親和標(biāo)簽)與mbp(麥芽糖結(jié)合蛋白)標(biāo)簽、gst(谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶)標(biāo)簽一起廣泛用于重組蛋白的純化。使用his標(biāo)簽純化重組蛋白的一般方法是通過以下方法純化它們：將his標(biāo)簽與重組蛋白融合，以使其與ni2+-nta珠(或樹脂)或co2+-cma珠結(jié)合(其中，通過親和層析固定化鎳離子或鈷離子)，然后通過過量的咪唑或低ph處理洗脫與珠結(jié)合的重組蛋白。換句話說(shuō)，使用以下原理洗脫與his標(biāo)簽融合的重組蛋白：具有與氨基酸組氨酸類似結(jié)構(gòu)的咪唑與his標(biāo)簽競(jìng)爭(zhēng)并結(jié)合ni2+-nta珠或co2+-cma珠(kerpe?k.2003)。像這樣，用于純化包括蛋白質(zhì)藥物的重組蛋白的最廣泛使用的方法是使用親和標(biāo)簽或使用對(duì)抗體具有結(jié)合親和力的蛋白質(zhì)a的吸附(親和)色譜法。然而，這樣的純化方法具有各種問題，使得它們應(yīng)該通過耗時(shí)、復(fù)雜的多步驟純化工藝，并且由于對(duì)珠具有非特異性結(jié)合能力的蛋白質(zhì)的污染使純化純度略有降低，以及在純化后需要去除大尺寸標(biāo)簽的工藝，并且難以使用回收的珠生產(chǎn)其他類型的重組蛋白等。這些問題作為限制純化步驟規(guī)?；驮黾由a(chǎn)成本的主要因素。

2、另一方面，已經(jīng)對(duì)可以成核或形成多聚體如二聚體的基序、結(jié)構(gòu)域或肽進(jìn)行了許多研究。據(jù)報(bào)道，通過在形成螺旋結(jié)構(gòu)的異亮氨酸拉鏈肽中人工誘導(dǎo)組氨酸殘基，來(lái)形成依賴于ni2+、zn2+、cu2+的金屬離子的三聚體。此外，已知具有螺旋結(jié)構(gòu)的tz1h肽也通過ag2+或ph依賴性結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化形成三聚體。此外，已經(jīng)報(bào)道了作為在各種物種中發(fā)現(xiàn)的鐵儲(chǔ)存蛋白的鐵蛋白具有結(jié)合鐵離子的能力，并且24種鐵蛋白的蛋白被組合以形成一種鐵蛋白復(fù)合物。此外，已知α-螺旋(α-helical)肽18a、β-鏈(β-strand)肽elk16。兩親性表面活性劑樣肽l6kd和疏水性肽gfil8等在細(xì)胞中形成包涵體。此外，已經(jīng)報(bào)道elp(類彈性蛋白多肽)經(jīng)歷蛋白質(zhì)聚集，并且已經(jīng)進(jìn)行了將該特性應(yīng)用于重組蛋白質(zhì)純化的研究，并且已經(jīng)報(bào)道了鈣調(diào)蛋白和m13肽以鈣離子依賴的方式特異性結(jié)合，atox1和wd4之間的結(jié)合能力取決于zn2+、cu2+、pt2+，以及frb(fkbp12-雷帕霉素結(jié)合蛋白)和fkbp(fk506結(jié)合蛋白)在雷帕霉素的存在下特異性結(jié)合。

3、在上述技術(shù)或特定蛋白的基序、結(jié)構(gòu)域或肽的特征背景下，本發(fā)明人完成了本發(fā)明，其可以解決用于純化重組蛋白的常規(guī)方法的問題，并且通過特定誘導(dǎo)劑或條件處理來(lái)誘導(dǎo)大分子(超分子)組裝體形成，而可以通過簡(jiǎn)單的方法(例如離心或過濾)選擇性地純化高純度重組蛋白，這是與常規(guī)方法完全不同的構(gòu)思。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、技術(shù)問題

