本發(fā)明涉及基因工程，尤其涉及一種病毒誘導的沉默梭梭基因的方法。

背景技術：

1、梭梭(haloxylon?ammodendron?(c.?a.?mey.)?bunge)是莧科梭梭屬的超旱生灌木或小喬木，高1～9米，又稱鹽木、瑣瑣樹、梭梭柴等。梭梭是沙漠地域中分布最廣的荒漠植物之一，具有耐高溫干旱、耐鹽堿、耐貧瘠、耐旱性強，對惡劣的沙漠環(huán)境有超強的適應性，是研究植物抗逆機制的理想材料，也是干旱區(qū)固沙造林面積最大的樹種，被稱為“沙漠衛(wèi)士”。梭梭木質堅硬，是良好的薪炭材，當年生同化枝粗蛋白含量高，營養(yǎng)豐富，是駱駝、羊等牲畜優(yōu)良的飼料，有“沙漠人參”之稱的名貴中藥材肉蓯蓉寄生在其根部。因此，梭梭具有重要的生態(tài)價值、飼用價值和經濟價值。

2、現(xiàn)有基因組研究方法中，病毒誘導的基因沉默（vigs）作為一種較為成熟的轉基因技術，廣泛應用于單子葉和雙子葉植物中，如番茄、煙草、棉花、辣椒、擬南芥、辣椒、馬鈴薯、玉米、小麥、矮牽牛等植物上，過病毒載體接種即可在當代植物體內實現(xiàn)對靶向基因的沉默。vigs最早用來解釋植物被病毒侵染后所導致的植物體的防御機制，而這種現(xiàn)象在植物體內普遍存在，vigs利用了植物固有的rna干擾和病毒免疫應答的機制。

3、關于梭梭穩(wěn)定再生體系和遺傳轉化體系建立，目前極少由文獻報道，若采用t-dna插入突變、rna干擾(rnai)、crispr/cas9系統(tǒng)對梭梭基因的功能進行研究，難度較大。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術問題在于針對上述現(xiàn)有技術的不足，提供一種病毒誘導的沉默梭梭基因的方法，通過vigs載體的構建、農桿菌轉化、制備轉染用菌液和病毒勻漿、侵染梭梭植株等步驟以煙草脆裂病毒（trv）作為病毒載體，建立梭梭沉默體系，病毒勻漿介導的基因沉默更快更高效，沉默后梭梭hacla1基因表達量顯著降低，該方法可在短時間內高效沉默植物的目的基因，操作簡便、高效，實驗周期短且成本低。

2、本發(fā)明提供一種病毒誘導的沉默梭梭基因的方法，包括以下步驟：

3、s1、vigs載體構建：

4、s11、提取梭梭總rna并反轉錄為cdna，以梭梭cdna為模板擴增含有核苷酸序列如seq?id?no:?1所示的hacla1片段；

5、s12、雙酶切制備ptrv2線性化載體；

6、s13、通過dna膠回收試劑盒回收目的片段hacla1和ptrv2線性化載體；

7、s14、重組目的片段hacla1和ptrv2線性化載體，得到重組產物連接重組反應液；

8、s15、重組產物反應液轉化dh5α大腸桿菌感受態(tài)細胞，得到重組載體ptrv2-hacla1；

9、s2、重組載體轉化農桿菌：提取ptrv1、ptrv2、ptrv2-hacla1質粒并將其分別轉入融化的gv3101農桿菌感受態(tài)中，篩選陽性克隆菌，得到ptrv1、ptrv2和ptrv2-hacla1的gv3101農桿菌菌株；

10、s3、侵染梭梭：

11、s31、制備轉染用菌液；

12、s32、利用煙草擴增病毒勻漿侵染梭梭。

13、根據(jù)本發(fā)明提供的一種病毒誘導的沉默梭梭基因的方法，s12中所述雙酶切的體系為：10×fastdigest緩沖液5?μl，ecorⅰ和kpn?i各1?μl，ptrv2空載體1?μl，用無菌水補充體積至20?μl，酶切條件為37℃?30?min。

14、根據(jù)本發(fā)明提供的一種病毒誘導的沉默梭梭基因的方法，s14中所述重組的反應體系共10?μl：2×uniclone?seamless?cloning?mix?5μl、線性化載體ptrv2?2μl、hacla1?3μl，在50?℃的溫度條件下反應30?min。

