本發(fā)明屬于植物病害生物防治領(lǐng)域，具體涉及一種靶向篩選生防菌的方法。

背景技術(shù)：

1、土傳病害是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中難以防治的病害之一，人工栽培的中藥材因種植年限長(zhǎng)、種植密度高、化肥施用量大等管理措施導(dǎo)致土傳病害頻發(fā)，產(chǎn)量和品質(zhì)大幅下降。其中人參、西洋參、三七、黃芪、當(dāng)歸等根類大宗中藥材的土傳病害尤為嚴(yán)重。中藥材的土傳病害主要包括根腐病、銹腐病、立枯病、疫病等，普遍存在多種病原微生物復(fù)合侵染的情況?；瘜W(xué)防治是目前防治方法的主流，雖然在短期內(nèi)效果顯著，但長(zhǎng)期施用會(huì)誘導(dǎo)病原菌產(chǎn)生抗藥性，農(nóng)殘超標(biāo)的現(xiàn)象極為普遍。采用生物防治技術(shù)不僅可以有效減少農(nóng)藥使用，有益微生物還可以改善土壤微生態(tài)環(huán)境，對(duì)病害起到持續(xù)的防控作用，很多真菌、細(xì)菌和放線菌，如哈茨木霉、枯草芽孢桿菌、多粘類芽孢桿菌等已被登記使用。

2、然而，絕大多數(shù)已發(fā)現(xiàn)的生防菌還在停留在實(shí)驗(yàn)室水平，真正投入生產(chǎn)應(yīng)用的很少。究其原因主要有兩方面，其一，來(lái)源于某個(gè)作物的生防菌，對(duì)其他作物病害的防治效果不夠理想，特別是能用于中藥材的有效生防菌極少。其二，目前常用的基于基因測(cè)序的土壤/植物微生物組學(xué)的方法，雖然可以獲取大量數(shù)據(jù)，但獲得生防菌實(shí)物仍然依賴培養(yǎng)基篩選的方法，而現(xiàn)有的篩選方法效率太低，難以在短時(shí)間內(nèi)獲得大量目標(biāo)菌株。

3、傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)生防菌的篩選主要采用稀釋平板法，可稱之為“兩步篩選”法。第一步將適當(dāng)濃度的土壤懸液均勻涂布在培養(yǎng)基平板上，一定溫度下培養(yǎng)，獲得單菌落；第二步將得到的菌落分別進(jìn)行純化后，使用平板對(duì)峙法篩選具有拮抗作用的生防菌，后續(xù)進(jìn)行種屬鑒定?！皟刹胶Y選”法在第一步雖然可以獲得大量菌株，但無(wú)法進(jìn)行功能判斷，必須通過第二步方能確定目標(biāo)菌。可見，應(yīng)用傳統(tǒng)篩選方法獲取生防菌的幾率非常低，且需要耗費(fèi)大量的時(shí)間和資源。

4、近年來(lái)，微生物組學(xué)技術(shù)被廣泛用于土壤微生物群落研究，雖然能夠獲得相關(guān)拮抗菌的信息，但不能獲得微生物實(shí)物。基于培養(yǎng)組學(xué)的微生物綜合培養(yǎng)方法，雖然能夠獲得種類豐富的菌落，但仍然無(wú)法判斷功能，且需要特定的儀器設(shè)備支持，成本較高。

5、因此，建立一種簡(jiǎn)便且適用于基層科研及農(nóng)技部門的生防菌快速篩選方法，可以大大提高篩選效率，降低成本。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、基于現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明提供了一種農(nóng)業(yè)生防菌的靶向快速篩選方法，該方法可以針對(duì)不同作物的多種病原菌進(jìn)行靶向篩選，獲得對(duì)靶標(biāo)菌具有拮抗作用的生防菌，克服了傳統(tǒng)篩選方法實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、效率低的缺點(diǎn)，顯著提高篩選速度，并通過不同培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)，得到更多種類的生防菌。

2、本發(fā)明的第一方面提供了一種靶向快速篩選生防菌的方法，該方法包括以下步驟：將疑似含有生防菌的樣本懸液涂布于固體培養(yǎng)基中，并且接種靶標(biāo)病原菌進(jìn)行共培養(yǎng)，靶向篩選生防菌。