2、本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是解決常規(guī)重組蛋白方法(即純化過程)中的各種問題，例如使用昂貴的珠粒或樹脂、需要昂貴的純化裝置或設(shè)備、消耗大量時(shí)間、經(jīng)過多步驟復(fù)雜過程等，并且涉及通過特定誘導(dǎo)劑或條件依賴的方式誘導(dǎo)與重組蛋白融合的標(biāo)簽大分子自組裝體的形成，僅通過簡(jiǎn)單方法(例如離心、過濾等)來(lái)分離和純化目標(biāo)重組蛋白的方法。由此，開發(fā)了一種具有競(jìng)爭(zhēng)力的用于純化重組蛋白的下一代方法，該方法不需要昂貴的珠?；驑渲?，并且可以非常容易、快速、簡(jiǎn)單、高純度、高效率和低成本地純化重組蛋白。

3、本公開的一種實(shí)例提供了一種形成自組裝體的無(wú)定形標(biāo)簽，其中，主要氨基酸由帶電氨基酸和疏水性氨基酸組成。

4、本技術(shù)的另一種實(shí)施方式提供了一種融合多肽，包含由seq?id?no:1表示的第一多肽以及為肽標(biāo)簽的第二多肽，在所述肽標(biāo)簽中，主要氨基酸由帶電氨基酸和疏水性氨基酸組成。

5、本技術(shù)的其它實(shí)施方式提供一種融合蛋白，包含融合多肽和靶蛋白，所述融合多肽包含第一多肽和第二多肽。

6、本技術(shù)的其它實(shí)施方式提供了一種多核苷酸，編碼包含第一多肽和第二多肽的融合多肽，或包含融合多肽和靶蛋白的融合蛋白。

7、本技術(shù)的其它實(shí)施方式提供了一種表達(dá)載體，包含多核苷酸，所述多核苷酸編碼包含第一多肽和第二多肽的融合多肽或包含融合多肽和靶蛋白的融合蛋白。

8、本技術(shù)的其它實(shí)施方式提供了一種用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。

9、本技術(shù)的其它實(shí)施方式提供了一種純化靶蛋白的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含多核苷酸的細(xì)胞，所述多核苷酸編碼包含第一多肽和第二多肽的融合多肽或包含融合多肽和靶蛋白的融合蛋白。

10、本技術(shù)的其它實(shí)施方式提供了一種用于純化蛋白質(zhì)的組合物，包含由seq?id?no:1表示的第一多肽和/或由選自由seq?id?no:2至seq?id?no:5所組成的組中的一種氨基酸序列表示的第二多肽。

11、本技術(shù)的其他實(shí)施方式提供了一種自組裝體，包含由seq?id?no:1表示的第一多肽和/或由選自由seq?id?no:2至seq?id?no:5所組成的組中的一種氨基酸序列表示的第二多肽。

12、技術(shù)方案

13、本技術(shù)中公開的每個(gè)描述和實(shí)施方式也可以應(yīng)用于每個(gè)其他描述和實(shí)施方式。換句話說(shuō)，本技術(shù)中公開的各元素的所有組合都屬于本技術(shù)的范圍。此外，本技術(shù)的范圍不能被認(rèn)為受到下文所述的具體描述的限制。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員僅使用普通實(shí)驗(yàn)即可識(shí)別或確認(rèn)本技術(shù)中公開的本技術(shù)具體方面的許多等同物。此外，這些等同物旨在包括在本技術(shù)中。

14、為了實(shí)現(xiàn)上述本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了一種無(wú)定形肽標(biāo)簽，其中，主要氨基酸由帶電氨基酸和疏水性氨基酸組成。

