本發(fā)明涉及穿心蓮內(nèi)酯生物合成，尤其涉及一種用于穿心蓮內(nèi)酯生物合成途徑工藝。

背景技術：

1、細胞色素p450酶(p450s)是自然界中用途最廣的氧化酶之一，同時也是第一組被歸類為“超級家族”的酶類，它包括1000多個家族和2500個亞家族，不同種類的p450氧化酶催化了一系列與天然產(chǎn)物的生物合成相關的氧化反應，包括羥化、環(huán)氧化、脫氫以及c-c、c-n和c-s鍵的形成，p450催化的氧化羥化和環(huán)化在許多天然產(chǎn)物的生物合成中非常重要，其中，cyp71是p450氧化酶中最大的亞家族，有文獻報道，cyp71亞家族的cyp76ah、cyp76ak等成員參與了丹參中二萜類化合物的合成代謝，這表明cyp71家族在藥用植物二萜合成中可能起到關鍵作用。

2、穿心蓮內(nèi)酯作為一種二萜化合物，具有四個異戊二烯單位，其合成前體異戊二烯焦磷酸(ipp)和二甲烯丙基焦磷酸(dmapp)主要來源于甲羥戊酸途徑(mva)和2-c-甲基-d-赤蘚糖醇-4-磷酸途徑(mep)，ipp和dmapp通過縮合反應合成牦牛兒基牦牛兒基焦磷酸(ggpp)，隨后在copalyl/labdadienyl?diphosphate?synthases(cps)的作用下被催化形成穿心蓮內(nèi)酯的前體骨架—ent-copalol，截至目前，還尚未發(fā)現(xiàn)有cyp450能夠催化穿心蓮內(nèi)酯合成途徑的中間體，值得一提的是，穿心蓮內(nèi)酯合成途徑中，羥基化是穿心蓮內(nèi)酯合成的唯一修飾方式，且本實驗室在前期已從穿心蓮中分離制備了關鍵的中間體(4r,5s,9r,10s)-labda-8(17),13-dien-15,19-diol(cas:37886-56-9)，用于挖掘穿心蓮內(nèi)酯合成途徑關鍵cyp450，并為研究二萜化合物的羥基化修飾提供重要參考；

3、穿心蓮是我國傳統(tǒng)的中藥，它的抗炎、抗癌和免疫調(diào)節(jié)特性已得到廣泛認可，這使其在治療關節(jié)炎、潰瘍性結腸炎、炎癥性腸病等各種炎癥和疾病方面具有療效，其二萜類成分穿心蓮內(nèi)酯是主要的藥用次生代謝產(chǎn)物，雖然穿心蓮內(nèi)酯具有重要的醫(yī)用價值，但其生物合成途徑尚未被解析，面對大量的市場需求，穿心蓮內(nèi)酯的唯一來源依然是植物提取，因此迫切需要解析穿心蓮內(nèi)酯生物合成途徑。

技術實現(xiàn)思路

1、鑒于上述現(xiàn)有穿心蓮內(nèi)酯是我國傳統(tǒng)藥物，其在對抗上呼吸道疾病中發(fā)揮重要作用，被譽為天然抗生素。穿心蓮內(nèi)酯在臨床上用量巨大，但目前其獲取方式只能依靠植物提取，這導致穿心蓮內(nèi)酯供應緊張的問題，提出了本發(fā)明。

2、因此，本發(fā)明目的是提供一種用于穿心蓮內(nèi)酯生物合成途徑工藝，其目的在于：利用轉(zhuǎn)錄組學關聯(lián)分析，挖掘到了能夠催化(4r,5s,9r,10s)-labda-8(17),13-dien-15,19-diol連續(xù)氧化并最終形成新穿心蓮內(nèi)酯苷元的cyp450基因，并利用煙草瞬時表達系統(tǒng)驗證了內(nèi)酯環(huán)的形成。不僅為穿心蓮內(nèi)酯的生物合成提供重要基因元件，同時為穿心蓮的分子設計育種提供關鍵基因位點。

3、為解決上述技術問題，本發(fā)明提供如下技術方案：一種用于穿心蓮內(nèi)酯生物合成途徑工藝，包括：

4、步驟一，通過對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行差異表達分析，發(fā)現(xiàn)apcyp71be90在莖葉中特異性高表，與穿心蓮的積累部位相一致；

5、步驟二，采集穿心蓮成熟葉片，利用rna提取試劑盒(艾德萊，rn38?easyspinplus)提取穿心蓮成熟葉片中的rna，檢測合格后通過反轉(zhuǎn)錄獲得cdna；

6、步驟三，設計引物序列，選取sali和xhoi作為連接位點，并設計引物，已測序的peasy-blunt-apcyp71be90為模板，使用2*keypo進行基因擴增；

7、步驟四，連接反應：使用sali和xhoi酶切peaq骨架，與擴增獲得的apcyp71be90的pcr產(chǎn)物一起切膠回收膠，回收后使用t4連接酶進行連接，連接后轉(zhuǎn)化t1感受態(tài)，涂于kan抗性板，篩選單克隆進行菌液pcr，測序成功的陽性克隆提取重組質(zhì)粒用于后續(xù)實驗。

