本發(fā)明屬于生物醫(yī)學，具體地，涉及一種中和sars-cov-2的人源單克隆抗體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、新型冠狀病毒感染的病原sars-cov-2為冠狀病毒科β病毒屬，是線性正鏈rna病毒，研究發(fā)現(xiàn)，sars-cov-2在進化樹的位置上，與sars-cov、類sars-cov的類群相鄰，新型冠狀病毒有4種主要的結(jié)構(gòu)蛋白：刺突蛋白(spike?protein，s蛋白)，核衣殼蛋白(nucleocapsid，n蛋白)，膜蛋白(membrane?protein，m蛋白)，包膜蛋白(envelopeprotein，e蛋白)。s蛋白含有兩個亞基，s1和s2，s1亞基上的rbd結(jié)構(gòu)域通過與人的呼吸道上皮細胞膜ace2的相互作用完成了病毒顆粒在受體細胞上的吸附，而s2亞基則介導(dǎo)了病毒囊膜與易感細胞膜結(jié)構(gòu)的融合過程。因此，s1和s2亞基均含有中和抗體的表位。

2、作為疫苗和化學治療的補充，由抗體介導(dǎo)的預(yù)防和治療病毒感染的措施已顯現(xiàn)良好的效果，其應(yīng)用前景得到專家的認同。與s1易于突變的特性不同，作為一種典型的膜融合蛋白，s2結(jié)構(gòu)域在序列和結(jié)構(gòu)上更為保守，更適合作為篩選廣譜抗體的靶點，目前已成為業(yè)界公認的制備針對sars-cov-2保護性疫苗和廣譜中和抗體的區(qū)域。目前，尚無針對sars-cov-2感染的治療藥物，針對sars-cov-2感染導(dǎo)致的covid-19的治療方案多以緩解癥狀、預(yù)防繼發(fā)感染、減少并發(fā)癥發(fā)生以及進行器官功能支持為主。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)具有良好中和病毒效果的冠狀病毒中和性抗體，尤其是單克隆抗體。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明的目的在于為本領(lǐng)域提供一種中和sars-cov-2的人源單克隆抗體s2及其應(yīng)用。本發(fā)明采用噬菌體展示技術(shù)，構(gòu)建了一個大容量的人源免疫型噬菌體抗體文庫，并以sars-cov-2病毒s2亞基為靶標，篩選人源抗體單鏈抗體片段(single?chainvariable?fragment,scfv)，獲得1個scfv抗體分子s2，進一步的研究表明，該單抗對sars-cov-2病毒有較強的中和作用。

2、本發(fā)明采用如下技術(shù)方案實現(xiàn)上述發(fā)明目的：

3、本發(fā)明的第一方面提供了一種中和sars-cov-2的人源單克隆抗體，所述單克隆抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)；

4、所述重鏈可變區(qū)中的cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3的氨基酸序列分別如seq?id?no:2、seq?id?no:4、seq?id?no:6所示；

5、所述輕鏈可變區(qū)中的cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3的氨基酸序列分別如seq?id?no:11、gkn、seq?id?no:15所示。

6、進一步，所述重鏈可變區(qū)中的fr-h1、fr-h2、fr-h3、fr-h4的氨基酸序列分別如seqid?no:1、seq?id?no:3、seq?id?no:5、seq?id?no:7所示或與seq?id?no:1、seq?id?no:3、seq?id?no:5、seq?id?no:7具有至少70％同源性的氨基酸序列；

7、所述輕鏈可變區(qū)中的fr-l1、fr-l2、fr-l3、fr-l4的氨基酸序列分別如seq?id?no:10、seq?id?no:12、seq?id?no:14、seq?id?no:16所示或與seq?id?no:10、seq?id?no:12、seq?id?no:14、seq?id?no:16具有至少70％同源性的氨基酸序列。

8、進一步，所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no:8所示或與seq?id?no:8具有至少70％同源性的氨基酸序列；

