本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥、基因，尤其是一種ibv多表位重組質(zhì)粒pegfp-qsn、構(gòu)建方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、雞傳染性支氣管炎(infectious?bronchitis，ib)是一種由傳染性支氣管炎病毒(infectious?bronchitis?virus，ibv)引起的雞的呼吸道傳染病。ibv是γ冠狀病毒科的單股正鏈rna病毒，能夠感染不同日齡的雞，可能會(huì)導(dǎo)致雞的呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等產(chǎn)生不同程度的病理?yè)p傷，其中雛雞感染ibv后死亡率較高?？傊琲b帶給養(yǎng)禽業(yè)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

2、ibv具有高突變性，在不同的毒株疫苗之間交叉保護(hù)性低。目前市場(chǎng)上主要的ibv疫苗多為滅活疫苗或減毒疫苗，這些疫苗可能存在免疫效果不佳、毒力返強(qiáng)以及導(dǎo)致ibv毒株變異等缺陷。因此，亟需研制一種新型的、安全有效的ib疫苗。多表位dna疫苗通過篩選ibv的優(yōu)勢(shì)表位，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫和體液免疫，而且多表位dna疫苗集多種優(yōu)勢(shì)表位基因?yàn)橐惑w，承載量更高，不存在毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)。

3、s1蛋白是ibv侵染宿主細(xì)胞的關(guān)鍵抗原，且其具有極高的組織嗜性，可識(shí)別具有特異性受體的宿主細(xì)胞。同時(shí)，s1蛋白也負(fù)責(zé)ibv與宿主細(xì)胞的連接，阻斷病毒和宿主細(xì)胞的結(jié)合往往是防止病毒感染機(jī)體的重要途徑。n蛋白與病毒rna基因組有關(guān)，參與基因組的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄與翻譯?，F(xiàn)有研究表明，當(dāng)ibv感染細(xì)胞后，在ibv顆粒中的n蛋白磷酸化程度高于細(xì)胞裂解物中的磷酸化程度，這種修飾被表明可能會(huì)對(duì)ibv與細(xì)胞膜的關(guān)聯(lián)具有調(diào)節(jié)作用；另外，n蛋白在不同毒病株中具有高度的保守性，不同病株間的相似性為91.0-96.5％，可以作為識(shí)別病毒的重要靶標(biāo)。因此，本發(fā)明基于ibv?s1蛋白和n蛋白篩選優(yōu)勢(shì)t、b細(xì)胞表位，設(shè)計(jì)和篩選出新的表位肽，構(gòu)建ibv多表位重組質(zhì)粒pegfp-qsn，并評(píng)價(jià)其免疫效果。

4、通過檢索，尚未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明專利申請(qǐng)相關(guān)的專利公開文獻(xiàn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種ibv多表位重組質(zhì)粒pegfp-qsn、構(gòu)建方法及其應(yīng)用。

2、本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：

3、一種ibv多表位重組質(zhì)粒pegfp-qsn，所述重組質(zhì)粒是將新表位肽qsn基因構(gòu)建至真核表達(dá)載體pegfp-n1獲得；

4、其中，新表位肽qsn氨基酸序列為seq?id?no.13。

5、進(jìn)一步地，所述新表位肽qsn的核苷酸序列為seq?id?no.14。

6、進(jìn)一步地，所述新表位肽qsn包含雞傳染性支氣管炎病毒的刺突蛋白s1和核衣殼蛋白n的優(yōu)勢(shì)抗原表位，優(yōu)勢(shì)表位經(jīng)連接肽串聯(lián)，獲得新表位肽qsn。

7、進(jìn)一步地，所述刺突蛋白s1、核衣殼蛋白n包含優(yōu)勢(shì)毒性t細(xì)胞表位，其氨基酸序列依次為seq?id?no.1-4，刺突蛋白s1、核衣殼蛋白n包含優(yōu)勢(shì)輔助性t細(xì)胞表位，其氨基酸序列依次為seq?id?no.5-8，刺突蛋白s1、核衣殼蛋白n包含優(yōu)勢(shì)b細(xì)胞表位，其氨基酸序列依次為seq?id?no.9-12。

8、進(jìn)一步地，所述新表位蛋白qsn的特性為：具有親水性良好的非跨膜區(qū)蛋白；與tlr3和tlr7分子對(duì)接穩(wěn)定；免疫預(yù)測(cè)qsn蛋白可引起體液免疫和細(xì)胞免疫，刺激機(jī)體產(chǎn)生大量抗體igg和細(xì)胞因子ifn-γ和il-2。

9、進(jìn)一步地，所述重組質(zhì)粒pegfp-qsn轉(zhuǎn)染至真核細(xì)胞hek293t后，能夠表達(dá)出大小約為25kda的新表位蛋白qsn，且對(duì)hek293t細(xì)胞無(wú)明顯的毒性作用。

