本發(fā)明涉及基因工程，尤其是一種黃嘌呤核苷生產(chǎn)菌株及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、黃嘌呤核苷又名9-呋喃核糖-3,9-二氫-1h-嘌呤-2,6-二酮，是由黃嘌呤和糖基組成的核苷，可通過水解反應(yīng)生成黃嘌呤和核苷酸。黃嘌呤核苷作為非平衡細胞動力學(xué)分裂方式的抑制劑，既能實現(xiàn)骨髓間質(zhì)干細胞的分裂方式由非平衡態(tài)向平衡態(tài)轉(zhuǎn)變，又不影響其肝向分化的特性，有助于提高骨髓間質(zhì)干細胞的體外增殖效率，有著廣泛的應(yīng)用空間。黃嘌呤核苷是咖啡堿合成途徑中第一步反應(yīng)的底物，所以在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，向發(fā)酵中添加一定濃度的黃嘌呤核苷，并采用加壓方式對所述重組菌細胞進行通透化處理，促重組菌對底物黃嘌呤核苷的吸收，從而可提高咖啡堿的發(fā)酵產(chǎn)量。

2、目前合成黃嘌呤核苷的方法有天然提取法和化學(xué)合成法。天然提取法主要是從生物體中提取純化黃嘌呤核苷，其優(yōu)點是來源廣泛，但同時也存在產(chǎn)率低且花費高等問題；化學(xué)合成法是人工合成黃嘌呤核苷，包括合成黃嘌呤和糖基的化合物，然后將它們連接在一起，其優(yōu)點是原料易得，但制備流程復(fù)雜，對設(shè)備的要求高，產(chǎn)率較低。

3、微生物發(fā)酵法現(xiàn)已經(jīng)被作為大多數(shù)天然小分子產(chǎn)物大規(guī)模生產(chǎn)的主流方式，雖然細胞內(nèi)嘌呤核苷的生物合成路線早已探明，但由于其合成路線較長且合成途徑反饋抑制較為強烈、并受到細胞內(nèi)多方面嚴格調(diào)控，因此目前未有人用發(fā)酵法生產(chǎn)黃嘌呤核苷。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種黃嘌呤核苷生產(chǎn)菌株。

2、本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題在于提供上述黃嘌呤核苷生產(chǎn)菌株的構(gòu)建方法。

3、本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題在于提供上述黃嘌呤核苷生產(chǎn)菌株的應(yīng)用。

4、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是：

5、一種黃嘌呤核苷生產(chǎn)菌株，為菌株xl8，是以野生型大腸桿菌(e.coli)w3110作為出發(fā)菌株通過基因改造方法獲得的：首先通過在野生型大腸桿菌(e.coli)w3110的基因組yghx位點引入解淀粉芽孢桿菌中的嘌呤操縱子基因pur(ekbcsqlfmnhd)，由ptrc啟動子啟動；然后在基因組上敲除嘌呤核苷酸阻遏蛋白基因purr，并在基因組rph和ilvg位點分別引入prpp轉(zhuǎn)酰胺酶的抗反饋變體purfbazk326q和prpp合成酶的抗反饋變體prsecod128a，均由ptrc啟動子啟動；之后在基因組上敲除核苷磷酸化酶基因ppnp和核苷磷酸化酶基因deod，減弱黃嘌呤核苷的降解，并在基因組上mbha位點上整合次天冬氨酸解氨酶基因aspa加強菌株前體物天冬氨酸的供應(yīng)，后敲除鳥苷單磷酸(gmp)合成酶基因guaa以阻斷菌株到鳥苷單磷酸(gmp)的支路代謝，使其更多地流向黃嘌呤核苷的合成途經(jīng)，最終獲得xl8。

6、優(yōu)選的，上述黃嘌呤核苷生產(chǎn)菌株，所整合的異源的嘌呤操縱子基因pur(ekbcsqlfmnhd)來自于解淀粉芽孢桿菌中，所述嘌呤操縱子基因pur(ekbcsqlfmnhd)的ncbi-geneid為：pure：75094376；purk：75094377；purb：75094378；purc：75094379；purs：75094380；purq：75094381；purl：75094382；purf：75094383；purm：75094384；purn：75094385；purh：75094386；purd：75094387。

7、優(yōu)選的，上述黃嘌呤核苷生產(chǎn)菌株，所述嘌呤核苷酸阻遏蛋白基因purr的ncbi-geneid：945226；所述抗反饋變體purfbazk326q的ncbi-geneid：75094383；所述抗反饋變體prsecod128a的ncbi-geneid：545772；所述核苷磷酸化酶基因ppnp的ncbi-geneid：945048；所述核苷磷酸化酶基因deod的ncbi-geneid：945654；所述次天冬氨酸解氨酶基因aspa的ncbi-gene?id：948658；所述鳥苷單磷酸(gmp)合成酶基因guaa的ncbi-gene?id:947334。

8、優(yōu)選的，上述黃嘌呤核苷生產(chǎn)菌株，所述ptrc啟動子的核苷酸序列如seq?id?no.95所示。

9、上述黃嘌呤核苷生產(chǎn)菌株的構(gòu)建方法，采用crispr/cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)對野生型大腸桿菌(e.coli)w3110逐步改造，具體步驟如下：

10、(1)在e.col?i?w3110的基因組yghx位點引入異源的嘌呤操縱子基因pur(ekbcsqlfmnhd)由ptrc啟動子啟動，增強嘌呤代謝途徑的碳代謝流；