9、可選地，所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no:17所示或與seq?id?no:17具有至少70％同源性的氨基酸序列。

10、在一些實施方案中，本發(fā)明所述單克隆抗體的重鏈可變區(qū)中的cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3，輕鏈可變區(qū)中的cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3并不局限于如前所示的氨基酸序列，采用任何cdr編號方案對本發(fā)明如前所述的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)中的cdr1、cdr2、cdr3進行定義得到的cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3、cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3對應(yīng)的氨基酸序列均在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。

11、在一些實施方案中，所述cdr編號方案包括但不限于：chothia編號方案、kabat編號方案、contact編號方案、imgt編號方案、martin(增強型chothia)編號方案、abm編號方案、aho編號方案中的任意一種或任意多種(兩種或兩種以上)組合。

12、在一些實施方案中，與本發(fā)明所提供的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)對應(yīng)的氨基酸序列、輕鏈可變區(qū)對應(yīng)的氨基酸序列、重鏈可變區(qū)中的cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3對應(yīng)的氨基酸序列或輕鏈可變區(qū)中的cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3對應(yīng)的氨基酸序列與本發(fā)明如前所述的對應(yīng)氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同源性的抗體序列均在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。

13、在一些實施方案中，所述sars-cov-2包括但不限于：野生型sars-cov-2、sars-cov-2變異株xbb.1.16、sars-cov-2變異株xbb.2.3、sars-cov-2變異株jn.1s、sars-cov-2變異株bq.1.1、sars-cov-2阿爾法(alpha)變異株、sars-cov-2貝塔(beta)變異株、sars-cov-2伽馬(gamma)變異株、sars-cov-2德爾塔(delta)變異株、sars-cov-2奧密克戎(omicron)變異株。

14、本發(fā)明的第二方面提供了一種核酸分子，所述核酸分子編碼本發(fā)明第一方面所述的單克隆抗體；

15、可選地，所述單克隆抗體重鏈可變區(qū)的核苷酸序列如seq?id?no:9所示或與seqid?no:9具有至少70％同源性的核苷酸序列；

16、可選地，所述單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列如seq?id?no:18所示或與seqid?no:18具有至少70％同源性的核苷酸序列。

17、在本發(fā)明中，所述核酸分子是指核苷酸的聚合形式，并且包括rna、cdna、基因組dna的正義鏈和反義鏈，以及合成形式和以上的混合聚合物。在特定實施方式中，核苷酸是指核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸或任一核苷酸類型的修飾形式，及其組合。所述核酸分子還包括但不限于dna的單鏈形式和雙鏈形式。此外，多核苷酸，例如，cdna或mrna，可以包括通過天然存在的和/或非天然存在的核苷酸鍵連接在一起的任一或兩種天然存在的和修飾的核苷酸。

18、在一些實施方案中，所述核酸分子可以進行化學或生物化學修飾，或可以含有非天然的或衍生的核苷酸堿基，如本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解的。這樣的修飾包括例如，標記、甲基化、一個或多個天然存在的核苷酸用類似物置換、核苷酸間修飾如不帶電的連接(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、帶電的連接(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、側(cè)接部分(例如，多肽)、嵌入劑(例如，吖啶、補骨脂素等)、螯合劑、烷化劑和修飾的鍵(例如，α異頭核酸等)。

19、本發(fā)明的第三方面提供了一種表達載體，所述表達載體包含本發(fā)明第二方面所述的核酸分子；

20、可選地，所述載體為dna載體、rna載體或病毒來源的載體；

21、可選地，所述病毒來源的載體為慢病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、腺病毒載體、痘病毒載體或皰疹病毒載體。

22、在本發(fā)明中，所述表達載體是指能夠擴增與其連接的另一個核酸的核酸分子。所述表達載體包括作為自我復(fù)制核酸結(jié)構(gòu)的載體以及結(jié)合至已經(jīng)將其引入其中的宿主細胞的基因組中的載體。某些載體能夠指引與其可操作地連接的核酸的表達。