15、形成自組裝體的無(wú)定形肽標(biāo)簽(其中，主要氨基酸由帶電氨基酸和疏水性氨基酸組成)的帶電氨基酸可以選自賴氨酸(lys，k)、精氨酸(arg，r)和組氨酸(his，h)的帶正電荷的氨基酸，以及天冬氨酸(asp，d)和谷氨酸(glu，e)的帶負(fù)電荷的氨基酸，并且疏水性氨基酸可以選自丙氨酸(ala，a)、纈氨酸(val，v)、亮氨酸(leu，l)、異亮氨酸(ile，i)、脯氨酸(pro，p)、苯丙氨酸(phe，f)、甲硫氨酸(met，m)和色氨酸(trp，w)，并且其特征在于，除了鉸鏈區(qū)或連接位點(diǎn)之外的α-螺旋標(biāo)簽中的帶電氨基酸和疏水性氨基酸的含量為60％或更多、65％或更多、70％或更多，優(yōu)選75％或更多。

16、無(wú)定形肽標(biāo)簽可以是選自由psiaeh標(biāo)簽、psiahek標(biāo)簽、psihekihek標(biāo)簽和psia標(biāo)簽所組成的組中的任何一種，并且可以是能夠成核或形成多聚體如二聚體等的肽。

17、無(wú)定形肽標(biāo)簽可包含選自由seq?id?no:2至seq?id?no:5所組成的組中的氨基酸序列或由其組成。

18、在本說(shuō)明書中使用的術(shù)語(yǔ)“無(wú)定形肽標(biāo)簽”可以指包含在正常條件下不具有固定構(gòu)象的無(wú)序區(qū)域的肽，例如α-螺旋或β-螺旋的二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)，并且術(shù)語(yǔ)“無(wú)定形肽標(biāo)簽”可以與“非結(jié)構(gòu)化肽標(biāo)簽”或“第二多肽”互換使用。

19、此外，本發(fā)明提供了無(wú)定形肽標(biāo)簽或融合蛋白(其中無(wú)定形肽標(biāo)簽和靶蛋白融合)、編碼其的多核苷酸、表達(dá)其的載體和用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。

20、此外，本發(fā)明提供了一種純化靶蛋白的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含編碼無(wú)定形肽標(biāo)簽或重組融合蛋白的多核苷酸的細(xì)胞，在所述重組融合蛋白中，肽標(biāo)簽和靶蛋白融合。

21、此外，本發(fā)明提供了一種用于純化蛋白質(zhì)的組合物，包含無(wú)定形肽標(biāo)簽或包含融合蛋白，所述融合蛋白包含無(wú)定形肽標(biāo)簽和靶蛋白。

22、此外，本發(fā)明提供一種融合多肽，包含含有seq?id?no:1的氨基酸序列的第一多肽和主要氨基酸由帶電氨基酸和疏水性氨基酸組成的具有無(wú)定形特征的第二多肽。

23、第一多肽可以是純化標(biāo)簽。具體地，第一多肽可以是能夠結(jié)合ni2+或co2+的his標(biāo)簽、其原始形式的hat標(biāo)簽或his標(biāo)簽的修飾的hq標(biāo)簽(或hq6標(biāo)簽)，但不限于此。his標(biāo)簽可包含seq?id?no:1的氨基酸序列，并且可以由seq?id?no:1的氨基酸序列表示或由其組成。

24、第二多肽可以是能夠成核或形成多聚體如二聚體等的基序、結(jié)構(gòu)域或肽。具體地，第二多肽可以是選自由psiaeh、psiahek、psihekihek和psia肽所組成的組中的任何一種，但不限于此。

25、第二多肽可包含選自由seq?id?no:2至seq?id?no:5所組成的組中的一種氨基酸序列或由其組成。psiaeh、psiahek、psihekihek和psia肽可分別由以下氨基酸表示或由以下氨基酸組成：seq?id?no:2、seq?id?no:3、seq?id?no:4和seq?id?no:5。

