本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)，具體涉及非小細(xì)胞肺癌順鉑輕度耐藥細(xì)胞株及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、非小細(xì)胞肺癌(nsclc)是最常見的肺癌類型，早期發(fā)現(xiàn)和診斷對于降低腫瘤死亡率尤為重要。腫瘤分級、大小和位置、淋巴結(jié)狀態(tài)、患者整體健康狀況和肺功能等因素共同決定nsclc的治療選擇，其中手術(shù)、化療、放療和靶向治療是批準(zhǔn)的治療方式。針對具有明確驅(qū)動突變基因突變(包括egfr、alk、ros1、braf、mek、met、ret、kras以及her2等)設(shè)計(jì)的分子靶向藥物推動了nsclc的精準(zhǔn)化和個性化的治療發(fā)展，而對于無驅(qū)動基因突變的轉(zhuǎn)移性nsclc，靶向pd1或pdl1的腫瘤免疫治療(ici)是一線治療方案。然而大多數(shù)患者仍然會在治療后出現(xiàn)耐藥性和疾病進(jìn)展。因此，發(fā)現(xiàn)腫瘤耐藥機(jī)制、改進(jìn)分子標(biāo)志物識別模式以及評估耐藥性的潛在作用方式對于開發(fā)組合療法和改善治療結(jié)局至關(guān)重要。

2、腫瘤進(jìn)展中靶基因的不斷突變和擴(kuò)增，以及腫瘤微環(huán)境的改變都能產(chǎn)生選擇壓力，促進(jìn)患者對分子靶向藥物產(chǎn)生耐受性。靶向藥物的“脫靶”引起的細(xì)胞毒性是治療引起的不良事件的主要原因，并對藥物劑量和作用時間造成限制。化療是許多nsclc患者藥物治療的重要方式，常見藥物包括：順鉑、卡鉑、紫杉醇、白蛋白紫杉醇、多烯紫杉醇、吉西他濱、長春瑞濱、依托泊苷(vp-16)和培美曲塞等。順鉑作為dna烷化劑，與dna交聯(lián)后引起dna損傷并阻礙修復(fù)，觸發(fā)細(xì)胞死亡。在細(xì)胞質(zhì)中，水分子取代順鉑的含氯配體，形成的水化順鉑與內(nèi)源性親核物質(zhì)如蛋氨酸、還原型谷胱甘肽以及金屬硫蛋白等形成共價鍵，消耗細(xì)胞中的還原當(dāng)量，增加氧化應(yīng)激。然而與鱗狀細(xì)胞癌相比，nsclc的患者對順鉑的敏感性較低。在ii和iii期nsclc的治療中，以順鉑為基礎(chǔ)的輔助化療的絕對5年生存率為5.3％。多種機(jī)制引起順鉑的耐藥性是nsclc化療的重要障礙，因此需要更合理和全面的細(xì)胞模型幫助深入理解順鉑耐藥的靶點(diǎn)，以及準(zhǔn)確預(yù)測臨床反應(yīng)。

3、順鉑耐藥性的產(chǎn)生可能是由于藥物攝取減少、代謝周轉(zhuǎn)增加、促凋亡信號抑制和dna修復(fù)能力增強(qiáng)。既往研究表明，轉(zhuǎn)錄激活因子stat3轉(zhuǎn)錄水平的升高與nsclc化療耐藥細(xì)胞中凋亡的抑制相關(guān)。atp結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和肺耐藥相關(guān)蛋白(lrp)參與藥物遞送和藥物外排，在腫瘤多藥耐藥性的發(fā)展中起重要作用。銅膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ctr1的快速降解引起順鉑的流入減少，導(dǎo)致對藥物的耐受。順鉑與dna加合物阻斷dna的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致不同類型的dna損傷。對順鉑具有中度耐藥性的癌癥細(xì)胞表現(xiàn)出核苷酸切除修復(fù)因子水平的升高。轉(zhuǎn)錄因子nrf2介導(dǎo)控制細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)的基因轉(zhuǎn)錄，以對抗順鉑的有害影響。腫瘤周圍密集的細(xì)胞外基質(zhì)(ecm)作為生理屏障，限制了抗癌藥物向癌癥細(xì)胞的擴(kuò)散速率。因此，nsclc的順鉑抗性是一種復(fù)雜的生物現(xiàn)象，需要更符合生理進(jìn)程的細(xì)胞模型進(jìn)行理想生物標(biāo)志物的研究，由此識別效應(yīng)人群、預(yù)測治療結(jié)果以及探索多種藥物的聯(lián)合療法。

4、順鉑與其他藥物聯(lián)合使用被廣泛用于多種實(shí)體瘤，雖然高耐藥性的模型有助于理解腫瘤耐藥的可能機(jī)制，但臨床中的耐藥性通常發(fā)生在較低水平。既有研究表明，在臨床環(huán)境中的治療是以脈沖方式進(jìn)行，與親本細(xì)胞相比產(chǎn)生2-3倍的耐藥性?，F(xiàn)有技術(shù)將細(xì)胞持續(xù)暴露與高濃度藥物環(huán)境，產(chǎn)生高水平的耐藥性，但是不太適合作為研究實(shí)際臨床需求的細(xì)胞模型。此外，多種臨床前研究發(fā)現(xiàn)，順鉑與其他化療藥物存在交叉耐藥性，并且只有在低水平耐藥模型中的多藥耐藥性交叉較大，而在高水平耐藥性(超過10倍)的模型中交叉耐藥較小。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對以上現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明構(gòu)建出兩株對于順鉑的低水平耐藥細(xì)胞系，并已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心進(jìn)行保藏。與現(xiàn)有技術(shù)研究不同的是，本發(fā)明在構(gòu)建中采用低劑量、脈沖式接觸的方式進(jìn)行藥物暴露，能夠更好模擬臨床低水平耐藥性的產(chǎn)生。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明進(jìn)一步挖掘?qū)τ陧樸K具有較低水平耐藥的細(xì)胞具有的潛在的耐藥通路，對于臨床多藥耐藥的機(jī)制研究、耐藥靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)以及多藥聯(lián)合使用的應(yīng)用評估具有較好的研究前景和應(yīng)用價值。