23、在一些實施方案中，所述表達載體包括但不限于：質(zhì)粒、粘粒、細菌人造染色體(bac)和酵母人造染色體(yac)，以及源自噬菌體或者植物或動物(包括人)病毒的載體。載體可以包括宿主細胞識別的復(fù)制起點，并且在表達載體的情況中，包括被宿主細胞識別的啟動子和其他調(diào)控序列。在特定實施方式中，載體包括可操作地連接啟動子和任選的其他調(diào)控元件的編碼本發(fā)明如前所述的單克隆抗體的核酸分子。某些載體能夠在它們引入其中的宿主中自主復(fù)制(例如，具有細菌復(fù)制起點的載體可以在細菌中復(fù)制)。其他載體可以在引入宿主中時整合至宿主的基因組中，并且由此與宿主基因組一起復(fù)制。載體包括但不限于：適用于本發(fā)明如前所述的單克隆抗體的重組產(chǎn)生的那些，以及適用于引入需要的受試者或其細胞中的那些，以將本發(fā)明如前所述的單克隆抗體提供給受試者。

24、在一些實施方案中，所述具體載體的選擇取決于遵循的重組程序和使用的宿主。將載體引入宿主細胞中可以特別地通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染、病毒感染、deae-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染或電穿孔來實現(xiàn)。載體可以自主復(fù)制或可以與它們已經(jīng)整合至其中的染色體一起復(fù)制。在某些實施方式中，載體包含一個或多個選擇標記。標記的選擇可以取決于選擇的宿主細胞。這些包括但不限于：卡那霉素、新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、博來霉素、來自單純皰疹病毒的胸苷激酶基因和來自小鼠的二氫葉酸還原酶基因。

25、本發(fā)明的第四方面提供了一種重組宿主細胞，所述宿主細胞包含本發(fā)明第三方面所述的表達載體。

26、在一些實施方案中，所述宿主細胞包括但不限于：cos細胞，包括cos7細胞；293細胞，包括293-6e細胞；cho細胞，包括cho-s和dg44細胞；nso細胞；酵母等?；谄鋵Ρ景l(fā)明如前所述的單克隆抗體的重鏈和/或輕鏈進行所需的翻譯后修飾的能力來選擇特定的真核宿主細胞。

27、在一些實施方案中，可以通過任何方法將本發(fā)明如前所述的核酸分子引入到所期望的宿主細胞中，所述方法包括但不限于：deae-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣轉(zhuǎn)染、陽離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染等。在本發(fā)明中，可以根據(jù)任何合適的方法將核酸瞬時或穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染到所期望的宿主細胞中。

