本發(fā)明涉及抗體，尤其涉及一種抗程序性死亡分子1的單域抗體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、在免疫系統(tǒng)中，主要使用t細胞介導(dǎo)的細胞免疫消滅腫瘤，而t細胞需要活化才能發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，t細胞的活化幅度和質(zhì)量取決于活化信號和抑制信號之間的平衡。免疫檢查點可以認為是免疫細胞的剎車系統(tǒng)，指的是在免疫細胞上表達、能調(diào)節(jié)免疫激活程度的一系列分子，使t細胞的活化水平保持在正常范圍，防止對機體健康組織的損傷。

2、程序化死亡分子1(programmed?death?1，pd-1)，又稱為cd279，廣泛表達于免疫細胞表面，是一種重要的免疫抑制分子。pd-1隸屬免疫球蛋白超家族cd28/b7，是由288個氨基酸組成的ⅰ型跨膜糖蛋白，為免疫抑制性受體。其有至少pd-l1和pd-l2兩種配體。在正常情況下，t細胞表面的pd-1能夠抑制t淋巴細胞的功能，從而抑制自身免疫應(yīng)答，防止自身免疫性疾病的發(fā)生。但在腫瘤中，腫瘤細胞表達的pd-l1與t細胞表面的pd-1結(jié)合后，能通過對t淋巴細胞的抑制作用，導(dǎo)致t細胞增殖下調(diào)，甚至誘導(dǎo)t細胞凋亡，促進腫瘤的免疫逃逸。阻斷pd-1/pd-l1負調(diào)控通路，可激活免疫系統(tǒng)功能，殺傷腫瘤細胞。目前市面上已有多種靶向pd-1單克隆抗體，包括納武利尤單抗(nivolumab)、帕博利珠單抗(pembrolizumab)、西米普利單抗(cemiplimab)、特瑞普利單抗(toripalimab)、信迪利單抗(cindilimab)等。這些pd-1單抗在臨床中已經(jīng)取得成功應(yīng)用。

3、cn111808196a公開了一種抗pd-1抗體或其抗原結(jié)合片段，以及制備方法和用途。該抗pd-1抗體或其抗原結(jié)合片段可以有效阻斷pd-1與配體的結(jié)合，且與人pd-1結(jié)合的特異性強，親和力高，體內(nèi)實驗也表明被非人動物良好耐受，并且無毒，顯著抑制腫瘤的增長。

4、普通抗體的研究載體以小鼠、兔子為主，在駱駝科和軟骨魚綱動物血液中存在一種缺失輕鏈的特殊抗體，即重鏈抗體。與普通抗體相比，它只包含一個重鏈可變區(qū)(vhh)和兩個常規(guī)的ch2與ch3區(qū)。克隆其可變區(qū)，可以得到只由重鏈可變區(qū)組成的單域抗體(又稱納米抗體)，具有分子量小、組織穿透力強、穩(wěn)定性高、免疫原性低等優(yōu)點。與普通抗體相比，羊駝抗體擁有諸多優(yōu)勢：一是體積小，是普通抗體的十分之一，這使得它能夠滲透到組織和細胞內(nèi)部，特別是能夠穿透血腦屏障。二是穩(wěn)定性強，納米抗體在極端的溫度和ph值條件下都能保持穩(wěn)定性，在高達90℃的高溫下仍能保持生物活性。三是結(jié)構(gòu)簡單，納米抗體更容易進行改造，如人源化、多價性構(gòu)建等，且生產(chǎn)成本低，適合大規(guī)模生產(chǎn)。四是高特異性，羊駝的免疫系統(tǒng)能夠產(chǎn)生對特定抗原有高度特異性和親和力的抗體，且對人的免疫原性弱，引起免疫反應(yīng)的風險較低。

5、綜上所述，如何利用pd-1抗體阻斷pd-1/pd-l1途徑以恢復(fù)t細胞腫瘤活性，激活t細胞，殺傷腫瘤細胞，應(yīng)用相關(guān)技術(shù)制備抗pd-1的羊駝抗體，做成抗體藥物或細胞藥物，已成為目前本領(lǐng)域亟待解決的問題之一。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種抗程序性死亡分子1的單域抗體及其應(yīng)用，使用pd-1蛋白免疫羊駝，獲得了一種特異性強、與pd-1親和力高的單域抗體，同時可以阻斷pd-1和pd-l1的結(jié)合，增強免疫細胞的功能。

2、為達此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供了一種抗程序性死亡分子1的單域抗體，所述單域抗體的cdr1的氨基酸序列包括seq?id?no.1所示的序列，所述單域抗體的cdr2的氨基酸序列包括seq?id?no.2所示的序列，所述單域抗體的cdr3的氨基酸序列包括seq?id?no.3所示的序列。

