本發(fā)明屬于生物，涉及一種金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌及耐藥基因的同步檢測方法和檢測用重組酶聚合酶擴增(recombinase?polymerase?am?plification，rpa)引物。

背景技術(shù)：

1、食源性疾病是指通過攝食而進入人體的有毒有害物質(zhì)(包括生物性病原體)等致病因子所造成的疾病。一般可分為感染性和中毒性，包括常見的食物中毒、腸道傳染病、人畜共患傳染病、寄生蟲病以及化學(xué)性有毒有害物質(zhì)所引起的疾病。食源性疾患的發(fā)病率居各類疾病總發(fā)病率的前列，是當前世界上最突出的衛(wèi)生問題。其中金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌等是主要病原菌，亟需針對其檢測的便捷方法。

2、金黃色葡萄球菌(staphylococcus?aureus，s.aureus)又稱金葡菌，是在水產(chǎn)品、生肉、牛奶等食品中污染率較高的食源性致病菌。在食品生產(chǎn)及加工過程中，金葡菌還能形成生物被膜，增加了食品交叉污染和疾病傳播的可能性，是威脅食品安全與人類健康的重要因素之一。金葡菌常寄生于人和動物的咽喉、腸胃、皮膚、鼻腔、化膿瘡口中，空氣、污水等自然環(huán)境中也無處不在，接觸并污染食物的途徑較多。人被金葡菌感染后，會造成皮膚及軟組織的感染、中毒性休克綜合癥、敗血癥和肺炎等。金葡菌是全世界醫(yī)院感染的首要致病菌，我國每年發(fā)生的由金葡菌導(dǎo)致的食物中毒事件較多，全國各地均有報道。

3、蠟樣芽孢桿菌(bacillus?cereus)是一種常見的革蘭氏陽性食源性致病菌，在自然界中廣泛分布，可污染包括谷物、乳類、肉類在內(nèi)的幾乎所有食物。臨床上污染通常會導(dǎo)致腹瀉型和嘔吐型食物中毒，嚴重時可能會引起局部和全身性的感染，包括心內(nèi)炎、眼內(nèi)炎、腦膜炎、肝炎等。與其他食源性致病菌不同的是，蠟樣芽孢桿菌可產(chǎn)生對不利環(huán)境條件具有極強抗逆性的芽孢，一旦環(huán)境條件適宜芽孢可進一步萌發(fā)為營養(yǎng)細胞，從而引發(fā)食源性疾病。

4、磺胺類藥物與細菌接觸后會出現(xiàn)耐藥性，因磺胺類藥物的結(jié)構(gòu)引起的細菌耐藥性，會出現(xiàn)交叉反應(yīng)，該細菌會對所有的磺胺類藥物及其衍生物都產(chǎn)生耐藥性，在使用磺胺類藥物抑制該細菌生長繁殖時，就會失去作用。盡管如此，國內(nèi)外研究表明，在畜禽養(yǎng)殖場中發(fā)現(xiàn)了攜帶磺胺類耐藥基因的金黃色葡萄球菌菌。耐藥基因的存在和傳播導(dǎo)致畜禽養(yǎng)殖場的發(fā)病率和死亡率上升，引起廣泛關(guān)注。因此，迫切需要建立一種操作簡便、快速準確、靈敏度和特異性較高的方法，用于檢測。

5、目前，對金黃色葡萄球菌的檢測主要依靠分離培養(yǎng)法、免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)方法。蠟樣芽孢桿菌的快速檢測方法有傳統(tǒng)培養(yǎng)法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(elisa)、聚合酶鏈式反應(yīng)(pcr)、實時熒光定量pcr(rt-qpcr)等方法。然而上述方法均需要經(jīng)過前增菌或選擇性培養(yǎng)等前處理過程，影響檢測的靈敏度和準確性，且費時、費力。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能夠同時檢測金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌及磺胺類耐藥基因(sul1)的rpa引物及其應(yīng)用，各特異性引物具有高度種內(nèi)保守、種間特異性等優(yōu)點。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供一種能夠同時檢測金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌及磺胺類耐藥基因(sul1)的rpa引物，包括三對特異性引物f1-r1、f2-r2、f3-r3，其引物序列如下：