28、本發(fā)明的第五方面提供了如下任一種產(chǎn)品：

29、(1)一種抗體衍生物，所述抗體衍生物為本發(fā)明第一方面所述的單克隆抗體直接或間接偶聯(lián)至可檢測標記物上形成的復(fù)合物；

30、(2)一種檢測試劑，所述檢測試劑包含本發(fā)明第一方面所述的單克隆抗體、本發(fā)明第四方面所述的重組宿主細胞和/或所述抗體衍生物；

31、(3)一種檢測試劑盒，所述檢測試劑盒包含本發(fā)明第一方面所述的單克隆抗體、所述抗體衍生物和/或所述檢測試劑；

32、(4)一種檢測試紙條，所述檢測試紙條包含本發(fā)明第一方面所述的單克隆抗體、所述抗體衍生物和/或所述檢測試劑；

33、(5)一種治療用綴合物，所述治療用綴合物包含本發(fā)明第一方面所述的單克隆抗體；

34、(6)一種藥物組合物，所述藥物組合物包含本發(fā)明第一方面所述的單克隆抗體和/或所述治療用綴合物；

35、(7)一種藥物制劑，所述藥物制劑包含本發(fā)明第一方面所述的單克隆抗體、所述治療用綴合物和/或所述藥物組合物。

36、在一些實施方案中，本發(fā)明如前所述的單克隆抗體、重組宿主細胞、治療用綴合物、藥物組合物或藥物制劑可以通過各種途徑體內(nèi)施用，包括但不限于：靜脈內(nèi)、皮下、口服、動脈內(nèi)、腸胃外、鼻內(nèi)、肌內(nèi)、心內(nèi)、心室內(nèi)、氣管內(nèi)、口腔含化、直腸、腹膜內(nèi)、通過吸入、皮內(nèi)、局部、經(jīng)皮和鞘內(nèi)，或以其他方式，例如通過植入。

37、在一些實施方案中，所述藥物組合物或藥物制劑可以配制成固體、半固體、液體或氣體形式的配制物；包括但不限于片劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、軟膏劑、溶液劑、栓劑、灌腸劑、注射劑、吸入劑和氣霧劑。

38、在一些實施方案中，所述藥物組合物或藥物制劑還可包含多種藥學上可接受的載體?？捎酶鞣N藥學上可接受的載體包括但不限于：溶媒、佐劑和稀釋劑。此外，也可用各種藥學上可接受的輔助物質(zhì)，如ph調(diào)節(jié)劑和緩沖劑、張力調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑等。非限制性示例性載體包括鹽水、緩沖鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其組合。

39、在一些實施方案中，可以通過將本發(fā)明如前所述的抗體溶解、懸浮或乳化在水性或非水性溶劑如植物油或其他油、合成脂族酸甘油酯、高級脂族酸的酯或丙二醇中；并且如果需要，添加常規(guī)添加劑如增溶劑、等滲劑、懸浮劑、乳化劑、穩(wěn)定劑和防腐劑，來將本發(fā)明如前所述的抗體配制成用于注射，包括皮下施用。

40、在一些實施方案中，可以將本發(fā)明如前所述的藥物組合物或藥物制劑配制成用于吸入，例如，使用加壓的可接受的推進劑如二氯二氟甲烷、丙烷、氮氣等。

41、在一些實施方案中，還可以將如前所述的藥物組合物或藥物制劑與可生物降解或不可生物降解的聚合物一起配制成持續(xù)釋放的微膠囊。非限制性示例性可生物降解制劑包括聚乳酸-乙醇酸(plga)聚合物。非限制性示例性不可生物降解的制劑包括聚甘油脂肪酸酯。可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的制備此類制劑的某些方法制備獲得所述持續(xù)釋放的微膠囊。

42、本發(fā)明的第六方面提供了如下任一種方法：

43、(1)一種生產(chǎn)本發(fā)明第一方面所述單克隆抗體的方法，所述方法包括：培養(yǎng)本發(fā)明第四方面所述的重組宿主細胞，從重組宿主細胞培養(yǎng)產(chǎn)物中分離得到本發(fā)明第一方面所述的單克隆抗體；

44、(2)一種制備本發(fā)明第四方面所述重組宿主細胞的方法，所述方法包括：將本發(fā)明第二方面所述的核酸分子或本發(fā)明第三方面所述的表達載體引入到宿主細胞中，得到所述重組宿主細胞；

45、(3)一種非診斷和非治療目的地檢測sars-cov-2s蛋白的方法，所述方法包括：將本發(fā)明第一方面所述的單克隆抗體、本發(fā)明第五方面中所述的抗體衍生物或檢測試劑與待測樣品接觸，檢測所述單克隆抗體與sars-cov-2s蛋白免疫復(fù)合物的形成；

46、(4)一種體外抑制sars-cov-2s蛋白活性的方法，所述方法包括：將本發(fā)明第一方面所述的單克隆抗體、本發(fā)明第五方面中所述的抗體衍生物或檢測試劑與有需要的體系接觸；

