本發(fā)明涉及生物催化合成，特別涉及一種重組表達(dá)載體、重組菌株及一步法合成萊鮑迪苷d的方法。

背景技術(shù)：

1、甜菊糖苷是從甜葉菊(stevia?rebaudiana)植物中提取的一類天然甜味劑，由于其高甜度和低熱量的特性，正逐漸成為蔗糖和其他人工甜味劑的替代品。尤其是在注重健康的食品和飲料產(chǎn)品中，萊鮑迪苷各組分因其甜度高、口感接近蔗糖且具有良好的熱穩(wěn)定性和耐酸堿性，被廣泛研究和應(yīng)用于無(wú)糖或低糖產(chǎn)品的配方中。

2、萊鮑迪苷d(rebaudioside?i)是甜菊糖苷家族中的一員，廣泛被作為甜味劑添加到各種食品和飲料中，如無(wú)糖飲料、烘焙食品、糖果、酸奶等，以降低產(chǎn)品中的熱量含量的同時(shí)提供甜味。并且，萊鮑迪苷d適宜被用于生產(chǎn)糖尿病患者適用的食品或保健品，以及注重健康和體重管理人群的產(chǎn)品中。

3、然而現(xiàn)有技術(shù)中萊鮑迪苷d的產(chǎn)量相對(duì)較低，不能滿足市場(chǎng)的需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種重組表達(dá)載體、重組菌株及一步法合成萊鮑迪苷d的方法，用于克服現(xiàn)有技術(shù)中萊鮑迪苷d的產(chǎn)量的問(wèn)題。

2、第一方面，本發(fā)明提供一種重組表達(dá)載體，包括糖基轉(zhuǎn)移酶ugt76g1突變體68s的編碼基因、糖基轉(zhuǎn)移酶ugt91c1突變體2-12e的編碼基因以及蔗糖合酶的編碼基因。

3、上述技術(shù)方案中的糖基轉(zhuǎn)移酶ugt76g1突變體68s的編碼基因序列如seq?id?no.1所示；

4、糖基轉(zhuǎn)移酶ugt91c1突變體2-12e的編碼基因序列如seq?id?no.2所示；

5、蔗糖合酶的編碼基因序列如seq?id?no.3所示。

6、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本技術(shù)的重組表達(dá)載體中同時(shí)含有糖基轉(zhuǎn)移酶ugt76g1突變體68s的編碼基因、糖基轉(zhuǎn)移酶ugt91c1突變體2-12e的編碼基因以及蔗糖合酶的編碼基因。該重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主菌株后，構(gòu)建得到的三酶共表達(dá)重組菌株可實(shí)現(xiàn)單一菌株的發(fā)酵產(chǎn)酶，從而節(jié)省設(shè)備與物料的利用，提升生產(chǎn)效率，節(jié)約生產(chǎn)成本。

7、第二方面，本發(fā)明提供一種重組菌株，該重組菌株中含有上述重組表達(dá)載體。

8、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本技術(shù)中的重組菌株中同時(shí)含有糖基轉(zhuǎn)移酶ugt76g1突變體68s、糖基轉(zhuǎn)移酶ugt91c1突變體2-12e和蔗糖合酶這三個(gè)酶的編碼基因，因此該重組菌株表達(dá)的酶產(chǎn)物可以用于一步法合成萊鮑迪苷d，直接將甜菊苷stv轉(zhuǎn)化為萊鮑迪苷d，提高了底物甜菊苷stv的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物萊鮑迪苷d的產(chǎn)率。

9、第三方面，本發(fā)明提供一種重組菌株的構(gòu)建方法，用于上述重組菌株的構(gòu)建，包括如下步驟：

10、步驟s1、將糖基轉(zhuǎn)移酶ugt76g1突變體68s的編碼基因、糖基轉(zhuǎn)移酶ugt91c1突變體2-12e的編碼基因以及蔗糖合酶的編碼基因連接到表達(dá)載體上，得到重組質(zhì)粒；

11、步驟s2、將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主菌株中，得到三酶共表達(dá)重組菌株。

12、與現(xiàn)有技術(shù)相比，上述技術(shù)方案中通過(guò)重組質(zhì)粒將糖基轉(zhuǎn)移酶ugt76g1突變體68s的編碼基因、糖基轉(zhuǎn)移酶ugt91c1突變體2-12e的編碼基因以及蔗糖合酶的編碼基因轉(zhuǎn)入宿主菌株中，可以得到三酶共表達(dá)重組菌株，應(yīng)用該三酶共表達(dá)重組菌株產(chǎn)酶不但可以節(jié)省物料和設(shè)備，簡(jiǎn)化生產(chǎn)操作，還實(shí)現(xiàn)了只需一步加酶即可催化甜菊苷stv轉(zhuǎn)化為萊鮑迪苷d，提高了該催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率。

13、進(jìn)一步地，表達(dá)載體為pyb1s；

14、宿主菌株包括但不限于大腸桿菌、釀酒酵母、畢赤酵母或谷氨酸棒桿菌。第四方面，本發(fā)明提供一種一步法合成萊鮑迪苷d的方法，包括以下步驟：

15、(1)將重組菌株接種到含有甜菊苷stv和l-阿拉伯糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇培養(yǎng)，其中，所述重組菌株為上述重組菌株；

