本說明書涉及基因工程，特別涉及一種發(fā)酵生產(chǎn)l-亮氨酸和l-異亮氨酸的方法，該方法包括谷氨酸棒桿菌在l-亮氨酸和l-異亮氨酸發(fā)酵中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、支鏈氨基酸(bcaas，包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸)作為運動營養(yǎng)和健康領(lǐng)域的重要成分，近年來發(fā)展迅速，應(yīng)用場景不斷拓展，但其市場和技術(shù)也面臨一些挑戰(zhàn)。隨著全球市場不斷擴張，2023年全球bcaas市場規(guī)模已超過10億美元，年復(fù)合增長率(cagr)約8％-10％，主要受運動營養(yǎng)、健康食品和醫(yī)療應(yīng)用的驅(qū)動。bcaas作為抗疲勞、促恢復(fù)的補劑，廣泛用于健身人群和運動員，尤其在力量訓(xùn)練、耐力運動中；另外有研究表明bcaas在改善胰島素抵抗(糖尿病)和肝病輔助治療中的潛力；bcaas飲料、功能性零食等產(chǎn)品，逐漸被廣大群眾認(rèn)可，并應(yīng)用在日常鍛煉中。

2、bcaas的發(fā)酵生產(chǎn)菌株主要包括谷氨酸棒桿菌、黃色短桿菌以及大腸工程菌等，傳統(tǒng)菌株產(chǎn)酸低，雜酸高，并且效率低，并逐漸被代謝工程改造菌株取代；隨著菌株的不斷改良，其工藝也需要不斷優(yōu)化。但目前bcaas發(fā)酵過程中使用的物料與工藝匹配度并不完善，進(jìn)而導(dǎo)致大部分優(yōu)良菌株由于沒有匹配的發(fā)酵工藝導(dǎo)致產(chǎn)酸偏低的現(xiàn)象。

3、因此，有必要提供一種重組菌的發(fā)酵方法，以提高支鏈氨基酸產(chǎn)量，降低雜酸，提高糖酸轉(zhuǎn)化比。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本說明書一個或多個實施例提供一種l-亮氨酸與l-異亮氨酸的發(fā)酵方法。該方法使用至少一種l-亮氨酸或者l-異亮氨酸的生產(chǎn)菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；該方法在物料上選擇了相對廉價的糖蜜，其具有豐富的碳氮源，摒棄了雜質(zhì)較多的玉米漿，并且通過酶解將糖蜜轉(zhuǎn)化為一種含有更多可被菌株利用的碳氮源營養(yǎng)物質(zhì)；另外為了控制發(fā)酵液中的碳氮源配比，選擇了更加精準(zhǔn)的補料工藝，不僅可以保障菌株的發(fā)酵需求，并且可以有效避免發(fā)酵液氮源過高和過低，進(jìn)而達(dá)到增加產(chǎn)量、糖酸轉(zhuǎn)化率，降低雜酸副產(chǎn)的目的。

2、本說明書一個或多個實施例之一提供了一種發(fā)酵生產(chǎn)l-亮氨酸的方法，所述方法包括：利用谷氨酸棒桿菌進(jìn)行l(wèi)-亮氨酸發(fā)酵生產(chǎn)，所述谷氨酸棒桿菌包括ibbh-15、ibclq-257和ibclq-257e中的至少一種；在l-亮氨酸發(fā)酵過程中，通過調(diào)控營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)的方式增加l-亮氨酸的產(chǎn)生；所述營養(yǎng)物質(zhì)包括糖蜜酶解液。

3、在一些實施例中，所述糖蜜酶解液通過向糖蜜中添加蔗糖酶和/或蛋白酶進(jìn)行酶解獲得；所述糖蜜包括甜菜糖蜜和蔗糖糖蜜中的至少一種。

4、在一些實施例中，所述糖蜜酶解液通過向糖蜜中添加蔗糖酶和/或蛋白酶，在ph4.5-6.0、溫度45-60℃條件下酶解2-6小時獲得。

5、在一些實施例中，所述在l-亮氨酸發(fā)酵過程中，通過調(diào)控營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)的方式增加l-亮氨酸的產(chǎn)生，包括：在l-亮氨酸發(fā)酵過程中，按照6：1-10：1的比例流加補料糖和所述糖蜜酶解液控制殘?zhí)恰?/p>

6、在一些實施例中，在流加所述補料糖和所述糖蜜酶解液時，二者濃度保持一致。

7、在一些實施例中，所述方法還包括：在所述l-亮氨酸發(fā)酵過程中，待殘?zhí)窍陆抵?wt％后，開始流加補料糖和糖蜜酶解液，控制殘?zhí)窃?-3wt％。

8、在一些實施例中，所述方法還包括：在發(fā)酵培養(yǎng)補料階段，為了控制殘?zhí)窃?.5-2.5wt％時開始流加補充濃度為40-50wt％的葡萄糖溶液和濃度為40-50wt％的糖蜜酶解液，控制所述葡萄糖溶液和所述糖蜜酶解液的流速比例為6:1-10:1，所述糖蜜酶解液占發(fā)酵培養(yǎng)基的比例為2.5-3.5wt％。