47、可選地，所述sars-cov-2s蛋白為sars-cov-2s蛋白、sars-cov-2變異株xbb?s蛋白或sars-cov-2變異株jn.1s蛋白。

48、在本發(fā)明中，所述樣品是指從感興趣的受試者獲得或衍生的材料，該材料包含有待例如基于物理、生化、化學和/或生理特性表征和/或鑒定的細胞和/或其他分子實體。例如，待測樣品及其變體是指從感興趣的受試者獲得的任何樣品，這些樣品預(yù)期或已知含有待表征的細胞和/或分子實體。

49、在一些實施方案中，所述有需要的體系包括但不限于：細胞體系、亞細胞體系、組織體系、類器官體系或器官體系。

50、本發(fā)明的第七方面提供了如下任一種應(yīng)用：

51、(1)本發(fā)明第一方面所述的單克隆抗體、本發(fā)明第二方面所述的核酸分子、本發(fā)明第三方面所述的表達載體或本發(fā)明第四方面所述的重組宿主細胞在制備用于檢測sars-cov-2s蛋白的檢測試劑中的應(yīng)用；

52、(2)本發(fā)明第一方面所述的單克隆抗體、本發(fā)明第二方面所述的核酸分子、本發(fā)明第三方面所述的表達載體、本發(fā)明第四方面所述的重組宿主細胞、本發(fā)明第五方面中所述的抗體衍生物或檢測試劑在制備用于檢測sars-cov-2s蛋白的檢測試劑盒或檢測試紙條中的應(yīng)用；

53、(3)本發(fā)明第一方面所述的單克隆抗體、本發(fā)明第二方面所述的核酸分子、本發(fā)明第三方面所述的表達載體、本發(fā)明第四方面所述的重組宿主細胞、本發(fā)明第五方面中所述的抗體衍生物或檢測試劑在制備用于診斷和/或輔助診斷sars-cov-2感染疾病的診斷產(chǎn)品中的應(yīng)用；

54、(4)本發(fā)明第一方面所述的單克隆抗體、本發(fā)明第二方面所述的核酸分子、本發(fā)明第三方面所述的表達載體、本發(fā)明第四方面所述的重組宿主細胞、本發(fā)明第五方面中所述的抗體衍生物或檢測試劑在非診斷和非治療目的地用于檢測sars-cov-2s蛋白中的應(yīng)用；

55、(5)本發(fā)明第一方面所述的單克隆抗體、本發(fā)明第二方面所述的核酸分子、本發(fā)明第三方面所述的表達載體或本發(fā)明第四方面所述的重組宿主細胞在制備用于治療和/或預(yù)防sars-cov-2感染疾病的藥物組合物中的應(yīng)用；

56、(6)本發(fā)明第一方面所述的單克隆抗體、本發(fā)明第二方面所述的核酸分子、本發(fā)明第三方面所述的表達載體、本發(fā)明第四方面所述的重組宿主細胞、本發(fā)明第五方面中所述的藥物組合物在制備用于治療和/或預(yù)防sars-cov-2感染疾病的藥物制劑中的應(yīng)用。

57、進一步，所述sars-cov-2s蛋白為sars-cov-2s蛋白、sars-cov-2變異株xbb?s蛋白或sars-cov-2變異株jn.1s蛋白；

58、可選地，所述sars-cov-2為sars-cov-2、sars-cov-2變異株xbb或sars-cov-2變異株jn.1s。

59、本發(fā)明還提供了一種用于診斷和/或輔助診斷sars-cov-2感染疾病的方法，所述方法包括：將本發(fā)明第一方面所述的單克隆抗體、本發(fā)明第二方面所述的核酸分子、本發(fā)明第三方面所述的表達載體、本發(fā)明第四方面所述的重組宿主細胞、本發(fā)明第五方面中所述的抗體衍生物、檢測試劑、檢測試劑盒或檢測試紙條與受試者來源的待測樣品接觸，檢測所述單克隆抗體與sars-cov-2s蛋白免疫復(fù)合物的形成，以診斷和/或輔助診斷受試者是否患有sars-cov-2感染疾病或受試者患sars-cov-2感染疾病的風險。