26、第一多肽和第二多肽可以順序連接。

27、此外，本發(fā)明提供了一種包含融合多肽和靶蛋白的融合的重組融合蛋白，所述融合多肽包含第一多肽和第二多肽。

28、包含第一多肽和第二多肽的融合多肽不僅可以插入靶蛋白的c末端，而且可以插入n末端或蛋白內(nèi)的任何位置，只要它基本上不影響該蛋白的功能。在本文中，基本上不影響蛋白質(zhì)的功能是指在融合多肽融合之前蛋白質(zhì)的活性保持80％或更多，優(yōu)選95％或更多。

29、在本發(fā)明中，“重組蛋白”是指包含至少2部分的氨基酸(肽、寡肽、多肽或蛋白質(zhì))的聚合物，其中每一部分包含單獨(dú)的功能。重組蛋白的至少一個(gè)第一部分包含至少一種含有本發(fā)明的第一多肽和第二多肽的融合多肽，并且重組蛋白的至少一個(gè)第二部分包含至少一種靶蛋白(或肽)。

30、在本發(fā)明中，“靶蛋白”是指任何以生產(chǎn)或純化為目的的蛋白，包括肽，并且本說(shuō)明書中可以與術(shù)語(yǔ)“靶蛋白”互換使用。

31、作為靶蛋白，綠色熒光蛋白(gfp)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(csf)、干擾素α2(inf-α2)和tev蛋白酶，但不限于此。術(shù)語(yǔ)“靶蛋白”是指通過根據(jù)本發(fā)明的生物技術(shù)方法生產(chǎn)的蛋白，不特別限于任何一種，優(yōu)選地包括可用于醫(yī)療、工業(yè)、診斷和實(shí)驗(yàn)用途等的蛋白。

32、融合蛋白還可以是包含第一多肽和第二多肽的融合多肽與靶蛋白之間的蛋白酶的切割位點(diǎn)、免疫球蛋白的鉸鏈區(qū)、靶蛋白或它們?nèi)俊?/p>

33、鉸鏈區(qū)可包含seq?id?no:20的氨基酸序列，或由其組成。

34、融合蛋白可以包含在融合多肽和靶蛋白之間的通常用于蛋白純化的切割位點(diǎn)，例如tev蛋白酶切割位點(diǎn)或可以被ni2+等切割的snac標(biāo)簽，以去除重組融合蛋白中包含第一多肽和第二多肽的融合多肽。

35、此外，本發(fā)明提供一種包含第一多肽和第二多肽的融合多肽，或編碼包含融合多肽和靶蛋白的融合蛋白的多核苷酸。

36、多核苷酸包含編碼第一多肽和第二多肽的每個(gè)多核苷酸。編碼第一多肽的多核苷酸可以包含seq?id?no:21的核苷酸序列或由其組成，并且編碼第二多肽的多核苷酸可以包含選自seq?id?no:22至seq?id?no:25的核苷酸序列中的一種核苷酸序列或由其組成。

37、本說(shuō)明書中描述的序列表中的核苷酸序列，即使沒有單獨(dú)的說(shuō)明，也是在從5’端到3’端的方向上描述的。

38、此外，本發(fā)明提供了一種重組表達(dá)載體，包括包含第一多肽和第二多肽的融合多肽，或編碼包含融合多肽和靶蛋白的融合蛋白的多核苷酸。

39、在本發(fā)明中，重組體可以與遺傳操作互換使用，是指通過使用分子克隆技術(shù)(例如修飾、切割、連接基因等)生產(chǎn)天然不存在的類型的基因。

40、在本發(fā)明中，表達(dá)是指在細(xì)胞中產(chǎn)生蛋白質(zhì)或核酸。

41、在本發(fā)明中，重組表達(dá)載體是能夠在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)靶蛋白或核酸(rna)的載體，并且是指包含可操作地連接以表達(dá)多核苷酸(基因)插入物的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的基因構(gòu)建體。

