本發(fā)明屬于生物，具體涉及基因工程菌及其在生物法制備木糖醇中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、木糖醇（分子式c5h12o5）是一種甜味劑，甜度相當(dāng)于蔗糖，熱量相當(dāng)于葡萄糖，在2004年被美國(guó)能源部評(píng)為12個(gè)最具有應(yīng)用前景的生物質(zhì)基礎(chǔ)化學(xué)品。目前工業(yè)上普遍采用化學(xué)法制備木糖醇，首先通過(guò)復(fù)雜的分離工藝將純木糖從半纖維素水解液中分離出來(lái)，再經(jīng)過(guò)高壓加氫將木糖還原為木糖醇。由于化學(xué)法制備木糖醇生產(chǎn)工藝相對(duì)復(fù)雜，成本較高，導(dǎo)致木糖醇價(jià)格長(zhǎng)期居高不下。生物法生產(chǎn)木糖醇與化學(xué)法相比，具有一些優(yōu)勢(shì)：催化條件溫和、操作安全、設(shè)備能耗低等，因此近年來(lái)受到業(yè)界關(guān)注并有望成為化學(xué)法的替代工藝。生物法制備木糖醇可以利用生物酶或微生物細(xì)胞將半纖維素水解液中的木糖直接轉(zhuǎn)化成木糖醇，再進(jìn)行分離獲得木糖醇產(chǎn)品。

2、在現(xiàn)有的生物法制備木糖醇過(guò)程中木糖還原酶是關(guān)鍵酶，野生型木糖還原酶通常專(zhuān)一性很差，以半纖維素水解液進(jìn)行生物法制備時(shí)，木糖還原酶在催化木糖還原為木糖醇的同時(shí)，還會(huì)將半纖維素水解液中的阿拉伯糖還原為阿拉伯糖醇。阿拉伯糖醇結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)與木糖醇極為相似，導(dǎo)致副產(chǎn)物阿拉伯糖醇影響了木糖醇的分離精制。近年來(lái)，不少研究通過(guò)挖掘新型木糖還原酶以及木糖還原酶的分子改造等手段來(lái)提高木糖還原酶的專(zhuān)一性，研究取得了一定效果但仍然無(wú)法完全消除木糖還原酶對(duì)阿拉伯糖的催化活力。

3、半纖維素作為自然界中儲(chǔ)量豐富的可再生資源，廣泛存在于農(nóng)林廢棄物（如玉米芯、甘蔗渣等）中，其水解液中的木糖是微生物發(fā)酵制備木糖醇的理想原料，但是在半纖維素水解液中也存在一定量的阿拉伯糖，在制備木糖醇時(shí)，很難消除副產(chǎn)物阿拉伯糖醇。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)于通過(guò)半纖維素水解液制備木糖醇過(guò)程中存在副產(chǎn)物的問(wèn)題，本發(fā)明提供了基因工程菌及其在生物法制備木糖醇中的應(yīng)用，具體技術(shù)方案如下：

2、第一方面，本發(fā)明提供了一種基因工程菌，包括宿主細(xì)胞以及插入宿主細(xì)胞的功能基因，其特征在于，所述功能基因包括：cre/ loxp系統(tǒng)、茶堿開(kāi)關(guān)基因和目的基因表達(dá)元件；

3、所述目的基因表達(dá)元件包括啟動(dòng)子、木糖還原酶基因和阿拉伯糖-1-脫氫酶基因；所述啟動(dòng)子具有啟動(dòng)阿拉伯糖-1-脫氫酶基因、木糖還原酶基因轉(zhuǎn)錄的能力；所述阿拉伯糖-1-脫氫酶基因連接于啟動(dòng)子下游；所述木糖還原酶基因連接于啟動(dòng)子上游且起始密碼子端靠近啟動(dòng)子；

4、所述cre/ loxp系統(tǒng)具有翻轉(zhuǎn)待編輯序列的功能；所述待編輯序列為所述目的基因表達(dá)元件中的啟動(dòng)子；所述茶堿開(kāi)關(guān)基因受茶堿誘導(dǎo)調(diào)控cre重組酶基因的表達(dá)。

5、本技術(shù)提供了一種可以將含阿拉伯糖與木糖的底物進(jìn)行催化，在不產(chǎn)生阿拉伯糖醇的情況下生產(chǎn)木糖醇的基因工程菌，所述基因工程菌中，木糖還原酶（xr）基因和阿拉伯糖-1-脫氫酶（aradh）基因通過(guò)同一個(gè)啟動(dòng)子進(jìn)行表達(dá)調(diào)控，阿拉伯糖-1-脫氫酶基因連接于啟動(dòng)子下游，木糖還原酶基因連接于啟動(dòng)子上游且起始密碼子端靠近啟動(dòng)子，通過(guò)在基因組上對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行翻轉(zhuǎn)，使啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)對(duì)兩種酶基因的表達(dá)調(diào)控。