3、在一些實(shí)施方式中，所述靶標(biāo)病原菌為植物病原真菌。

4、在一些實(shí)施方式中，所述樣本為土壤懸液或植物組織懸液。

5、在一些實(shí)施方式中，涂布樣本懸液后，接種靶標(biāo)病原菌至固體培養(yǎng)基中央。

6、接種靶標(biāo)病原菌后培養(yǎng)的時(shí)間根據(jù)靶標(biāo)病原菌的生長(zhǎng)速度決定。在一些實(shí)施方式中，所述共培養(yǎng)的時(shí)間為24h-240h。在一些具體實(shí)施方式中，所述共培養(yǎng)的時(shí)間為24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h、192h、216h、240h或它們之間的任意值。

7、在一些實(shí)施方式中，所述共培養(yǎng)的溫度為20-35℃，優(yōu)選為23-28℃。在一些具體實(shí)施方式中，所述共培養(yǎng)的溫度為20℃、23℃、25℃、28℃、30℃、33℃、35℃或它們之間的任意值。

8、在一些實(shí)施方式中，進(jìn)行所述共培養(yǎng)后，靶標(biāo)病原菌與與未涂布樣本懸液的對(duì)照相比若出現(xiàn)明顯的抑菌圈或抑菌帶，進(jìn)而抑制了靶標(biāo)病原菌的正常生長(zhǎng)，則初步篩選得到抑制所述靶標(biāo)病原菌生長(zhǎng)的候選生防菌。

9、本發(fā)明采用的靶向篩選方法將傳統(tǒng)的“兩步篩選”縮短為“一步篩選”。通過在固體培養(yǎng)基中進(jìn)行樣本懸液稀釋涂布的同時(shí)接種靶標(biāo)病原菌，待二者共培養(yǎng)后經(jīng)過觀察可以快速獲得對(duì)靶標(biāo)病原菌具有拮抗作用的生防菌，省去了對(duì)平板中生長(zhǎng)的所有微生物都進(jìn)行培養(yǎng)的步驟。

10、在一些實(shí)施方式中，將所述樣本懸液分別涂布于至少2種固體培養(yǎng)基中。

11、在一些實(shí)施方式中，所述至少2種固體培養(yǎng)基具有不同的營(yíng)養(yǎng)成分種類和/或營(yíng)養(yǎng)成分含量。

12、在一些實(shí)施方式中，所述固體培養(yǎng)基包括lbe固體培養(yǎng)基和r2d固體培養(yǎng)基。

13、本發(fā)明通過采用培養(yǎng)基組合進(jìn)行靶向篩選，能夠在節(jié)省實(shí)驗(yàn)周期的同時(shí)得到種類較為豐富的生防菌。優(yōu)選地，本發(fā)明通過lbe固體培養(yǎng)基和r2d固體培養(yǎng)基兩種培養(yǎng)基的配合使用，不僅節(jié)省了篩選周期，而且能夠同時(shí)獲取更多種類的農(nóng)業(yè)生防菌。

14、在一些實(shí)施方式中，所述lbe固體培養(yǎng)基包括5.0-15.0g胰蛋白胨、5.0-10.0gnacl、5.0-10.0g酵母提取物、15.0-20.0g瓊脂粉和1l水，優(yōu)選地，所述lbe固體培養(yǎng)基的ph為7.0-7.4。

15、在一些實(shí)施方式中，所述r2d固體培養(yǎng)基包括0.2-0.6g酸水解酪蛋白，0.3-0.5g酵母提取物，0.3-0.5g胰蛋白胨，0.2-0.6g可溶性淀粉，0.3-0.5g?k2hpo4，0.1-0.4g?mgso4，0.1-0.4g丙酮酸鈉，15.0-20.0g瓊脂粉和1l水，優(yōu)選地，所述r2d固體培養(yǎng)基的ph為6.8-7.2。

