本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和生物工程，，具體涉及探究一種影響單增李斯特菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的srna及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、單核細(xì)胞增多性李斯特菌(listeria?monocytogenes,l.monocytogenes)在土壤、水體、食品及環(huán)境中均有廣泛分布，其中肉制品、乳制品及水產(chǎn)品的污染程度最高。單核細(xì)胞增多性李斯特菌(單增李斯特菌)具有較強(qiáng)的生存能力，在0～45℃條件下均可生長，甚至在零下低溫條件下反復(fù)凍融后仍可存活。對逆境具有較強(qiáng)的抵抗能力，能夠耐受酸堿、低溫、干燥、高滲等不利條件。單增李斯特菌是國標(biāo)gb29921-2013《食品中致病菌限量》標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定不能檢出的致病微生物之一。單增李斯特菌對人具有較強(qiáng)的感染能力，一旦感染后會(huì)造成90％的住院率和20％以上的死亡率，新生兒病死率達(dá)到50％以上。單增李斯特菌通過感染的食物進(jìn)入宿主腸道，在內(nèi)化素(inla和inlb)的作用下，識別小腸上受體細(xì)胞，進(jìn)而被細(xì)胞膜包裹形成吞噬泡。吞噬泡與溶酶體結(jié)合使吞噬泡內(nèi)部環(huán)境迅速酸化促進(jìn)菌體降解，90％以上的細(xì)菌會(huì)被吞噬泡內(nèi)的酶酸化降解。存活下來的單增李斯特菌在溶血素(llo)和磷脂酰肌醇特異性磷脂酶c(pi-plc)的作用下裂解吞噬體膜從而逃出吞噬泡。逃出的單增李斯特菌吸收宿主細(xì)胞的營養(yǎng)進(jìn)行增殖。肌動(dòng)蛋白聚合蛋白(acta)聚集宿主細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白形成慧尾，從而進(jìn)行運(yùn)動(dòng)。這為單增李斯特菌在細(xì)胞間的傳播提供了條件，在這種作用下使得單增李斯特菌從一個(gè)宿主細(xì)胞穿越到另一個(gè)宿主細(xì)胞，形成了雙層膜結(jié)構(gòu)的二級吞噬泡。在llo和廣譜磷脂酶(pc-plc)的作用下使吞噬泡膜失去穩(wěn)定性，使得單增李斯特菌快速進(jìn)入到胞漿生長繁殖。正是由于單增李斯特菌胞內(nèi)寄生和胞間傳播的特性，減毒后可作為疫苗載體用于臨床試驗(yàn)。單增李斯特菌中是否存在其他與毒力相關(guān)的調(diào)控因子尚不清晰，且致病機(jī)制需要更深入的探究，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)單增李斯特菌有效防治及精準(zhǔn)應(yīng)用。

2、srna作為一類調(diào)控元件在轉(zhuǎn)錄后水平對單增李斯特菌相關(guān)基因進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控，對毒力、耐脅迫能力及生物被膜等生理活動(dòng)產(chǎn)生廣泛調(diào)控。srna的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在生物被膜發(fā)育的不同階段都發(fā)揮著重要作用，引導(dǎo)游離浮游細(xì)胞切換到生物膜模式。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明闡明一種srna?ssrs可以作為生物被膜的調(diào)控靶點(diǎn)，通過干擾群體感應(yīng)系統(tǒng)影響單增李斯特菌生物被膜的形成。該srna?ssrs基因缺失后能夠增強(qiáng)單增李斯特菌對消毒劑的敏感性，該srna可以作為新的靶點(diǎn)用于應(yīng)對單增李斯特菌的威脅。

2、本發(fā)明目的通過如下手段獲得：

3、第一方面，本發(fā)明保護(hù)一種單增李斯特菌菌株srna?ssrs，所述srna?ssrs的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

4、第二方面，本發(fā)明保護(hù)前文所述的srna?ssrs在降低單增李斯特菌群體感應(yīng)關(guān)鍵基因啟動(dòng)子活性中的應(yīng)用。

5、第三方面，本發(fā)明保護(hù)前文所述的srna?ssrs在制備降低單增李斯特菌群體感應(yīng)關(guān)鍵基因啟動(dòng)子活性的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

6、第四方面，本發(fā)明保護(hù)前文所述的srna?ssrs在降低單增李斯特菌被膜形成中的應(yīng)用。

7、第五方面，本發(fā)明保護(hù)前文所述的srna?ssrs在制備降低單增李斯特菌被膜形成的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

8、在具體的實(shí)施方案中，所述降低單增李斯特菌被膜形成的產(chǎn)品可以為抑制單增李斯特菌被膜的抑制劑。

9、在具體的實(shí)施方案中，所述單增李斯特菌為單增李斯特菌lmb33426。第六方面，本發(fā)明提供一種單增李斯特菌基因缺失株的構(gòu)建方法，該方法包括如下步驟：

10、(1)設(shè)計(jì)引物對ssrs-uf、ssrs-ur和ssrs-df、ssrs-dr，以單增李斯特菌lmb?33426的基因組dna為模板，分別擴(kuò)增上游基因片段和下游基因片段；采用ssrs-uf和ssrs-dr重疊延伸，將上下游片段進(jìn)行融合；