15、根據(jù)本發(fā)明提供的一種病毒誘導的沉默梭梭基因的方法，s15中所述重組產物通過大腸桿菌感受態(tài)細胞dh5α轉化的方法為：取大腸桿菌感受態(tài)細胞dh5α，加入s15中制備得到的連接重組反應液10?μl，輕弾混勻，并將其靜置于冰上30?min，靜置結束后，放置于42℃金屬浴中反應45?s后立即放置于冰上2?min，隨后加入700?μl滅過菌的無抗lb液體培養(yǎng)基，后置于37?℃培養(yǎng)箱中，220?rpm轉速下復蘇1?h，再吸取100?μl涂布至硫酸卡那霉素50?μg/ml抗性的lb固體培養(yǎng)基上，37℃的培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。

16、根據(jù)本發(fā)明提供的一種病毒誘導的沉默梭梭基因的方法，s31中所述制備轉染用菌液包括以下步驟：

17、s311、活化：將s2中制備得到的ptrv1、ptrv2和ptrv2-hacla1的gv3101農桿菌菌株于yeb固體培養(yǎng)基劃線，得到活化后的農桿菌；

18、s312、小搖菌種：挑取活化后農桿菌單克隆于1?ml?yeb液體培養(yǎng)基中，28℃搖床180?rpm過夜培養(yǎng)；

19、s313、大搖菌種：轉移100?μl?s312中培養(yǎng)的農桿菌菌液至10?ml?yeb液體培養(yǎng)基中，在28°c，180?rpm的條件下培養(yǎng)至od600=0.7～1.2；

20、s314、處理菌種：將s313制備得到的產物在5000?rpm下離心10?min，棄上清液富集菌落，加入重懸液重懸富集菌落至od600=0.6～0.8，室溫靜止2～3?h，將ptrv1分別和ptrv2、ptrv2-hacla1按照1:1的比例進行等體積混合，獲得轉染用菌液。

21、根據(jù)本發(fā)明提供的一種病毒誘導的沉默梭梭基因的方法，s311中所述yeb固體培養(yǎng)基和s312、s313中所述yeb液體培養(yǎng)基中均加入了50?μg/ml的利福平以及50?μg/ml的硫酸卡那霉素。

22、根據(jù)本發(fā)明提供的一種病毒誘導的沉默梭梭基因的方法，s314中所述重懸液由ms液體培養(yǎng)基、10?mmol/l?mgcl2、10?mmol/l?mes以及150?μmol/l?as混合均勻得到。

23、根據(jù)本發(fā)明提供的一種病毒誘導的沉默梭梭基因的方法，s32中所述利用煙草擴增病毒勻漿侵染梭梭的方法為：通過煙草葉片上的傷口緩慢注入s31中制備得到的轉染用菌液，并培養(yǎng)7?d后，稱取1?g煙草葉片，將葉片剪碎放入滅菌研缽中，然后加入1ml的ph值為7.2濃度為0.2?mmol/l磷酸鈉鹽緩沖液，在研缽中將煙草葉片研磨成液體均漿，并經過濾后得到病毒液，將病毒液用無菌水按1:40的比例稀釋成病毒侵染液，將四周齡梭梭植株侵泡在病毒侵染液里黑暗環(huán)境中共培養(yǎng)48?h，溫度維持在22～24?℃，后轉移至培養(yǎng)箱中觀察梭梭植株表型

24、本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有以下優(yōu)點：

25、本發(fā)明提供一種病毒誘導的沉默梭梭基因的方法，該方法包括：vigs載體的構建、農桿菌轉化以及制備轉染用菌液和病毒勻漿侵染梭梭植株等步驟。本發(fā)明中，以煙草脆裂病毒作為病毒載體，建立梭梭沉默體系，結果證明應用轉染用菌液和病毒勻漿侵染梭梭植株，均可以得到基因沉默表型，但病毒勻漿介導的基因沉默更快更高效，同時qpcr檢測梭梭hacla1基因表達量，和對照組比較，沉默后梭梭hacla1基因表達量顯著降低。本發(fā)明首次將vigs基因沉默技術在梭梭中實際應用，建立了一套高效的梭梭基因沉默體系，可在短時間內高效沉默植物的目的基因，操作簡便、高效，實驗周期短且成本低。