11、(2)敲除嘌呤核苷酸阻遏蛋白基因purr，在基因組ilvg和rph位點分別引入解淀粉芽孢桿菌的prpp轉(zhuǎn)酰胺酶的抗反饋變體purfbazk326q和大腸桿菌來源的prpp合成酶的抗反饋變體prsecod128a，均由ptrc啟動子啟動，解除終產(chǎn)物及關(guān)鍵中間產(chǎn)物的反饋抑制作用；

12、(3)在基因組上敲除ppnp基因和deod基因，減弱黃嘌呤核苷的降解；

13、(4)過表達天冬氨酸解氨酶基因aspa，進一步強化黃嘌呤核苷的生物合成途徑；

14、(5)通過敲除guaa基因以阻斷菌株到鳥苷單磷酸(gmp)的支路代謝，使其更多地流向黃嘌呤核苷的合成途經(jīng)。

15、上述黃嘌呤核苷生產(chǎn)菌株在生產(chǎn)黃嘌呤核苷方面的應(yīng)用。

16、優(yōu)選的，上述黃嘌呤核苷生產(chǎn)菌株的應(yīng)用，采用發(fā)酵方法生產(chǎn)黃嘌呤核苷。

17、優(yōu)選的，上述黃嘌呤核苷生產(chǎn)菌株的應(yīng)用，將黃嘌呤核苷生產(chǎn)菌株與發(fā)酵培養(yǎng)基接觸，進行發(fā)酵培養(yǎng)，制備得到黃嘌呤核苷。

18、優(yōu)選的，上述黃嘌呤核苷生產(chǎn)菌株的應(yīng)用，所述發(fā)酵培養(yǎng)包括搖瓶發(fā)酵或者發(fā)酵罐發(fā)酵。

19、優(yōu)選的，上述黃嘌呤核苷生產(chǎn)菌株的應(yīng)用，所述搖瓶發(fā)酵時接種量10％-15％，溫度維持在37℃±0.2，220r/min振蕩培養(yǎng)，發(fā)酵過程中通過補加25％的氨水來維持ph在7.0；添加60％葡萄糖溶液補充菌體所需的碳源。

20、優(yōu)選的，上述黃嘌呤核苷生產(chǎn)菌株的應(yīng)用，所述發(fā)酵罐發(fā)酵的具體步驟如下：

21、(1)菌種活化：將菌種從甘油管接至斜面培養(yǎng)基活化培養(yǎng)11-13h；將菌種從斜面培養(yǎng)基中接至茄形瓶培養(yǎng)基中繼續(xù)活化擴大培養(yǎng)10-12h，培養(yǎng)溫度：37℃；

22、(2)種子培養(yǎng)：培養(yǎng)過程ph維持在7.0±0.1，溫度維持在37±0.2℃，溶氧維持在25％-35％，培養(yǎng)至od為10時轉(zhuǎn)接發(fā)酵罐中進行發(fā)酵培養(yǎng)；

23、(3)發(fā)酵培養(yǎng)：按20％的接種量將種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵ph維持在7.0±0.1，溫度維持在37±0.2℃，溶氧維持在25％-30％；培養(yǎng)過程中通過流加80％葡萄糖溶液維持發(fā)酵過程菌體所需的碳源，期間通過添加25％的氨水來調(diào)節(jié)ph維持在7.0±0.1。

24、優(yōu)選的，上述黃嘌呤核苷生產(chǎn)菌株的應(yīng)用，采用的斜面培養(yǎng)基和茄形瓶培養(yǎng)基為：牛肉膏10g/l，葡萄糖5g/l，氯化鈉5g/l，蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，黃嘌呤100mg/l，瓊脂粉25g/l，ph調(diào)至7.0-7.2，121℃,20min滅菌。

25、優(yōu)選的，上述黃嘌呤核苷生產(chǎn)菌株的應(yīng)用，采用的種子培養(yǎng)基為：葡萄糖30g/l，酵母浸粉5g/l，蛋白胨1g/l，檸檬酸1.25g/l，mgso4·7h2o1.5g/l，kh2po4?3.0g/l，維生素b1(vb1)1mg/l，生物素(vh)1mg/l，鳥嘌呤200mg/l，其余為水。

26、優(yōu)選的，上述黃嘌呤核苷生產(chǎn)菌株的應(yīng)用，采用的發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖20g/l，酵母浸粉3g/l，蛋白胨1g/l，檸檬酸2g/l，mgso4·7h2o?2g/l，kh2po4?6g/l，feso4·7h2o?20mg/l，mnso410mg/l，維生素b1(vb1)2mg/l，生物素(vh)2mg/l，鳥嘌呤200mg/l，其余為水。

27、上述培養(yǎng)基均可采用標準方法制備獲得。

28、有益效果：

29、上述黃嘌呤核苷生產(chǎn)菌株，通過對野生型大腸桿菌(e.coli)和解淀粉芽孢桿菌(bac?i?l?l?us?amy?l?o?l?iquefac?iens)的嘌呤代謝相關(guān)途徑進行分析，并在底盤微生物野生型大腸桿菌(e.coli)w3110中引入解淀粉芽孢桿菌嘌呤操縱子，敲除黃嘌呤核苷代謝回補途徑及關(guān)鍵分支途徑，解除關(guān)鍵反饋抑制，敲除黃嘌呤核苷分解途徑等相關(guān)分子改造，至此成功構(gòu)建出一株不含質(zhì)粒、從頭合成黃嘌呤核苷的基因工程菌xl8，具有遺傳背景清晰、可持續(xù)改造等優(yōu)點，該菌株發(fā)酵生產(chǎn)黃嘌呤核苷操作簡單、能以廉價碳源直接合成黃嘌呤核苷，具有很好的工業(yè)應(yīng)用前景。