16、(2)挑選步驟(1)中顏色均勻單一、菌落凸起、表面圓潤(rùn)光滑、菌落直徑為2～3mm的菌落，接種到lb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為35～40℃，在200～300rpm下振蕩培養(yǎng)5～8h獲得種子液；

17、(3)將所述種子液以0.5～1.2v/v％的接種量接種到新的lb培養(yǎng)基中，在溫度為35～40℃，200～300rpm下進(jìn)行振蕩培養(yǎng)；

18、(4)待振蕩培養(yǎng)的培養(yǎng)液od600為0.6～0.8時(shí)加入誘導(dǎo)劑，進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)；

19、(5)誘導(dǎo)培養(yǎng)完成后收集菌體，重懸，破碎細(xì)胞，離心，上清液即為粗酶液；

20、(6)在催化反應(yīng)體系中加入甜菊苷stv、蔗糖、udpg、粗酶液以及磷酸鈉緩沖溶液，反應(yīng)，沸水浴滅活酶并使反應(yīng)析出物溶解，離心得上清即為產(chǎn)物萊鮑迪苷d。

21、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明技術(shù)方案中將含有重組表達(dá)載體的重組菌株接種到含有甜菊苷stv和l-阿拉伯糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇培養(yǎng)和篩選，可以獲得生長(zhǎng)健壯、性能優(yōu)良、更適用于甜菊苷stv的工業(yè)化轉(zhuǎn)化的重組菌株，篩選得到的三酶共表達(dá)重組菌株表達(dá)的酶產(chǎn)物用于一步法合成萊鮑迪苷d時(shí)，可以提高反應(yīng)體系中底物甜菊苷stv的轉(zhuǎn)化效率，使之可達(dá)到90％以上。同時(shí)，本發(fā)明通過(guò)選育得到的重組菌株經(jīng)過(guò)50代傳代實(shí)驗(yàn)，證明了其遺傳穩(wěn)定性良好，能夠應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中。

22、并且，本發(fā)明催化反應(yīng)體系中的粗酶液可直接將底物甜菊苷stv轉(zhuǎn)化為萊鮑迪苷d，即實(shí)現(xiàn)了一步法合成萊鮑迪苷d，不但提高了萊鮑迪苷d的產(chǎn)量，還簡(jiǎn)化了生產(chǎn)操作過(guò)程，使之適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

23、進(jìn)一步地，步驟(1)培養(yǎng)基中甜菊苷stv的濃度為40mg/l～100mg/l，l-阿拉伯糖的濃度為1g/l～5g/l；

24、步驟(1)中選擇培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)溫度為30～40℃，培養(yǎng)12～18h。

25、與現(xiàn)有技術(shù)相比，上述技術(shù)方案中限定了選擇培養(yǎng)的培養(yǎng)基中甜菊苷stv和l-阿拉伯糖的濃度范圍，少量的甜菊苷stv和l-阿拉伯糖可以刺激重組菌株少量表達(dá)可以催化甜菊苷stv進(jìn)行反應(yīng)的酶，酶活越高的重組菌株越具有生存優(yōu)勢(shì)，因此在該培養(yǎng)基中可以篩選到能夠表達(dá)使底物甜菊苷stv具有更高轉(zhuǎn)化率的酶產(chǎn)物的優(yōu)良菌株，并且該優(yōu)良菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性，適宜在大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)用。

26、進(jìn)一步地，步驟(2)中的lb培養(yǎng)基包括：10g/l的nacl、5g/l的酵母粉、10g/l的蛋白胨以及40～70mg/l的硫酸鏈霉素。

27、與現(xiàn)有技術(shù)相比，上述技術(shù)方案在lb培養(yǎng)基中含有適宜濃度的硫酸鏈霉素，硫酸鏈霉素通過(guò)抑制非目標(biāo)微生物的生長(zhǎng)，幫助目的重組菌株快速成為培養(yǎng)液中的主導(dǎo)微生物，從而加速種子液的制備過(guò)程，并提高種子液的質(zhì)量和穩(wěn)定性。

28、進(jìn)一步地，步驟(4)中所述誘導(dǎo)劑為阿拉伯糖，所述誘導(dǎo)劑在lb培養(yǎng)基中的終濃度為2～5g/l，誘導(dǎo)培養(yǎng)的溫度為20～30℃，200～300rpm下振蕩培養(yǎng)16～24h。

29、與現(xiàn)有技術(shù)相比，終濃度為2～5g/l的阿拉伯糖可以誘導(dǎo)三酶共表達(dá)重組菌株對(duì)目標(biāo)酶產(chǎn)物進(jìn)行表達(dá)，在此終濃度范圍內(nèi)，可以進(jìn)一步提高目標(biāo)酶產(chǎn)物的表達(dá)量。

30、進(jìn)一步地，催化反應(yīng)體系中含有甜菊苷stv?25～50mm，蔗糖300～800mm，udpg?1～2mm，粗酶液以及磷酸鈉緩沖溶液50-100mm；制備粗酶液時(shí)所用重組菌株培養(yǎng)液的od600值為2～4。

31、應(yīng)理解，上述技術(shù)方案中反應(yīng)底物甜菊苷stv、蔗糖和udpg的濃度均為催化反應(yīng)體系中的終濃度。粗酶液的添加量要根據(jù)總反應(yīng)體系的體積以及反映體系中各底物的濃度來(lái)確定不同的添加量。

32、進(jìn)一步地，催化反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)溫度為35～40℃，ph為6～8，反應(yīng)時(shí)間為6～48h。