42、在本說(shuō)明書中，“可操作地連接”是指核酸表達(dá)調(diào)節(jié)序列和編碼靶蛋白或rna的核酸序列處于功能性連接，以發(fā)揮一般功能，并且它們連接為使得基因可以通過表達(dá)調(diào)控序列來(lái)表達(dá)。表達(dá)調(diào)控序列是指控制在特定宿主細(xì)胞中可操作地連接的多核苷酸序列表達(dá)的dna序列。該調(diào)控序列包含進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子、調(diào)控轉(zhuǎn)錄的任何操縱子序列、編碼適當(dāng)?shù)膍rna核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列、調(diào)控轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列、起始密碼子、終止密碼子、多聚腺苷酸化信號(hào)和增強(qiáng)子等。

43、本發(fā)明的重組表達(dá)載體的類型沒有特別限制，只要是克隆領(lǐng)域常用的載體即可，并且實(shí)例包括質(zhì)粒載體、粘粒載體、噬菌體載體和病毒載體等，但不限于此。質(zhì)粒包括大腸桿菌(e.coli)來(lái)源的質(zhì)粒(pbr322、pbr325、puc118和puc119、pet-22(+))、枯草芽孢桿菌(bacillus?subtilis)來(lái)源的質(zhì)粒(pub110和ptp5)以及酵母來(lái)源的質(zhì)粒(ppicz、yep13、yep24和ycp50)等，并且作為病毒，可以使用動(dòng)物病毒例如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒或痘苗病毒，昆蟲病毒例如桿狀病毒等，并且優(yōu)選地可以使用pet-28a載體。

44、此外，本發(fā)明提供了用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，所述表達(dá)載體包含編碼融合多肽或融合蛋白的多核苷酸，所述融合多肽包含第一多肽和第二多肽，所述融合蛋白包含所述融合多肽和靶蛋白。

45、根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞的類型沒有特別限制，只要是可用于表達(dá)包含在本發(fā)明的重組表達(dá)載體中的多核苷酸的細(xì)胞即可。用根據(jù)本發(fā)明的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(宿主細(xì)胞)可以是原核生物(例如，大腸桿菌)、真核生物(例如，酵母或其他真菌)、植物細(xì)胞(例如，煙草或番茄植物細(xì)胞)、動(dòng)物細(xì)胞(例如，人細(xì)胞、猴細(xì)胞、倉(cāng)鼠細(xì)胞、大鼠細(xì)胞、小鼠細(xì)胞)、昆蟲細(xì)胞或由其衍生的雜交瘤，優(yōu)選地，可以是大腸桿菌，但不限于此。

46、根據(jù)本發(fā)明的重組表達(dá)載體可以通過本領(lǐng)域已知的方法(例如但不限于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、顯微注射、轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞融合、磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、deae葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、聚凝胺介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、基因槍和將核酸流入細(xì)胞的已知方法)引入細(xì)胞內(nèi)來(lái)轉(zhuǎn)化，以生產(chǎn)抗體或其片段。用根據(jù)本發(fā)明的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可過表達(dá)或大量生產(chǎn)本發(fā)明的融合蛋白。

47、此外，本發(fā)明提供一種純化靶蛋白的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，所述表達(dá)載體包含編碼融合多肽或融合蛋白的多核苷酸，所述融合多肽包含第一多肽和第二多肽，所述融合蛋白包含融合多肽和靶蛋白。

48、融合多肽或靶蛋白的含量如上所述。

49、純化靶蛋白的方法可以進(jìn)一步包括在培養(yǎng)后從宿主細(xì)胞提取融合蛋白。

50、用于提取融合蛋白的緩沖溶液可以是例如hepes、tris或磷酸鹽等一般(通常)用于提取蛋白質(zhì)的緩沖溶液，并且優(yōu)選地其可以是hepes緩沖溶液，但不限于此。