4、seq?id?no.1：asgsifsihdmg。

5、seq?id?no.2：aritsglstnyad。

6、seq?id?no.3：nreirgssgiwypldy。

7、優(yōu)選地，所述單域抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列包括seq?id?no.4所示的序列。

8、seq?id?no.4：maqvkleesggglvqpggslrlscaasgsifsihdmgwyrqapgkqr?elvaritsglstnyadsvkgrftisrdnakntvylqmdslkpedtavyycnreirgssgiwypldywgqgtqvtvssahhsedpssaaas。

9、第二方面，本發(fā)明提供了一種核酸分子，所述核酸分子編碼第一方面所述的單域抗體。

10、優(yōu)選地，所述核酸分子的核苷酸序列包括seq?id?no.5所示的序列。

11、seq?id?no.5：atggctcaggtaaaactagaggagagtggaggaggcttggtgcaa?cccggcggttcacttcggttaagctgtgccgcttccgggtcaatctttagcattcatgacatgggttggtatagacaagcaccagggaagcaacgtgaacttgtagctagaataacaagtggcttatctaccaactatgccgatagcgttaagggtagatttacgatctcacgtgacaacgccaaaaatactgtatatcttcaaatggactcattaaaaccggaggataccgcagtatattactgtaatcgcgaaatccgtgggtcaagtgggatatggtatccgctggattattggggccaaggaactcaggttacagtctcttccgctcatcacagtgaagaccccagttccgcagcggccagc。

12、第三方面，本發(fā)明提供了一種重鏈抗體，所述重鏈抗體包括第一方面所述的單域抗體。

13、優(yōu)選地，所述重鏈抗體還包括ig?fc。

14、優(yōu)選地，所述ig?fc包括igg1、igg2、igg3或igg4的fc段中的任意一種。

15、優(yōu)選地，所述igg1的fc段氨基酸序列包括seq?id?no.6所示的序列。

16、seq?id?no.6：epkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvv?dvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk。

17、優(yōu)選地，所述重鏈抗體的氨基酸序列包括seq?id?no.7所示的序列。

18、seq?id?no.7：maqvkleesggglvqpggslrlscaasgsifsihdmgwyrqapgkqr?elvaritsglstnyadsvkgrftisrdnakntvylqmdslkpedtavyycnreirgssgiwypldywgqgtqvtvssahhsedpssaaasahhsedpssaaasgatkaepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk。

19、第四方面，本發(fā)明提供了一種表達載體，所述表達載體中含有第二方面所述的核酸分子。

20、優(yōu)選地，所述表達載體中含有第三方面所述的重鏈抗體的編碼基因。

21、第五方面，本發(fā)明提供了一種宿主細胞，所述宿主細胞含有第四方面所述的表達載體。

22、第六方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包括第一方面所述的單域抗體、第三方面所述的重鏈抗體或第五方面所述的宿主細胞中的任意一種或至少兩種的組合。

23、優(yōu)選地，所述藥物組合物還包括免疫細胞。

24、優(yōu)選地，所述免疫細胞包括t細胞

25、第七方面，本發(fā)明提供了如第一方面所述的單域抗體、第二方面所述的核酸分子、第三方面所述的重鏈抗體、第四方面所述的表達載體、第五方面所述的宿主細胞或第六方面所述的藥物組合物中的任意一種或至少兩種的組合在制備腫瘤治療藥物中的應(yīng)用。

26、優(yōu)選地，所述腫瘤包括結(jié)直腸癌、結(jié)腸癌、直腸癌、食管癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌、膽管癌、肺癌或鼻咽癌中的任意一種或至少兩種的組合。

27、上述各項數(shù)值范圍內(nèi)的其他具體點值均可選擇，在此便不再一一贅述。

28、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

29、本發(fā)明使用pd-1蛋白免疫羊駝，通過elisa確定羊駝血清中pd-1特異性抗體的效價后，分離羊駝外周血單個核細胞，提取rna并反轉(zhuǎn)錄獲得cdna。用羊駝單域抗體特異性引物，擴增vhh序列，并克隆至酵母表達質(zhì)粒中，構(gòu)建酵母展示文庫。然后用生物素-pd-1蛋白-鏈霉素磁珠或鏈霉素磁珠對酵母展示文庫進行正負篩選，富集結(jié)合pd-1蛋白的酵母菌。從富集產(chǎn)物中挑取單克隆，通過elisa檢測候選抗體與pd-1的特異性結(jié)合情況。陽性抗體表達純化后，檢測其與pd-1蛋白結(jié)合的親和力。選擇與pd-1親和力強的抗體克隆，檢測阻斷pd-1和pd-l1結(jié)合的能力。結(jié)果顯示，羊駝抗體的特異性高，同時可以阻斷pd-1和pd-l1的結(jié)合，增強免疫細胞的功能。