10、進(jìn)一步地，所述新表位肽qsn的獲得方法，包括如下步驟：

11、通過在線軟件對(duì)s1蛋白和n蛋白的優(yōu)勢(shì)t、b細(xì)胞表位基因序列進(jìn)行分析篩選，即利用在線數(shù)據(jù)庫(kù)abcpred預(yù)測(cè)高抗原性的b細(xì)胞表位，免疫表位數(shù)據(jù)庫(kù)iebd預(yù)測(cè)毒性t細(xì)胞表位和輔助t細(xì)胞表位；所述ibv?s1蛋白(genbankno.qga30450.1)和n蛋白(genbankno.wcg92571.1)優(yōu)勢(shì)表位包含的優(yōu)勢(shì)毒性t細(xì)胞表位氨基酸序列依次為seq?idno.1-4，優(yōu)勢(shì)輔助性t細(xì)胞表位氨基酸序列依次為seq?id?no.5-8，優(yōu)勢(shì)b細(xì)胞表位氨基酸序列依次為seq?id?no.9-12；基于刺突蛋白s1和核衣殼蛋白n的優(yōu)勢(shì)表位，通過連接肽gpgpg和gpls交替連接，命名為qsn；進(jìn)行qsn蛋白的跨膜區(qū)、親水性、磷酸化位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、殘基數(shù)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、分子對(duì)接和免疫模擬分析，篩選獲得最優(yōu)表位肽qsn。

12、如上所述的ibv多表位重組質(zhì)粒pegfp-qsn的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

13、合成qsn基因，并克隆至真核表達(dá)載體pegfp-n1的hindⅲ和ecor?i酶切位點(diǎn)之間；根據(jù)qsn基因序列，設(shè)計(jì)上游引物f：5’-aagcttatgttcgtggtgcagg-3’(下劃線為限制性酶切位點(diǎn)hindⅲ)，下游引物r：5’-gaattcggtggtgatggtggt-3’(下劃線為限制性酶切位點(diǎn)ecori)，通過雙酶切反應(yīng)及pcr反應(yīng)擴(kuò)增目的基因驗(yàn)證重組質(zhì)粒，雙酶切反應(yīng)體系：10×fastdigest?green?buffer?2μl，1μl的ecor?i，1μl的hindⅲ，1μg的dna模板，加入ddh2o補(bǔ)至20μl，37℃反應(yīng)15min，瓊脂凝膠電泳法檢測(cè)產(chǎn)物。pcr反應(yīng)體系為：2×pcr?taq?mix?buffer12.5μl，1μl的dna模板，上下游引物各1μl，ddh2o?9.5μl。條件如下：94℃預(yù)變性3min，{94℃變性30s；60℃退火30s；72℃延伸1min}30次，72℃總延伸5min。最終獲得重組質(zhì)粒pegfp-qsn。

14、如上所述的ibv多表位重組質(zhì)粒pegfp-qsn在制備預(yù)防雞傳染性支氣管炎的生物制品中的應(yīng)用。

15、本發(fā)明取得的優(yōu)點(diǎn)和積極效果為：

16、1、本發(fā)明基于ibv關(guān)鍵抗原s1蛋白和n蛋白篩選優(yōu)勢(shì)t、b細(xì)胞表位，設(shè)計(jì)和篩選出新的表位肽qsn。利用多表位抗原激發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)，產(chǎn)生涵蓋關(guān)鍵抗原決定簇的特異性抗ibv體液免疫和細(xì)胞免疫；同時(shí)，表位蛋白也減少了大蛋白表達(dá)困難的問題。另外，真核表達(dá)dna載體不存在毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)，也增加了其在雞傳染性支氣管炎疫苗生物制品中的應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)。

17、2、本發(fā)明對(duì)qsn蛋白的多表位肽進(jìn)行g(shù)pgpg和gpls交替連接，并進(jìn)行跨膜區(qū)、親水性、磷酸化位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、殘基數(shù)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、分子對(duì)接和免疫模擬分析，篩選出最優(yōu)的新表位肽qsn氨基酸序列，并根據(jù)雞源優(yōu)化獲得qsn核苷酸序列。經(jīng)生物信息學(xué)分析顯示，qsn是非跨膜區(qū)蛋白，親水性良好；三級(jí)結(jié)構(gòu)經(jīng)galaxyrefine優(yōu)化后，與tlr3和tlr7進(jìn)行對(duì)接；pdbepisa分析對(duì)接處顯示連接穩(wěn)定；c-immism結(jié)果顯示，qsn可引起體液免疫和細(xì)胞免疫，刺激機(jī)體產(chǎn)生大量抗體igg和細(xì)胞因子ifn-γ和il-2；為重組質(zhì)粒應(yīng)用于預(yù)防雞傳染性支氣管炎提供理論依據(jù)。

18、3、本發(fā)明構(gòu)建的重組質(zhì)粒pegfp-qsn可在真核細(xì)胞中表達(dá)出目的新表位蛋白qsn，且對(duì)真核細(xì)胞無(wú)明顯毒副作用，且重組質(zhì)粒在真核細(xì)胞中可表達(dá)出目的蛋白，免疫雛雞，可激發(fā)雞的特異性抗ibv的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，表明重組質(zhì)粒可用于免疫接種。

19、4、本發(fā)明的重組質(zhì)粒經(jīng)腿部肌肉注射免疫7日齡雛雞，加強(qiáng)免疫后，可激發(fā)雞的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。與pbs組和pegfp-n1組相比，加強(qiáng)免疫后兩周，pegfp-qsn組免疫雞血清中的igg含量極顯著升高(p<0.01)，pegfp-qsn組血清中細(xì)胞因子ifn-γ和il-2的含量均極顯著升高(p<0.01)；pegfp-qsn組cd4+的含量顯著高于(p<0.01)pbs組和pegfp-n1組。結(jié)果表明構(gòu)建的多表位重組質(zhì)pegfp-qsn能夠誘導(dǎo)雞的特異性抗ibv體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，可用于制備預(yù)防雞傳染性支氣管炎的生物制品中。