4、f1：5’-aaaatcatcatccgttaggctttgcttgctg-3’

5、r1：5’-tcgatttcagcggcgtttatacgctcgcaga-3’

6、f2：5’-ttttgcgagatagcggtgcgaaagtcctcct-3’

7、r2：5’-aagcaaacactaatagcttctcctacttccc-3’

8、f3：5’-atgttacgcagcagggcagtcgccctaaaac-3’

9、r3：5’-ccgagagggtttatctttcatacgtcaacag-3’。

10、第二方面，本發(fā)明提供一種檢測金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌及磺胺類耐藥基因(sul1)的方法，包括以下步驟：

11、提取待測樣本的dna，以上述rpa特異性引物組合物進行重組酶聚合酶擴增，檢測擴增產(chǎn)物。

12、進一步地，提取待測樣本菌液的dna具體包括以下步驟：

13、將待測樣本離心收集后，經(jīng)裂解處理并使用有機溶劑抽提去除蛋白質(zhì)，隨后加入異丙醇dna進行沉淀；所得沉淀經(jīng)乙醇清洗并干燥后，溶解于緩沖溶液中，獲得dna提取物。

14、進一步地，重組酶聚合酶擴增體系為：

15、反應(yīng)體系的體積為50μl，其中再水化緩沖液29.5μl，去離子水8μl，rpa特異性引物組合物9μl，提取的樣品基因組dna?1μl，醋酸鎂溶液2.5μl；所述rpa特異性引物組合物中，f1、r1、f2、r2、f3、r3的濃度均為10μmol/l；醋酸鎂溶液的濃度為280mmol/l。

16、進一步地，擴增的溫度為37℃。

17、進一步地，擴增的時間為20min。

18、進一步地，采用凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物；其中：

19、如果在487bp處有特異性條帶，說明待測樣本是金黃色葡萄球菌，不是蠟樣芽孢桿菌且不攜帶磺胺類耐藥基因；如果在239bp處有特異性條帶，說明待測樣本不是金黃色葡萄球菌也不是蠟樣芽孢桿菌，但是待測樣本存在磺胺類耐藥基因；如果在101bp有特異性條帶，說明待測樣本是蠟樣芽孢桿菌，不是金黃色葡萄球菌也不攜帶磺胺類耐藥基因；

20、如果在487bp與239bp處都有特異性條帶，說明待測樣本為攜帶磺胺類耐藥基因的金黃色葡萄球菌；如果在101bp與239bp處都有特異性條帶，說明待測樣本為攜帶磺胺類耐藥基因的蠟樣芽孢桿菌；無條帶，說明待測樣本既不是金黃色葡萄球菌也不是蠟樣芽孢桿菌，且不攜帶磺胺類耐藥基因。

21、第三方面，本發(fā)明提供一種檢測金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌及磺胺類耐藥基因的試劑盒，其中包含上述rpa特異性引物組合物。

22、第四方面，本發(fā)明提供上述rpa特異性引物組合物在制備金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌及磺胺類耐藥基因檢測試劑盒中的用途。

23、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：

24、本發(fā)明提供了用于同時檢測金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌及磺胺類耐藥基因(sul1)的rpa引物、檢測產(chǎn)品及其應(yīng)用，根據(jù)布氏桿菌、蠟樣芽孢桿菌及磺胺類耐藥基因(sul1)設(shè)計特異性檢測引物，并對該引物對進行特異性、靈敏性檢測，對rpa反應(yīng)體系包括引物濃度、反應(yīng)時間進行優(yōu)化。通過試驗證明，本發(fā)明的rpa擴增引物特異性強、靈敏度高、具有較好的種間特異性和種內(nèi)保守性，其檢測時間短，能在一次反應(yīng)中檢測出金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌及磺胺類耐藥基因(sul1)，不需要特殊的儀器和使用范圍廣，在公共衛(wèi)生等領(lǐng)域具有深遠的應(yīng)用價值。