6、本技術(shù)使用cre/ loxp系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)對(duì)啟動(dòng)子的翻轉(zhuǎn)，在cre/ loxp系統(tǒng)中，cre重組酶可以與 loxp位點(diǎn)特異性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)于 loxp位點(diǎn)之間待編輯序列的翻轉(zhuǎn)，在本技術(shù)中，所述待編輯序列為啟動(dòng)子，在cre重組酶將啟動(dòng)子基因翻轉(zhuǎn)之前，基因工程菌表達(dá)啟動(dòng)子下游的阿拉伯糖-1-脫氫酶基因，cre重組酶將啟動(dòng)子基因翻轉(zhuǎn)之后，基因工程菌表達(dá)啟動(dòng)子上游的木糖還原酶基因。

7、本技術(shù)中，為了控制兩種酶基因的表達(dá)，選擇對(duì)cre重組酶的表達(dá)進(jìn)行控制，具體是通過(guò)在cre重組酶基因中加入茶堿開(kāi)關(guān)基因，所述茶堿開(kāi)關(guān)是一種茶堿誘導(dǎo)型的基因開(kāi)關(guān)，可以控制其插入的基因的表達(dá)，再加入茶堿誘導(dǎo)之前，cre重組酶基因不表達(dá)，加入茶堿誘導(dǎo)可以使cre重組酶基因表達(dá)。

8、因此，本技術(shù)中，最終構(gòu)建得到的基因工程菌，其初始表達(dá)產(chǎn)物為阿拉伯糖-1-脫氫酶，在受到茶堿誘導(dǎo)后，cre重組酶基因表達(dá)，cre重組酶與 loxp位點(diǎn)結(jié)合后將啟動(dòng)子翻轉(zhuǎn)，所述基因工程菌的表達(dá)產(chǎn)物變?yōu)槟咎沁€原酶。

9、進(jìn)一步地，所述啟動(dòng)子為pj23119或plac。

10、進(jìn)一步地，所述阿拉伯糖-1-脫氫酶基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

11、進(jìn)一步地，所述木糖還原酶基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

12、本技術(shù)中，對(duì)于木糖還原酶基因、阿拉伯糖-1-脫氫酶基因、啟動(dòng)子的組合進(jìn)行了篩選，得到了對(duì)于木糖還原酶基因、阿拉伯糖-1-脫氫酶基因的均具有良好的調(diào)控能力的兩種啟動(dòng)子：pj23119或plac，所表達(dá)的木糖還原酶、阿拉伯糖-1-脫氫酶均保留了良好的酶活。

13、進(jìn)一步地，所述cre/ loxp系統(tǒng)中，cre重組酶基因的核苷酸序列如seq?id?no.7所示。

14、進(jìn)一步地，所述cre/ loxp系統(tǒng)中， loxp位點(diǎn)的核苷酸序列如seq?id?no.8以及seqid?no.9所示。

15、在本技術(shù)中使用cre/ loxp系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)對(duì)于啟動(dòng)子的翻轉(zhuǎn)，具體來(lái)說(shuō)，需要形成 loxp-啟動(dòng)子- loxp的結(jié)構(gòu)，在這一結(jié)構(gòu)匯總，前一個(gè) loxp位點(diǎn)的核苷酸序列如seq?id?no.8所示，后一個(gè) loxp位點(diǎn)的核苷酸序列如seq?id?no.9所示，以使cre重組酶可以正確的與兩個(gè) loxp位點(diǎn)結(jié)合，并將兩個(gè) loxp位點(diǎn)之間的啟動(dòng)子翻轉(zhuǎn)。

16、進(jìn)一步地，所述茶堿開(kāi)關(guān)基因的核苷酸序列為如seq?id?no.3~6所示序列中的一種。

17、更進(jìn)一步地，所述基因工程菌中，排除int2與plac的組合，上述茶堿開(kāi)關(guān)與上述啟動(dòng)子可任意組合，均可實(shí)現(xiàn)通過(guò)茶堿誘導(dǎo)對(duì)啟動(dòng)子的表達(dá)控制。