51、在提取融合蛋白時(shí)，可以添加表面活性劑例如trion?x-100以提高細(xì)胞裂解效率，并且可以添加其中混合各種蛋白酶抑制劑的蛋白酶抑制劑混合物以抑制蛋白水解。

52、純化靶蛋白的方法還可以包括誘導(dǎo)從宿主細(xì)胞獲得的融合蛋白的自組裝體的形成，所述宿主細(xì)胞用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化，所述表達(dá)載體包含編碼融合多肽或融合蛋白的多核苷酸，所述融合多肽包含第一多肽和第二多肽，所述融合蛋白包含所述融合多肽和靶蛋白。

53、誘導(dǎo)自組裝體的形成還可以包括在特定條件下處理以促進(jìn)自組裝體的形成。誘導(dǎo)自組裝體的形成的特定條件可以是物理-化學(xué)條件，例如誘導(dǎo)劑的種類、誘導(dǎo)劑的濃度、鹽的類型、鹽的濃度、ph條件、緩沖溶液的類型、溫度、反應(yīng)時(shí)間等。

54、誘導(dǎo)自組裝體的形成可以包括添加誘導(dǎo)劑以促進(jìn)自組裝體的形成。根據(jù)添加誘導(dǎo)劑，可以促進(jìn)誘導(dǎo)大分子自組裝體的形成。

55、誘導(dǎo)劑可以是陽(yáng)離子物質(zhì)，具體地，可以是選自由陽(yáng)離子如ni2+、co2+、zn2+、cu2+、ag2+、fe2+和ba2+所組成的組中的任何一種或多種，并且用于誘導(dǎo)自組裝體形成的適當(dāng)誘導(dǎo)劑的類型可以根據(jù)第一多肽和第二多肽的組合而不同。

56、誘導(dǎo)劑可以是0.1-2.0mm、0.1-1.5mm、0.1-1.0mm、0.1-0.7mm、0.3-2.0mm、0.3-1.5mm、0.3-1.0mm、0.3-0.7mm、0.4-2.0mm、0.4-1.5mm、0.4-1.0mm、0.4-0.7mm、0.4-0.6mm或0.5mm，但不限于此。

57、誘導(dǎo)自組裝體的形成可以包括添加鹽。鹽可以是通常用于蛋白質(zhì)沉淀的鹽，例如硫酸銨或氯化鈉等，并且優(yōu)選地可以是硫酸銨，但不限于此。

58、硫酸銨可為5-30％(w/v)、5-27％(w/v)、5-25％(w/v)、5-23％(w/v)、7-30％(w/v)、7-27％(w/v)、7-25％(w/v)、7-23％(w/v)、10-30％(w/v)、10-27％(w/v)、10-25％(w/v)、10-23％(w/v)、12-30％(w/v)、12-27％(w/v)、12-25％(w/v)、12-23％(w/v)或12-22％(w/v)，但不限于此。

59、誘導(dǎo)自組裝體形成的緩沖溶液可以是例如hepes、tris或磷酸鹽等一般用于提取蛋白質(zhì)的緩沖溶液，并且優(yōu)選地其可以是hepes緩沖溶液，但不限于此。

60、誘導(dǎo)自組裝體的形成可以在ph?6至ph?10下進(jìn)行，并且可以在ph?7至ph?10下進(jìn)行，但不限于此。

61、誘導(dǎo)自組裝體的形成可以在誘導(dǎo)劑處理10分鐘、10分鐘或更長(zhǎng)、15分鐘或更長(zhǎng)、20分鐘或更長(zhǎng)、10分鐘-120分鐘、15分鐘-120分鐘、20分鐘-120分鐘之后立即進(jìn)行，但不限于此。

62、用于純化靶蛋白的方法可以進(jìn)一步包括選擇性分離所形成的自組裝體。

63、分離可以通過離心法或過濾法進(jìn)行。

64、包含融合多肽(包含第一多肽和第二多肽)和靶蛋白的融合蛋白形成大分子自組裝體，以增加尺寸和密度，因此，可以使用離心法或過濾法作為分離方法，離心法可以使用密度差使其沉淀，過濾法可以過濾大于特定尺寸的分子。

