本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)，具體涉及一種四球茶組培再生的方法。

背景技術：

1、四球茶(camellia?tetracocca?zhang)是山茶屬茶亞屬subgen.thea茶組sect.thea五室茶系ser.quiquelocularis中的一種，其為生息于普安縣境內(nèi)海拔1700-1950m群山茂林內(nèi)的珍稀古茶樹，在1981年被張宏達教授發(fā)現(xiàn)并命名為“四球茶”，屬于貴州省普安縣特有茶種。普安人民利用四球茶新枝嫩葉研制出的“黃金舟”紅茶系列產(chǎn)品，不僅湯色金黃、口感醇厚、香郁柔潤、韻味甘甜，而且茶湯中富含多種營養(yǎng)成分，如果其實現(xiàn)量產(chǎn)將深受消費者的喜愛。

2、普安縣擁有近500株古茶樹，是重要的茶文化起源地之一。而對貴州普安特有的四球茶茶樹資源的研究和應用，可以將四球茶的相關茶產(chǎn)品打造普安地區(qū)特色名片、增加當?shù)厥杖耄瑢Ξ數(shù)亟?jīng)濟文化發(fā)展意義重大。

3、四球茶屬于小喬木植物，四球茶目前種質(zhì)資源稀缺，且存在生長周期長、自然結實率和雜交結實率都很低等問題，導致四球茶相關的茶產(chǎn)品無法實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，而組培快繁可快速、高效保持木本遺傳特征獲得大量回歸小苗，是解決四球茶生長周期長、自然結實率和雜交結實率都很低等問題的有效措施之一，因此，迫切需要開發(fā)四球茶組培技術，以實現(xiàn)四球茶組培、育苗、研發(fā)、生產(chǎn)的產(chǎn)業(yè)化。但迄今為止，未發(fā)現(xiàn)四球茶相關植物器官離體繁殖的研究與報道。而發(fā)明人在研究該種的組織培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)如下問題：

4、(1)健康無病蟲害、生長健壯的優(yōu)異古茶樹資源極其稀缺，外植體非常有限，外植體采集期影響外植體污染和褐化情況，最佳采集期在春夏季，但春夏季雨水較多，野生植株帶病菌種類和數(shù)量都相對較多，采集接種后極易污染，難以獲得無菌苗；

5、(2)組培過程中極易出現(xiàn)褐化、玻璃化、誘導出芽率不高、繁殖系數(shù)較低、生長速度慢、生根困難等問題。

6、為解決上述(1)的問題，發(fā)明人以5-6月含腋芽的四球茶枝條作為外植體，提前一個月對待利用的外植體枝條噴施茶樹精油并進行套袋，在不傷害腋芽生長的情況下降低外植體載菌幾率，并在初培養(yǎng)中加入硫脲抗褐化和抑菌，共同實現(xiàn)降低外植體污染、褐化和死亡；為解決上述(2)的問題，采用特定培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件按初培養(yǎng)-誘導腋芽增殖-小叢芽誘導與復壯-小叢芽生根等培養(yǎng)獲得四球茶組培苗，通過組培、煉苗和移植后管理實現(xiàn)短期大量獲得四球茶苗木。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于一種四球茶組培再生的方法，旨在降低外植體污染、褐化和死亡量，提高誘導出芽率和繁殖系數(shù)，快速生根、煉苗實現(xiàn)短期大量獲得四球茶苗木。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種四球茶組培再生的方法，所述方法包括：

3、s1，外植體處理：先用澳洲茶樹精油處理待采集枝條并用袋子套住所述待采集枝條，再采集所述待采集枝條，剪切，消毒與干燥，獲得帶腋芽莖段；

4、s2，初培養(yǎng)：取所述帶腋芽莖段，接種至初培養(yǎng)基中進行初培養(yǎng)，獲得腋芽，所述初培養(yǎng)基包括ms、硫脲；

5、s3，腋芽增殖培養(yǎng)：取步驟s2中的所述帶腋芽莖段接種至誘導培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；

6、s4，小叢芽培養(yǎng)：剪取步驟s3中的腋芽，將所述腋芽接種至誘導培養(yǎng)基中進行誘導培養(yǎng)，獲得叢芽，將所述叢芽分為帶3-6株不定芽的小叢芽，將所述小叢芽接種至復壯培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，獲得健壯小叢芽；

7、s5，小叢芽生根：將所述健壯小叢芽接種至生根培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，所述生根培養(yǎng)基包括1/2ms、胺鮮酯、十二烷基苯磺酸鈉；