2、鑒于此，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是非小細(xì)胞肺癌順鉑輕度耐藥細(xì)胞株，包括細(xì)胞株一，命名為人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株h1299-cisr?homo?sapiens，其保藏編號為cctcc?no：c202509，或/和細(xì)胞株二，命名為人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株h358-cisr?homo?sapiens，其保藏編號為cctcc?no：c202508。

3、進(jìn)一步，所述細(xì)胞株一包含1044個表達(dá)上調(diào)的基因和1859個表達(dá)下調(diào)的基因，所述細(xì)胞株二包含73個表達(dá)上調(diào)的基因和96個表達(dá)下調(diào)的基因。

4、更進(jìn)一步，所述細(xì)胞株一中，表達(dá)發(fā)生變化的基因集中在pi3k-akt信號通路、鈣信號通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、肌肉細(xì)胞骨架、局灶性粘附和細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用；所述細(xì)胞株二中，表達(dá)發(fā)生變化的基因集中在肌肉細(xì)胞骨架、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、軸突引導(dǎo)、局灶性粘附、癌癥轉(zhuǎn)錄失調(diào)和細(xì)胞粘附分子信號通路。

5、本發(fā)明還提供了所述非小細(xì)胞肺癌順鉑輕度耐藥細(xì)胞株在研究非小細(xì)胞肺癌耐藥機(jī)制中的應(yīng)用。

6、所述非小細(xì)胞肺癌順鉑輕度耐藥細(xì)胞株在評價藥物抗非小細(xì)胞肺癌活性中的應(yīng)用；

7、所述非小細(xì)胞肺癌順鉑輕度耐藥細(xì)胞株在篩選和開發(fā)治療非小細(xì)胞肺癌藥物中的應(yīng)用。

8、所述非小細(xì)胞肺癌順鉑輕度耐藥細(xì)胞株在制備非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞模型或制備非小細(xì)胞肺癌動物模型中的應(yīng)用。

9、所述非小細(xì)胞肺癌順鉑輕度耐藥細(xì)胞株在構(gòu)建人非小細(xì)胞肺癌體內(nèi)外順鉑輕度耐藥的腫瘤模型中的應(yīng)用。

10、本發(fā)明采用低劑量藥物暴露以及脈沖式藥物接觸的方式構(gòu)建兩株nsclc對順鉑耐藥的細(xì)胞株，能更好模擬臨床患者耐藥性進(jìn)展。細(xì)胞株構(gòu)建時間為6個月，得到的耐藥指數(shù)在1.5-5之間。

11、本發(fā)明提供了兩株順鉑低劑量耐受的細(xì)胞株的構(gòu)建方法及應(yīng)用，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)方案中不能完全模擬臨床肺癌順鉑治療中的耐藥性產(chǎn)生的技術(shù)問題，提供低成本和短周期的耐藥細(xì)胞構(gòu)建方案，提供研究順鉑低強(qiáng)度耐藥的細(xì)胞模型，以及提供耐藥性發(fā)生早期耐藥相關(guān)生物標(biāo)志物的檢測和信號通路的評估。兩株細(xì)胞株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學(xué)，細(xì)胞株名稱：人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株h1299-cisr?homosapiens，保藏編號cctcc?no：c202509；細(xì)胞株名稱：人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株h358-cisrhomo?sapiens，保藏編號cctcc?no：c202508。

12、本發(fā)明提供了上述耐藥細(xì)胞株在新藥合成和藥物分子庫篩選中的應(yīng)用。基于本發(fā)明得到的低劑量耐藥下變化的信號通路，設(shè)計(jì)特定的靶向藥物，在本發(fā)明的耐藥細(xì)胞株中檢測藥物毒性，篩選有效的候選藥物。本發(fā)明提供的細(xì)胞株有助于研究非小細(xì)胞肺癌對順鉑耐藥的分子機(jī)制，為優(yōu)化藥物組合和建立新型治療方法提供實(shí)驗(yàn)材料。

13、本發(fā)明揭示了低劑量耐藥條件下異常表達(dá)的蛋白和變化的信號通路，利用差異蛋白的靶向藥物或抑制劑處理耐藥細(xì)胞株，能為臨床耐藥早期或進(jìn)展中提供藥物篩選的細(xì)胞模型。本發(fā)明提供了基于耐藥細(xì)胞株在建立非小細(xì)胞肺癌耐藥動物模型的應(yīng)用。

14、本發(fā)明建立的細(xì)胞株可以穩(wěn)定傳代和復(fù)蘇，并且在多次傳代后仍然具有穩(wěn)定的耐藥性，可以用于皮下移植瘤、尾靜脈注射或原位種植的方式建立的人非小細(xì)胞肺癌動物模型。