本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種mmlv逆轉(zhuǎn)錄酶突變體及其應(yīng)用，旨在推動(dòng)rna研究和相關(guān)技術(shù)的進(jìn)步。

背景技術(shù)：

1、逆轉(zhuǎn)錄酶（rts）是一類(lèi)能夠利用rna作為模板合成dna的酶，廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中。rts的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展使得rna相關(guān)研究得以快速推進(jìn)，成為合成cdna、進(jìn)行基因表達(dá)分析以及實(shí)現(xiàn)基因克隆的關(guān)鍵工具。逆轉(zhuǎn)錄酶被廣泛應(yīng)用于各種診斷技術(shù)，包括cdna克隆、逆轉(zhuǎn)錄酶-pcr定量、微陣列分析和快速擴(kuò)增cdna末端（race）等，這些技術(shù)在基因功能研究、疾病診斷及新藥開(kāi)發(fā)中發(fā)揮了重要作用。

2、在眾多逆轉(zhuǎn)錄酶中，mmlv（鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶）作為一種單亞基酶，具有較強(qiáng)的活性和穩(wěn)定性，因此在過(guò)去幾十年中受到廣泛關(guān)注。與其他逆轉(zhuǎn)錄病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶相比，mmlv的優(yōu)勢(shì)在于其結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，易于生產(chǎn)和純化。此外，mmlv的反應(yīng)條件較為溫和，適合在多種實(shí)驗(yàn)環(huán)境中使用。盡管mmlv具有良好的性能，但其在高溫下的穩(wěn)定性仍然是一個(gè)限制因素。

3、突變策略是提高mmlv逆轉(zhuǎn)錄酶性能的有效方法。研究人員通過(guò)突變模板相互作用區(qū)域，或與其他dna結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域的融合，來(lái)改善酶與模板的結(jié)合穩(wěn)定性。通過(guò)這種方式篩選出的熱穩(wěn)定mmlv突變體，能夠在高溫條件下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，從而實(shí)現(xiàn)更高的擴(kuò)增效率。這一進(jìn)展不僅能夠提高rna模板在逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的穩(wěn)定性，還能有效地減少反應(yīng)過(guò)程中可能出現(xiàn)的非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象。

4、在實(shí)際應(yīng)用中，熱穩(wěn)定的mmlv逆轉(zhuǎn)錄酶突變體可廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)分析、rna序列測(cè)定以及rna病毒的檢測(cè)等領(lǐng)域。特別是在疾病早期診斷和病原體檢測(cè)中，快速、準(zhǔn)確的cdna合成步驟對(duì)于后續(xù)的pcr擴(kuò)增和分析至關(guān)重要。借助于這些突變體，研究人員可以在更廣泛的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，確保反應(yīng)的高效性和可靠性。因此，耐更高溫度的mmlv逆轉(zhuǎn)錄酶的突變體具有廣大的市場(chǎng)需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明旨在至少解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問(wèn)題之一。為此，本發(fā)明提出一種mmlv逆轉(zhuǎn)錄酶突變體。

2、本發(fā)明還提出編碼上述mmlv逆轉(zhuǎn)錄酶突變體的核酸分子。

3、本發(fā)明還提出與上述的核酸分子相關(guān)的生物材料。

4、本發(fā)明還提出上述mmlv逆轉(zhuǎn)錄酶突變體、核酸分子和生物材料的應(yīng)用。

5、本發(fā)明還提出一種產(chǎn)品。

6、本發(fā)明還提出上述mmlv逆轉(zhuǎn)錄酶突變體的制備方法。

7、根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提出了一種mmlv逆轉(zhuǎn)錄酶突變體，其在如seq?id?no:1所示的野生型mmlv逆轉(zhuǎn)錄酶的氨基酸序列的基礎(chǔ)上進(jìn)行氨基酸位點(diǎn)的修飾，修飾的所述氨基酸位點(diǎn)包括d200、t246、g358、w388、l435、v444、d524和d583中的至少一位。

8、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，修飾的所述氨基酸位點(diǎn)包括d200、t246、g358、w388、l435、v444、d524和d583中的至少兩位、至少三位、至少四位、至少五位、至少六位、至少七位或至少八位。

9、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述氨基酸位點(diǎn)的修飾包括氨基酸突變。

10、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，d200的氨基酸突變的方式為d200n或d200y；和/或，t246的氨基酸突變的方式為t246h；和/或，g358的氨基酸突變的方式為g358a；和/或，w388的氨基酸突變的方式為w388t或w388f；和/或，l435的氨基酸突變的方式為l435g或l435k；和/或，v444的氨基酸突變的方式為v444l或v444i；和/或，d524的氨基酸突變的方式為d524a；和/或，d583的氨基酸突變的方式為d583n。

11、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述mmlv逆轉(zhuǎn)錄酶突變體中，突變的所述氨基酸位點(diǎn)為d200、t246、w388、l435、v444、d524、d583。具體為d200y、t246h、w388t、l435k、v444i、d524a、d583n。