9、在一些實施例中，在所述l-亮氨酸發(fā)酵過程中，種子培養(yǎng)基中包括初始濃度為2.5-3.5wt％的葡萄糖和初始濃度為1-2wt％的糖蜜酶解液。

10、在一些實施例中，在所述l-亮氨酸發(fā)酵過程中，發(fā)酵培養(yǎng)基中包括初始濃度為3.5-4.5wt％的葡萄糖和濃度為0.5-1.1wt％的糖蜜酶解液，所述糖蜜酶解液選擇甜菜糖蜜酶解液和蔗糖糖蜜酶解液中的至少一種，所述糖蜜酶解液至少被蔗糖酶或者蛋白酶中一種酶解。

11、在一些實施例中，所述方法還包括：在l-亮氨酸發(fā)酵過程中，初始ph?6.7，交替調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速和通氣保持溶氧在5-10％；菌體od562增長到20后ph提高至6.9，菌體od562增長到30后ph提高至7.1；菌體od562增長到40后ph提高至7.2。

12、本說明書一個或多個實施例之一提供了一種發(fā)酵生產(chǎn)l-異亮氨酸的方法，所述方法包括：利用谷氨酸棒桿菌進(jìn)行l(wèi)-異亮氨酸發(fā)酵生產(chǎn)，所述谷氨酸棒桿菌包括bcil-253、ibcl-1(ibcl-01)和ibcil-253k中的至少一種；在l-異亮氨酸發(fā)酵過程中，通過調(diào)控營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)的方式增加l-異亮氨酸的產(chǎn)生；所述營養(yǎng)物質(zhì)包括糖蜜酶解液。

13、在一些實施例中，所述糖蜜酶解液通過向糖蜜中添加蔗糖酶和/或蛋白酶進(jìn)行酶解獲得；所述糖蜜包括甜菜糖蜜和蔗糖糖蜜中的至少一種。

14、在一些實施例中，所述糖蜜酶解液通過向糖蜜中添加蔗糖酶和/或蛋白酶，在ph4.5-6.0、溫度45-60℃條件下酶解2-6小時獲得。

15、在一些實施例中，所述在l-異亮氨酸發(fā)酵過程中，通過調(diào)控營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)的方式增加l-異亮氨酸的產(chǎn)生，包括：在l-異亮氨酸發(fā)酵過程中，按照4：1-7：1的比例流加補料糖和所述糖蜜酶解液控制殘?zhí)恰?/p>

16、在一些實施例中，在流加所述補料糖和所述糖蜜酶解液時，二者濃度保持一致。

17、在一些實施例中，所述方法還包括：在l-異亮氨酸發(fā)酵過程中，當(dāng)殘?zhí)墙抵?.5-6.5wt％時開始流加無機鹽補料液，控制發(fā)酵液滲透壓在690-710mosm/l；當(dāng)殘?zhí)堑陀跉執(zhí)墙抵?.5-2.5wt％時開始流加補料糖和糖蜜酶解液控制殘?zhí)窃?.5-2.5wt％。

18、在一些實施例中，所述方法還包括：當(dāng)殘?zhí)墙抵?.5-2.5wt％時開始流加補充a液和b液，控制所述a液和所述b液的流速比例為4：1-7：1，所述糖蜜酶解液占發(fā)酵培養(yǎng)基的比例為3.5-4.5wt％，同時繼續(xù)流加無機鹽補料液控制發(fā)酵液滲透壓在890-910mosm/l；所述a液包括濃度為40-50wt％的葡萄糖溶液、濃度為0.1wt％的磷酸二氫鉀溶液以及濃度為0.05wt％的硫酸鎂溶液，所述b液包括濃度為40-50wt％的糖蜜酶解液。

19、在一些實施例中，在所述l-異亮氨酸發(fā)酵過程中，種子培養(yǎng)基中包括初始濃度為4.5-5.5wt％的葡萄糖和初始濃度為2.5-3.5wt％的糖蜜酶解液。

20、在一些實施例中，在所述l-異亮氨酸發(fā)酵過程中，發(fā)酵培養(yǎng)基中包括初始濃度為9.5-10.5wt％的葡萄糖和濃度為1.5-2.5wt％的糖蜜酶解液，所述糖蜜酶解液選擇甜菜糖蜜酶解液和蔗糖糖蜜酶解液中的至少一種，所述糖蜜酶解液至少被蔗糖酶或者蛋白酶中一種酶解。

21、在一些實施例中，所述l-異亮氨酸的發(fā)酵過程中初始發(fā)酵溫度30℃，ph6.8，發(fā)酵過程中不斷調(diào)整通氣與轉(zhuǎn)速控制溶氧在8-12％，待發(fā)酵液中菌種od562生長至38-42，ph調(diào)至6.9-7.1。