8、作為本發(fā)明所述用于穿心蓮內(nèi)酯生物合成途徑工藝的一種優(yōu)選方案，其中：所述設計引物序列，以cdna為模板，利用2*keypo高保真酶克隆apcyp71be90基因片段(2*keypo高保真酶；pcr體系總體積為50μl：2μl正向引物(10μm)，2μl反向引物(10μm)，2μl模板，25μl2*keypo?mix和19μl水，程序)，借助peasy-blunt載體，成功將apcyp71be90片段連入載體上(連接體系總體積為2.5μl：0.5μl?peasy-blunt載體和2.0μl?cdna模板，25℃連接反應1h)，連接體系直接轉(zhuǎn)化transt1感受態(tài)，挑選陽性克隆測序(菌落pcr體系總體積為25μl：13μl?2×taq?pcr?mix，1μl模板，1μl正引物，1μl反引物和9μl水)，與參考序列比對，核苷酸序列與原數(shù)據(jù)相似度100％。

9、作為本發(fā)明所述用于穿心蓮內(nèi)酯生物合成途徑工藝的一種優(yōu)選方案，其中：所述步驟三中體系總體積為50μl：2μl正向引物(10μm)，2μl反向引物(10μm)，2μl模板，25μl?2*keypo?mix和19μl水。

10、作為本發(fā)明所述用于穿心蓮內(nèi)酯生物合成途徑工藝的一種優(yōu)選方案，其中：所述步驟四中使用t4連接酶將骨架和片段16度過夜連接，轉(zhuǎn)入transt1感受態(tài)，于50mg/ml?kan抗性lb固體培養(yǎng)基上篩選peaq-ht-apcyp71be90陽性克隆并pcr檢測。

11、作為本發(fā)明所述用于穿心蓮內(nèi)酯生物合成途徑工藝的一種優(yōu)選方案，其中：所述apcyp71be90含有1500個核苷酸，編碼499個氨基酸的蛋白，并通過官方命名apcyp71be90。

12、本發(fā)明的有益效果：通過利用轉(zhuǎn)錄組學關聯(lián)分析，挖掘到了能夠催化(4r,5s,9r,10s)-labda-8(17),13-dien-15,19-diol連續(xù)氧化并最終形成新穿心蓮內(nèi)酯苷元的cyp450基因，并利用煙草瞬時表達系統(tǒng)驗證了內(nèi)酯環(huán)的形成，不僅為穿心蓮內(nèi)酯的生物合成提供重要基因元件，同時為穿心蓮的分子設計育種提供關鍵基因位點。

技術特征：

1.一種用于穿心蓮內(nèi)酯生物合成途徑工藝，其特征在于，包括如下步驟：

2.根據(jù)權利要求1所述的用于穿心蓮內(nèi)酯生物合成途徑工藝，其特征在于：所述設計引物序列，以cdna為模板，利用2*keypo高保真酶克隆apcyp71be90基因片段(2*keypo高保真酶；pcr體系總體積為50μl：2μl正向引物(10μm)，2μl反向引物(10μm)，2μl模板，25μl?2*keypo?mix和19μl水，程序)，借助peasy-blunt載體，成功將apcyp71be90片段連入載體上(連接體系總體積為2.5μl：0.5μl?peasy-blunt載體和2.0μl?cdna模板，25℃連接反應1h)，連接體系直接轉(zhuǎn)化transt1感受態(tài)，挑選陽性克隆測序(菌落pcr體系總體積為25μl：13μl?2×taq?pcr?mix，1μl模板，1μl正引物，1μl反引物和9μl水)，與參考序列比對，核苷酸序列與原數(shù)據(jù)相似度100％。

3.根據(jù)權利要求1所述的用于穿心蓮內(nèi)酯生物合成途徑工藝，其特征在于：所述步驟三中體系總體積為50μl：2μl正向引物(10μm)，2μl反向引物(10μm)，2μl模板，25μl?2*keypomix和19μl水。

4.根據(jù)權利要求1所述的用于穿心蓮內(nèi)酯生物合成途徑工藝，其特征在于：所述步驟四中使用t4連接酶將骨架和片段16度過夜連接，轉(zhuǎn)入transt1感受態(tài)，于50mg/ml?kan抗性lb固體培養(yǎng)基上篩選peaq-ht-apcyp71be90陽性克隆并pcr檢測。

5.根據(jù)權利要求1所述的用于穿心蓮內(nèi)酯生物合成途徑工藝，其特征在于：所述apcyp71be90含有1500個核苷酸，編碼499個氨基酸的蛋白，并通過官方命名apcyp71be90。

技術總結
本發(fā)明涉及穿心蓮內(nèi)酯生物合成技術領域，公開了一種用于穿心蓮內(nèi)酯生物合成途徑工藝，其中用于穿心蓮內(nèi)酯生物合成途徑工藝，包括步驟一，通過對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行差異表達分析，發(fā)現(xiàn)ApCYP71BE90在莖葉中特異性高表，與穿心蓮的積累部位相一致；步驟二，采集穿心蓮成熟葉片，利用RNA提取試劑盒(艾德萊，RN38EASYspin?plus)提取穿心蓮成熟葉片中的RNA，檢測合格后通過反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。該用于穿心蓮內(nèi)酯生物合成途徑工藝通過利用轉(zhuǎn)錄組學關聯(lián)分析挖掘到了能夠催化(4R,5S,9R,10S)?labda?8,13?dien?15,19?diol連續(xù)氧化并最終形成新穿心蓮內(nèi)酯苷元的CYP450基因，并利用煙草瞬時表達系統(tǒng)驗證了內(nèi)酯環(huán)的形成，不僅為穿心蓮內(nèi)酯的生物合成提供重要基因元件，同時為穿心蓮的分子設計育種提供關鍵基因位點。

技術研發(fā)人員：孫偉,王思凡,孟祥霄,陳士林,謝寧,萬會花,陳偉強,劉地發(fā),蔣春紅
受保護的技術使用者：中國中醫(yī)科學院中藥研究所
技術研發(fā)日：
技術公布日：2025/5/8