18、進(jìn)一步地，宿主細(xì)胞基因組中，所述茶堿開(kāi)關(guān)基因位于cre重組酶基因起始密碼子atg的下游。

19、本技術(shù)中，將茶堿開(kāi)關(guān)基因置于cre重組酶基因起始密碼子atg的下游，使其可以實(shí)現(xiàn)對(duì)于cre重組酶基因表達(dá)的嚴(yán)格控制。

20、進(jìn)一步地，所述宿主細(xì)胞基因組中敲除 ptsg基因。

21、本技術(shù)中，敲除 ptsg基因可以減緩宿主細(xì)胞的ccr效應(yīng)，提高宿主細(xì)胞體內(nèi)葡萄糖與其他糖類(lèi)的共代謝效率。

22、進(jìn)一步地，所述cre /loxp系統(tǒng)、茶堿開(kāi)關(guān)基因和目的基因表達(dá)元件以基因組整合或重組質(zhì)粒的形式在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。

23、更進(jìn)一步地，所述茶堿開(kāi)關(guān)、cre重組酶以基因組整合的形式在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)；所述 loxp位點(diǎn)和目的基因表達(dá)元件以重組質(zhì)粒的形式在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。

24、進(jìn)一步地，所述cre重組酶基因以及茶堿開(kāi)關(guān)基因被插入到宿主細(xì)胞基因組核酸酶 dns位點(diǎn)中或基因間非編碼區(qū)。

25、進(jìn)一步地，所述宿主細(xì)胞為需鈉弧菌或大腸桿菌。

26、第二方面，本發(fā)明提供了一種制備木糖醇的方法，其特征在于，包括：

27、（1）以半纖維素水解液為原料，在接種有上述基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，直至發(fā)酵液中無(wú)阿拉伯糖殘留；

28、（2）向反應(yīng)液中添加茶堿后，繼續(xù)進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得到含木糖醇的發(fā)酵物。

29、本技術(shù)中，使用上述基因工程菌催化半纖維素水解液生產(chǎn)木糖醇，首先在無(wú)茶堿誘導(dǎo)的情況下，基因工程菌表達(dá)阿拉伯糖-1-脫氫酶，將半纖維素水解液中的阿拉伯糖轉(zhuǎn)化為阿拉伯糖酸；阿拉伯糖轉(zhuǎn)化完全之后，在反應(yīng)液中添加茶堿，誘導(dǎo)茶堿開(kāi)關(guān)的啟動(dòng)，使cre重組酶順利表達(dá)，cre重組酶表達(dá)后與 loxp位點(diǎn)特異性結(jié)合，將 loxp位點(diǎn)之間的啟動(dòng)子翻轉(zhuǎn)，使基因工程菌表達(dá)木糖還原酶，木糖還原酶將半纖維素反應(yīng)液中的木糖轉(zhuǎn)化為木糖醇，得到含木糖醇、阿拉伯糖酸的發(fā)酵物，進(jìn)一步地進(jìn)行產(chǎn)物分離之后，得到純的木糖醇，在此過(guò)程中并沒(méi)有副產(chǎn)物阿拉伯糖醇的產(chǎn)生。

30、進(jìn)一步地，所述半纖維素水解液由含豐富半纖維素的生物質(zhì)經(jīng)水解處理后獲得；所述含豐富半纖維素的生物質(zhì)為玉米芯、造紙短纖維、甘蔗渣、秸稈或稻殼等；所述半纖維素水解液中至少包含l-阿拉伯糖、葡萄糖和木糖。

31、進(jìn)一步地，所述半纖維素水解液中，阿拉伯糖、葡萄糖和木糖的質(zhì)量比為2~5：5~10：20~25。

32、進(jìn)一步地，所述茶堿加入的量為5~10?mm。

33、進(jìn)一步地，反應(yīng)溫度為25℃~35℃。

34、進(jìn)一步地，以初始發(fā)酵體積計(jì)，所述基因工程菌接種量為1~15%。

35、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

36、本發(fā)明提供了一種以半纖維素水解液為原料可生產(chǎn)木糖醇的基因工程菌，利用茶堿開(kāi)關(guān)、cre/ loxp等幾種表達(dá)控制技術(shù)，使得基因工程菌可以通過(guò)是否加入茶堿來(lái)控制其表達(dá)產(chǎn)物先為阿拉伯糖-1-脫氫酶，后為木糖還原酶，通過(guò)阿拉伯糖-1-脫氫酶將阿拉伯糖消耗后，再利用木糖還原酶將木糖轉(zhuǎn)化為木糖醇，防止半纖維素水解液制備木糖醇過(guò)程中的副產(chǎn)物的產(chǎn)生。