11、(2)設(shè)計(jì)引物對pksv7-f和pksv7-r，以pksv7質(zhì)粒dna為模板，pcr擴(kuò)增線性的pksv7載體；

12、(3)用重組酶分別將步驟(1)和步驟(2)中的融合片段和線性的pksv7線性載體進(jìn)行連接，最后得到重組整合質(zhì)粒pksv7-ssrs；

13、(4)將重組質(zhì)粒pksv7-ssrs轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，擴(kuò)增質(zhì)粒；通過質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入單增李斯特菌感受態(tài)細(xì)胞；通過同源重組，將重組質(zhì)粒pksv7-ssrs上的同源片段替換到單增李斯特菌基因組上，抗性篩選得到srna基因缺失株lm-δssrs。

14、在具體的實(shí)施方案中，所述步驟(1)和步驟(2)中的引物序列如下：

15、ssrs-uf：如seq?id?no.2所示；ssrs-ur：如seq?id?no.3所示；

16、ssrs-df：如seq?id?no.4所示；ssrs-dr：如seq?id?no.5所示；

17、pksv7-f：如seq?id?no.6所示；pksv7-r：如seq?id?no.7所示。

18、第七方面，本發(fā)明保護(hù)一種群體感應(yīng)系統(tǒng)關(guān)鍵基因動(dòng)子融合egfp重組質(zhì)粒，所述重組質(zhì)粒中含有單增李斯特菌群體感應(yīng)關(guān)鍵基因啟動(dòng)子以及綠色熒光蛋白egfp，更具體的，所述啟動(dòng)子為p2啟動(dòng)子或pluxs啟動(dòng)子。

19、所述重組質(zhì)粒為重組質(zhì)粒pel-p2和/或重組質(zhì)粒pel-pluxs。

20、本發(fā)明構(gòu)建的重組質(zhì)粒作為熒光報(bào)告質(zhì)粒，能夠在單增李斯特菌中產(chǎn)生綠色熒光蛋白，在啟動(dòng)子作用下能夠具有較高的熒光強(qiáng)度。

21、第八方面，本發(fā)明保護(hù)前述群體感應(yīng)系統(tǒng)關(guān)鍵基因動(dòng)子融合egfp重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法，該方法包括如下步驟：

22、(1)設(shè)計(jì)引物對pksv7-f和pksv7-r，以pksv7質(zhì)粒dna為模板，pcr擴(kuò)增線性的pksv7載體；

23、(2)設(shè)計(jì)引物對egfp-f和egfp-r，以pet28a質(zhì)粒為模板，通過pcr擴(kuò)增，使用fastpure?gel?dna?extraction?mini?kit(vazyme)純化pcr產(chǎn)物，獲得egfp基因片段；

24、(3)設(shè)計(jì)引物對p2-f、p2-r和pluxs-f、pluxs-r以單增李斯特菌lmb?33426基因組為模板，通過pcr擴(kuò)增，獲得啟動(dòng)子基因片段；

25、(4)采用重疊延伸pcr將步驟(2)和步驟(3)中兩個(gè)片段進(jìn)行融合，所用引物分別為p2-f和egfp-r以及pluxs-f和egfp-r，獲得群體感應(yīng)系統(tǒng)關(guān)鍵基因啟動(dòng)子融合egfp片段；

26、(5)用重組酶分別將步驟(4)中的融合片段和步驟(1)中的線性載體進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pel-p2和pel-pluxs；

27、(6)將重組質(zhì)粒pel-p2和pel-pluxs轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，擴(kuò)增提取質(zhì)粒，篩選即可。

28、在具體的實(shí)施方案中，上述構(gòu)建方法中使用的引物對序列如下：

29、pksv7-f：如seq?id?no.6所示；pksv7-r：如seq?id?no.7所示；

30、egfp-f：如seq?id?no.8所示；egfp-r：如seq?id?no.9所示；

31、p2-f：如seq?id?no.10所示；p2-r：如seq?id?no.11所示；

32、pluxs-f：如seq?id?no.12所示pluxs-r：如seq?id?no.13所示。

33、第九方面，本發(fā)明還保護(hù)前文所述的重組質(zhì)粒在探究srna調(diào)控群體感應(yīng)系統(tǒng)中的應(yīng)用。

34、第十方面，本發(fā)明保護(hù)一種探究srna調(diào)控群體感應(yīng)系統(tǒng)的方法，將前文所述的重組質(zhì)粒導(dǎo)入單增李斯特菌野生型和/或srna基因缺失株，再結(jié)合熒光測定來實(shí)現(xiàn)。

35、本發(fā)明針對上述獲得的srna?ssrs基因缺失株測定生物被膜形成能力，并通過獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入單增李斯特菌野生型及srna?ssrs基因缺失株，測定在單增李斯特菌中的熒光強(qiáng)度，測定對群體感應(yīng)關(guān)鍵基因啟動(dòng)子的活性影響，以及評估srna?ssrs作為控制控制單增李斯特菌生物被膜形成的靶點(diǎn)的潛力。

36、有益效果

37、本發(fā)明闡述了srna?ssrs的二級結(jié)構(gòu)，通過構(gòu)建群體感應(yīng)系統(tǒng)熒光報(bào)告質(zhì)粒發(fā)現(xiàn)，srna?ssrs可以通過與群體感應(yīng)關(guān)鍵基因的啟動(dòng)子區(qū)域不完全互補(bǔ)配對，從而對群體感應(yīng)中的關(guān)鍵基因產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響生物被膜的形成及粘附作用。

38、研究證明，srna?ssrs可以作為單增李斯特菌生物被膜控制的靶點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)減少單增李斯特菌及其生物被膜的威脅，為開發(fā)新的抑制劑奠定理論基礎(chǔ)。