12、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述mmlv逆轉(zhuǎn)錄酶突變體中，突變的所述氨基酸位點(diǎn)為d200、g358、w388、l435、v444。具體為d200n、g358a、w388t、l435k、v444i。

13、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述mmlv逆轉(zhuǎn)錄酶突變體中，突變的所述氨基酸位點(diǎn)為d200、t246、g358、w388、l435、v444、d524、d583。具體為d200n、t246h、g358a、w388t、l435g、v444l、d524a、d583n。

14、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述mmlv逆轉(zhuǎn)錄酶突變體中，突變的所述氨基酸位點(diǎn)為d200、t246、w388、l435、v444、d524。具體為d200y、t246h、w388f、l435k、v444i、d524a。

15、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述mmlv逆轉(zhuǎn)錄酶突變體中，突變的所述氨基酸位點(diǎn)為d200、t246、g358、w388、v444。具體為d200y、t246h、g358a、w388f、v444l。

16、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述mmlv逆轉(zhuǎn)錄酶突變體中，突變的所述氨基酸位點(diǎn)為d200、t246、g358、w388、l435、v444、d524。具體為d200n、t246h、g358a、w388f、l435g、v444l、d524a。

17、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述mmlv逆轉(zhuǎn)錄酶突變體的熱穩(wěn)定性和/或比酶活高于所述野生型mmlv逆轉(zhuǎn)錄酶。

18、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述熱穩(wěn)定性指溫度不低于55°c時(shí)的活性。例如：可以為56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64或65℃。

19、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述熱穩(wěn)定性指溫度不低于65°c時(shí)的活性。

20、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述mmlv逆轉(zhuǎn)錄酶突變體在≤65°c條件下可以實(shí)現(xiàn)比野生型mmlv逆轉(zhuǎn)錄酶更好的逆轉(zhuǎn)錄效果。

21、根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提出了一種核酸分子，所述核酸分子編碼上述mmlv逆轉(zhuǎn)錄酶突變體。

22、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述核酸分子的核苷酸序列為：

23、（1）如seq?id?no:3-8任一所示的核苷酸序列；或，

24、（2）與（1）所述的核苷酸序列編碼相同的所述mmlv逆轉(zhuǎn)錄酶突變體的同義密碼子序列。

25、根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提出了與所述的核酸分子相關(guān)的生物材料，所述生物材料包含a1)～a7)中至少一種：

26、a1)包含上述核酸分子的表達(dá)盒；

27、a2)包含上述核酸分子的載體；

28、a3)包含a1)所述的表達(dá)盒的載體；

29、a4)包含上述核酸分子的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系；

30、a5)包含a1)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系；

31、a6)包含a2)所述載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系；

32、a7)包含a3)所述載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。

33、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，用于構(gòu)建本發(fā)明的載體的母載體不受限制，可使用用于原核生物或真核生物轉(zhuǎn)化的任何傳統(tǒng)載體。例如：可以為pet-32a載體。

34、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系包括原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。

35、根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提出了一種酶制劑，包括上述mmlv逆轉(zhuǎn)錄酶突變體。

36、根據(jù)本發(fā)明的第五方面，提出了上述mmlv逆轉(zhuǎn)錄酶突變體、核酸分子、生物材料和酶制劑的應(yīng)用。

37、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述應(yīng)用為上述mmlv逆轉(zhuǎn)錄酶突變體或酶制劑在檢測(cè)rna樣本或逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)領(lǐng)域中的應(yīng)用。

38、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述應(yīng)用為上述mmlv逆轉(zhuǎn)錄酶突變體、核酸分子、生物材料或酶制劑在制備產(chǎn)品中的應(yīng)用。

39、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述產(chǎn)品包含試劑、檢測(cè)板、試劑盒、檢測(cè)芯片中的至少一種。

40、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述試劑、檢測(cè)板、檢測(cè)芯片或試劑盒具有b1)～b3)中至少一種功能：

41、b1)檢測(cè)rna樣本；

42、b2)逆轉(zhuǎn)錄rna合成cdna；

43、b3)制備rt-pcr檢測(cè)試劑或rt-qpcr檢測(cè)試劑。

44、根據(jù)本發(fā)明的第六方面，提出了一種產(chǎn)品，所述產(chǎn)品包含上述的mmlv逆轉(zhuǎn)錄酶突變體。

45、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述產(chǎn)品包含試劑、檢測(cè)板、試劑盒、檢測(cè)芯片中的至少一種。

46、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述試劑、檢測(cè)板、檢測(cè)芯片或試劑盒具有b1)～b3)中至少一種功能：

47、b1)檢測(cè)rna樣本；

48、b2)逆轉(zhuǎn)錄rna合成cdna；

49、b3)制備rt-pcr檢測(cè)試劑或rt-qpcr檢測(cè)試劑。

50、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述試劑盒選自逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒、rt-pcr擴(kuò)增試劑盒、rt-qpcr試劑盒、cdna文庫(kù)構(gòu)建試劑盒、cdna末端快速擴(kuò)增試劑盒和rna測(cè)序試劑盒中的一種。