8、s6，封口煉苗與移栽。

9、根據(jù)上述技術方案，本發(fā)明在腋芽增殖培養(yǎng)的接種材料為初培養(yǎng)階段的所述帶腋芽莖段，實現(xiàn)腋芽增殖的同時避免接種部位形成愈傷組織，提高腋芽增殖效率并縮短增殖時間。

10、優(yōu)選地，在上述技術方案中，所述誘導培養(yǎng)基為ms+80-100mg/l?ca(no3)2+6-8mg/lba+3-4mg/l?iaa?mg/l+0.01-0.05mg/l三碘苯甲酸+0.1-1mg/l三十烷醇。

11、優(yōu)選地，在上述技術方案中，在步驟s4中，所述誘導培養(yǎng)具體為在溫度26-30℃、光照強度800-1000?lx條件下培養(yǎng)7-10?d，再置于光照強度3000?-6000?lx、光照時間8-12?h的條件下培養(yǎng)。

12、優(yōu)選地，在上述技術方案中，將所述小叢芽接種至復壯培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的步驟中，所述復壯培養(yǎng)基為ms+0.6-0.8mg/l?6-ba+0.04-0.08mg/liba。

13、優(yōu)選地，在上述技術方案中，將所述健壯小叢芽接種至生根培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，所述生根培養(yǎng)基為1/2ms+40-50?mg/l?ca(no3)2+1-1.5mg/l?iaa+1-1.5mg/l?iba+0.3-0.5mg/l胺鮮酯+0.02-0.05mg/l十二烷基苯磺酸鈉。

14、根據(jù)上述技術方案，通過添加胺鮮酯和十二烷基苯磺酸鈉，并調(diào)節(jié)ca(no3)2、iaa、iba、胺鮮酯和十二烷基苯磺酸鈉的濃度配比，共同實現(xiàn)誘導四球茶小叢芽快速生根，以及促進四球茶小叢芽根系伸長。

15、優(yōu)選地，在上述技術方案中，所述步驟s3、s4和s5中，所述培養(yǎng)具體為在光照強度3000?-6000lx、光照時間8-12h的條件下培養(yǎng)。

16、優(yōu)選地，在上述技術方案中，在所述接種至初培養(yǎng)基中進行初培養(yǎng)的步驟中，所述初培養(yǎng)基為ms+6-8mg/lba+3-4?mg/l?iaa+0.01-0.05mg/l硫脲。

17、優(yōu)選地，在上述技術方案中，所述接種至初培養(yǎng)基中進行初培養(yǎng)的步驟中，所述初培養(yǎng)具體為在溫度26-30℃、光照強度300-500lx條件下培養(yǎng)5-10?d，再置于光照強度2000-3000?lx、光照時間8-12?h的條件下培養(yǎng)。

18、優(yōu)選地，在上述技術方案中，所述外植體處理的步驟具體如下：

19、外植體采集前1-1.5個月用澳洲茶樹精油噴施在待采集枝條的莖段、葉片和腋芽上，再用袋子套住所述待采集枝條，5-6月采集所述待采集枝條，將所述待采集枝條剪成帶1-2個腋芽的莖段，消毒與干燥，獲得帶腋芽莖段。

20、優(yōu)選地，在上述技術方案中，所述消毒與干燥的步驟具體如下：

21、將所述帶腋芽莖段用75％酒精攪拌浸泡10-30s，無菌水沖洗；再用0.1％氯化汞溶液浸泡6-12?min，浸泡期間按2-3?min/次的頻率進行攪拌，無菌水沖洗，用無菌濾紙吸干所述帶腋芽莖段表面水份，再剪除所述帶腋芽莖段兩端0.3-0.5cm，獲得1-2個腋芽的莖段。

22、與現(xiàn)有技術相比較，本發(fā)明的有益效果如下：

23、(1)一是以澳洲茶樹精油處理結合塑料袋物理隔離的方式，在采集前1個月用澳洲茶樹精油噴施結合塑料袋套住，以降低初培養(yǎng)的污染率和死亡率；二是采用氯化汞消毒，hg2+與帶負電荷的蛋白質(zhì)結合,使細菌蛋白變性、酶失活，并在初培養(yǎng)基中加入硫脲具有一定殺菌和抗褐化功效，以降低外植體污染率和褐化死亡率；

24、(2)采用特定培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，按誘導腋芽增殖-小叢芽誘導與復壯-小叢芽生根-封口煉苗后移栽的方式快速獲得叢生式四球茶苗。