65、為了使離心法或過濾法分離后可能殘留的非特異性蛋白質(zhì)的污染最小化，還可以包括使用緩沖溶液洗滌重組蛋白質(zhì)級(jí)分。

66、此外，本發(fā)明是一種將通過特異性誘導(dǎo)劑處理和/或條件處理誘導(dǎo)大分子自組裝體的形成而純化的重組蛋白可逆地轉(zhuǎn)化為單體的方法，還可以包括用可以與特異性陽(yáng)離子誘導(dǎo)劑強(qiáng)烈結(jié)合的螯合劑如edta或egta處理。

67、純化靶蛋白的方法還可以包括切割融合蛋白中包含的tev蛋白酶切割位點(diǎn)或snac標(biāo)簽，并且切割可以通過tev蛋白酶或ni2+處理來(lái)進(jìn)行。

68、此外，本發(fā)明提供了一種用于純化蛋白質(zhì)的組合物，包含具有主要氨基酸由帶電氨基酸和疏水性氨基酸組成的無(wú)定形特征的無(wú)定形肽標(biāo)簽。

69、多肽標(biāo)簽可以是選自由psiaeh標(biāo)簽、psiahek標(biāo)簽、psihekihek標(biāo)簽和psia標(biāo)簽所組成的組中的任何一種，并且可以是能夠成核或形成多聚體如二聚體等的肽。

70、無(wú)定形肽標(biāo)簽可包含選自由seq?id?no:2至seq?id?no:5所組成的組中的一種氨基酸序列，或由其組成。

71、此外，本發(fā)明提供一種包含無(wú)定形肽標(biāo)簽的自組裝體，所述無(wú)定形肽標(biāo)簽具有主要氨基酸由帶電氨基酸和疏水性氨基酸組成的無(wú)定形特征。

72、無(wú)定形多肽標(biāo)簽可以是選自由psiaeh標(biāo)簽、psiahek標(biāo)簽、psihekihek標(biāo)簽和psia標(biāo)簽所組成的組中的任何一種，并且可以是能夠成核或形成多聚體如二聚體等的肽。

73、多肽標(biāo)簽可包含選自由seq?id?no:2至seq?id?no:5所組成的組中的一種氨基酸序列，或由其組成。

74、有益效果

75、本發(fā)明涉及一種無(wú)定形多肽，其中，主要氨基酸由帶電氨基酸和疏水性氨基酸組成；一種融合蛋白，其中，該標(biāo)簽與靶蛋白融合；以及一種使用該融合蛋白純化靶蛋白的方法，并且單獨(dú)的肽或融合蛋白以特定誘導(dǎo)劑或處理?xiàng)l件依賴性方式誘導(dǎo)大分子自組裝體的形成，從而僅通過非常簡(jiǎn)單的方法(例如離心或過濾)就可以分離和純化重組蛋白，而不需要使用常規(guī)親和色譜中主要使用的昂貴珠或樹脂填充的純化柱，以及運(yùn)行其的昂貴裝置或設(shè)備。此外，因?yàn)橥ㄟ^對(duì)蛋白質(zhì)提取溶液的鹽處理和特定誘導(dǎo)劑或條件處理來(lái)誘導(dǎo)大分子自組裝體的形成，本發(fā)明具有非常簡(jiǎn)單和容易的處理過程、純化所需時(shí)間非常短以及能夠高效率和高純度地純化重組蛋白的優(yōu)點(diǎn)。此外，本發(fā)明可以容易地通過螯合劑處理將純化的重組蛋白轉(zhuǎn)化為水溶性單體，并且如果需要，可以通過在切割與靶蛋白融合的標(biāo)簽之后誘導(dǎo)自組裝體的重新形成來(lái)容易地去除這些標(biāo)簽。