60、本發(fā)明還提供了一種用于治療和/或預(yù)防sars-cov-2感染疾病的方法，所述方法包括：給有需要的受試者施用治療和/或預(yù)防有效量的本發(fā)明第一方面所述的單克隆抗體、本發(fā)明第二方面所述的核酸分子、本發(fā)明第三方面所述的表達載體、本發(fā)明第四方面所述的重組宿主細胞、本發(fā)明第五方面中所述的藥物組合物或藥物制劑。

61、在本發(fā)明中，所述有效量是指本發(fā)明如前所述的單克隆抗體、重組宿主細胞、藥物組合物或藥物制劑(即：活性成分)在給予有此需要的受試者時足以產(chǎn)生所需活性的量。當施用活性成分的組合時，組合的有效量可以包括或可以不包括在單獨施用時可能有效的每種成分的量。所需的確切量將因受試者而異，這取決于受試者的物種、年齡和總體狀況、所治療病癥的嚴重程度、所用的具體藥物類型、施用方式等。

62、在本發(fā)明中，治療是指緩解或減輕與這種病癥相關(guān)的至少一種癥狀，或者減緩或逆轉(zhuǎn)這種病癥的進展。此外，所述治療還表示停止、延遲發(fā)作(即，疾病的臨床表現(xiàn)之前的時段)和/或降低發(fā)展或惡化疾病的風險。此外，所述治療還可以包括：(1)預(yù)防或延遲在可能患有或易感所述狀態(tài)、病癥或病況但尚未經(jīng)歷或顯示所述狀態(tài)、病癥或病況的臨床或亞臨床癥狀的受試者中所述狀態(tài)、病癥或病況的至少一種臨床或亞臨床癥狀的出現(xiàn)；或(2)抑制所述狀態(tài)、病癥或病況，即阻止、減少或延遲所述疾病或其復(fù)發(fā)(在維持治療的情況下)或其至少一種臨床或亞臨床癥狀的發(fā)展；或(3)緩解疾病，即引起所述狀態(tài)、病癥或病況或者其臨床或亞臨床癥狀中的至少一種的消退。在本發(fā)明中，所述預(yù)防是指預(yù)防暴露于病毒的受試者中的感染傳播，例如防止病毒進入受試者的細胞。

63、在一些實施方案中，所述sars-cov-2感染疾病的癥狀的非限制性示例包括但不限于：發(fā)燒、咳嗽、呼吸短促、肺炎、急性呼吸窘迫綜合征(ards)、急性肺綜合征、嗅覺喪失、味覺喪失、咽喉痛、鼻分泌物、胃腸癥狀(例如腹瀉)、器官衰竭(例如腎衰竭和腎功能障礙)、敗血性休克和死亡。

64、在本發(fā)明中，所述受試者是指人、獸醫(yī)動物(例如，貓、狗、牛、馬、綿羊、豬等)、獸醫(yī)禽類和疾病的實驗動物模型(例如，小鼠、大鼠、雪貂、猴等)。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明所述的受試者為人。

65、相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有的優(yōu)點和有益效果如下：

66、本發(fā)明首次公開了一種全新的中和sars-cov-2的人源單克隆抗體s2，以及包含所述人源單克隆抗體s2的衍生物，所述衍生物包含編碼所述抗體的核酸分子、包含所述核酸分子的表達載體、包含所述表達載體的宿主細胞、包含所述抗體或宿主細胞的藥物組合物、檢測試劑、檢測試劑盒等。本發(fā)明提供的人源單克隆抗體s2對sars-cov-2具有較強的中和活性，為sars-cov-2感染相關(guān)疾病的診斷、治療及相關(guān)藥物的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)，具有良好的應(yīng)用前景。