51、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒還包括：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液、dntps、rna酶抑制劑和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)引物中的至少一種。

52、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述rt-pcr擴(kuò)增試劑盒還包括：pcr水、rt-pcr擴(kuò)增緩沖液、dntps、dna聚合酶和pcr擴(kuò)增引物中的至少一種。

53、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述rt-qpcr試劑盒還包括：pcr水、rt-qpcr擴(kuò)增緩沖液、dntps、dna聚合酶、qpcr擴(kuò)增引物和探針中的至少一種。

54、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述cdna文庫(kù)構(gòu)建試劑盒還包括：接頭。

55、根據(jù)本發(fā)明的第六方面，提出了上述mmlv逆轉(zhuǎn)錄酶突變體的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：通過(guò)上述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系表達(dá)得到。

56、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述方法具體包括以下步驟：

57、（1）將包含上述核酸分子的載體的重組載體轉(zhuǎn)至感受態(tài)細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng)，挑取單克隆細(xì)胞進(jìn)行篩選；

58、（2）提取篩選的陽(yáng)性克隆的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，接種于lb培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得到種子液；

59、（3）取所得種子液接種于lb培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得到菌液；

60、（4）向所得菌液中加入誘導(dǎo)劑iptg至終濃度為0.8-1?mmol/l，誘導(dǎo)表達(dá)后，離心收集菌體；

61、（5）向所得菌體中加入裂解緩沖液進(jìn)行重懸，高壓破碎菌體，離心取上清液；并采用0.22-0.5μm微孔濾膜過(guò)濾；

62、（6）將過(guò)濾得到的液相進(jìn)行鎳離子親和層析，利用聚丙烯酰胺電泳檢測(cè)洗脫溶液，收集含有目的蛋白樣品；

63、（7）將步驟（6）中的含有目的蛋白樣品進(jìn)行陽(yáng)離子交換層析，聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)洗脫溶液，收集含有目的蛋白樣品透析至保存液中，即獲得所述的mmlv逆轉(zhuǎn)錄酶突變體。

64、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，步驟（2）和步驟（3）中所述的lb培養(yǎng)基均含80-120μg/ml氨芐西林。

65、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，步驟（2）中所述的培養(yǎng)的條件為20-30℃，150-200rpm振蕩培養(yǎng)。

66、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，步驟（3）中所述的培養(yǎng)的條件為：20-30℃，150-200rpm振蕩培養(yǎng)至od600為0.6-0.8。

67、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，步驟（3）中所述的種子液按1：（80-120）的體積比接種于lb培養(yǎng)基。

68、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，步驟（4）中所述的誘導(dǎo)條件為20-30℃，誘導(dǎo)4-6h。

69、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，步驟（4）所述的離心條件為：2-6℃以4000-5000rpm的轉(zhuǎn)速離心15-25min。

70、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，步驟（5）中所述的裂解緩沖液用量按每克菌體中加入8-10ml；

71、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，步驟（5）中所述的離心條件為2-6℃以10000-14000rpm的轉(zhuǎn)速離心25-35min；

72、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，步驟（5）中所述的裂解緩沖液的組分含有：45-55mmtris-hcl、280-320mm?nacl、0.1%-0.2%?triton?x-100。

73、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，步驟（6）中所述的鎳離子親和層析所用的結(jié)合緩沖液的組分含有：45-55mm?tris-hcl、280-320mm?nacl、15-25mm?imidazole、2%-6%glycerol。

74、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，鎳離子親和層析所用洗脫緩沖液的組分含有：45-55mm?tris-hcl、280-320mm?nacl、200-300mm?imidazole、2%-6%?glycerol。

75、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述陽(yáng)離子交換層析所用結(jié)合緩沖液的組分含有：15-25mm?tris-hcl、190-220mm?nacl、2%-6%（v/v）glycerol、0.5-2mm?dtt、0.5-2mm?edta。

76、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，陽(yáng)離子交換層析所用梯度洗脫緩沖液的組分含有：15-25mm?tris-hcl、550-650mm?nacl、2%-6%（v/v）glycerol、0.5-2mmdtt、0.5-2mm?edta。

77、在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述保存液的組分含有：15-25mm?tris-hcl、550-650mm?nacl、0.5-2mm?dtt、40-60%?glycerol、0.5-2mm?edta。

78、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，至少具有以下有益效果：本發(fā)明制備得到的mmlv逆轉(zhuǎn)錄酶突變體，是通過(guò)使用預(yù)測(cè)3d結(jié)構(gòu)和與模板相互作用的軟件進(jìn)行合理設(shè)計(jì)，獲得眾多突變位點(diǎn)，將突變位點(diǎn)組合，篩選得到的mmlv逆轉(zhuǎn)錄酶突變體，相對(duì)于野生型，兼具產(chǎn)量高、熱穩(wěn)定高的優(yōu)勢(shì)，可實(shí)現(xiàn)用于在復(fù)雜rna模板的逆轉(zhuǎn)錄。