16、在一些實(shí)施方式中，所述方法還包括將篩選得到的候選生防菌進(jìn)行純化。

17、在一些實(shí)施方式中，所述方法還包括將篩選得到的候選生防菌進(jìn)行效果驗(yàn)證。

18、在一些實(shí)施方式中，所述效果驗(yàn)證采用平板對(duì)峙法進(jìn)行。

19、在一些實(shí)施方式中，所述方法還包括將篩選得到的生防菌進(jìn)行菌屬鑒定。

20、在一些實(shí)施方式中，所述菌屬鑒定采用形態(tài)學(xué)結(jié)合基因測(cè)序法進(jìn)行。

21、在一些實(shí)施方式中，所述純化包括將所述生防菌接種至lbe液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，然后使用平板劃線法將所述培養(yǎng)獲得的菌液進(jìn)行純化。在一些實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)的溫度為28-35℃，時(shí)間為6-24h，轉(zhuǎn)速為100-300rpm。

22、在一些實(shí)施方式中，所述方法還包括在接種靶標(biāo)病原菌之前，確定所述靶標(biāo)病原菌能夠在所述固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。

23、在一些實(shí)施方式中，所述靶標(biāo)病原菌包括尖孢鐮刀菌(fusarium?oxysporum)、茄病鐮刀菌(fusarium?solani)、立枯絲核菌(rhizoctonia?solani)、強(qiáng)壯土赤殼菌(ilyonectria?robusta)和新西蘭指赤殼菌(dactyonectria?novozelandica)中的至少一種。

24、在一些實(shí)施方式中，所述樣本懸液包括土壤懸液和/或植物組織懸液。

25、在一些實(shí)施方式中，所述樣本懸液包括糧食作物、經(jīng)濟(jì)作物或中藥材的土壤懸液。

26、在一些實(shí)施方式中，所述中藥材選自根莖類中藥材。

27、在一些實(shí)施方式中，所述中藥材選自人參、西洋參、三七、黃芪、蒼術(shù)、當(dāng)歸、黨參中的至少一種。

28、在一些實(shí)施方式中，所述糧食作物包括小麥、水稻、玉米、燕麥、黑麥和大麥等。

29、在一些實(shí)施方式中，所述經(jīng)濟(jì)作物包括蔬菜作物(西紅柿、茄子、辣椒、黃瓜等)、纖維作物(棉花、麻類等)、油料作物(花生、油菜、芝麻、大豆等)、糖料作物(甜菜、甘蔗等)、飲料作物(茶、咖啡等)、嗜好作物(煙草)、藥用作物(人參、三七、當(dāng)歸等)、熱帶作物(芒果、椰子、香蕉、菠蘿等)等。

30、在一些實(shí)施方式中，所述樣本懸液包括研磨的植物組織懸液。

31、在一些實(shí)施方式中，所述樣本懸液包括梯度稀釋的土壤懸液和/或梯度稀釋的植物組織懸液。

32、本發(fā)明的第二方面提供了根據(jù)第一方面所述的方法得到的生防菌。

33、在一些實(shí)施方式中，所述生防菌包括真菌、細(xì)菌和放線菌中的至少一種。

34、本發(fā)明的又第三方面提供了第一方面所述的方法或第二方面所述的生防菌在篩選農(nóng)業(yè)生防菌或防治農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的土傳病害中的應(yīng)用。

35、在一些實(shí)施方式中，所述土傳病害包括根腐病、莖基腐病、銹腐病、立枯病或疫病等。

36、在一些實(shí)施方式中，所述方法用于篩選糧食作物、經(jīng)濟(jì)作物、中藥材的生防菌。

37、在一些實(shí)施方式中，所述生防菌包括真菌、細(xì)菌和放線菌中的至少一種。

38、本發(fā)明將傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)生防菌的“兩步篩選”方法改為“一步篩選”方法，并通過使用培養(yǎng)基組合篩選的方式同時(shí)獲取更多種類的農(nóng)業(yè)生防菌。本發(fā)明縮短了農(nóng)業(yè)生防菌的篩選周期，為農(nóng)業(yè)生防菌的篩選工作節(jié)省了時(shí)間與資源，顯著降低了獲取農(nóng)業(yè)生防菌的難度，為快速獲得大量、多樣的農(nóng)業(yè)生防菌提供了新方法。