本發(fā)明涉及膀胱疼痛綜合癥(bps)的治療，尤其涉及間質(zhì)性膀胱炎(ic)的治療。

背景技術(shù)：

1、膀胱疼痛綜合癥是一種慢性膀胱健康問(wèn)題，在美國(guó)約有600-1400萬(wàn)患者(即占美國(guó)成年人口的5-11％)。國(guó)際尿控學(xué)會(huì)(ics)將膀胱疼痛綜合癥定義為一種以慢性(>6個(gè)月)盆腔疼痛、壓力或不適為特征的疾病，這種疼痛被認(rèn)為與膀胱相關(guān)，并且至少伴有另一種泌尿系統(tǒng)癥狀，如持續(xù)的排尿緊迫感或尿頻。

2、尿頻是指排尿次數(shù)比正常情況更頻繁。一般人每天排尿不超過(guò)7次，且夜間起床排尿不超過(guò)1次。而膀胱疼痛綜合癥患者則需要日夜頻繁排尿，隨著尿頻癥狀加重，還會(huì)導(dǎo)致尿急。對(duì)一些患者來(lái)說(shuō)，即使剛排完尿，這種排尿的緊迫感也不會(huì)消失。

3、間質(zhì)性膀胱炎是膀胱疼痛綜合癥更嚴(yán)重或更晚期的形式，其特征還包括“典型的膀胱鏡和組織學(xué)特征”。例如，與非間質(zhì)性膀胱炎的膀胱疼痛綜合癥患者相比，間質(zhì)性膀胱炎患者的上皮剝脫、潰瘍、膿尿和/或黏膜下炎癥的發(fā)生率和程度更高。間質(zhì)性膀胱炎更宜被描述為一種慢性黏膜下炎癥性疾病。

4、雖然膀胱疼痛綜合癥的具體病因尚不清楚，但以下因素被認(rèn)為與之相關(guān)：

5、·膀胱組織存在缺陷，使得尿液中的潛在刺激物能夠穿透膀胱壁；

6、·肥大細(xì)胞功能亢進(jìn)和炎癥信號(hào)(如組胺)的過(guò)度分泌；

7、·尿液中存在損傷膀胱壁的污染物；

8、·局部傳入神經(jīng)的超敏反應(yīng)，導(dǎo)致正常情況下不會(huì)引起疼痛的事件(如膀胱充盈)引發(fā)疼痛；

9、·自身免疫。

10、尿液由腎臟的腎單位產(chǎn)生，在通過(guò)尿道排出之前，先被輸送到膀胱儲(chǔ)存。這種周期性的充盈和排空過(guò)程稱為排尿。隨著膀胱充盈，膀胱壁伸展，刺激傳入信號(hào)。相反，傳出信號(hào)分別導(dǎo)致膀胱肌肉收縮和尿道括約肌松弛。除了機(jī)械感受器外，各種心理因素(如壓力、對(duì)周圍環(huán)境的可接受程度和情緒狀態(tài))在排尿的時(shí)機(jī)和環(huán)境選擇中也起著至關(guān)重要的作用。顯然，膀胱具有出色的彈性特性。這些特性源于膀胱壁的結(jié)構(gòu)，膀胱壁從內(nèi)到外依次分為以下幾層：

11、·上皮層；

12、·固有層；

13、·固有肌層；

14、·漿膜/外膜。

15、膀胱上皮細(xì)胞形成了一個(gè)關(guān)鍵的屏障，防止尿液中的刺激物穿過(guò)膀胱內(nèi)膜，接觸到膀胱腔周圍的底層細(xì)胞和結(jié)締組織。實(shí)際上，膀胱上皮細(xì)胞形成了一種高度特異化的分層上皮，即尿路上皮，就是為了實(shí)現(xiàn)這一特定目的。更詳細(xì)地說(shuō)，尿路上皮由三層組成：

16、·表層，這是最內(nèi)層，是膀胱腔與底層組織之間的主要屏障。這個(gè)高度特異化的層由單層細(xì)胞(“傘細(xì)胞”)組成，這些細(xì)胞通過(guò)緊密的細(xì)胞間連接協(xié)同工作，形成一個(gè)不可滲透的屏障。傘細(xì)胞的另一個(gè)重要作用是適應(yīng)膀胱的伸展。這是通過(guò)釋放尿斑蛋白(通過(guò)含有尿斑蛋白的梭形囊泡)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，尿斑蛋白形成一個(gè)覆蓋傘細(xì)胞的表面斑塊層。當(dāng)膀胱壁放松時(shí)，這些尿板蛋白通過(guò)snare介導(dǎo)的內(nèi)吞作用回到傘細(xì)胞中；

17、·中間層，由兩到三層多邊形細(xì)胞組成；

18、·基底層，由兩到三層小立方細(xì)胞組成。

19、在松弛(即未擴(kuò)張)的膀胱中，尿路上皮有五到七層細(xì)胞厚。在這種未擴(kuò)張的狀態(tài)下，健康成年人的膀胱典型容量約為500毫升。當(dāng)膀胱充滿尿液時(shí)，膀胱壁伸展以容納增加的體積，在這種擴(kuò)張狀態(tài)下，尿路上皮會(huì)重新組織成兩到三層，且不會(huì)有任何結(jié)構(gòu)損傷。

20、固有層形成一種細(xì)胞外基質(zhì)，將尿路上皮與下面的固有肌層(逼尿肌)分隔開(kāi)。該基質(zhì)包含許多特殊的細(xì)胞類型(如彈性纖維、毛細(xì)血管、傳入神經(jīng)末梢、cajal間質(zhì)細(xì)胞、一層不明顯的平滑肌和黏膜肌層)，并作為膀胱的“功能中心”。在這方面，固有層調(diào)節(jié)排尿反射的傳入支，cajal間質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為是向膀胱平滑肌細(xì)胞傳遞神經(jīng)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)器。因此，固有層是膀胱的一個(gè)容量調(diào)節(jié)層。

21、固有肌層也被稱為逼尿肌。它由傳出(運(yùn)動(dòng))神經(jīng)支配，由三層組成：內(nèi)層縱行肌、中層環(huán)行肌和外層縱行肌。

22、漿膜和外膜是薄的結(jié)締漿膜和外膜是薄的結(jié)締組織層，構(gòu)成膀胱的最外層。

23、這些層共同負(fù)責(zé)維持膀胱的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定(如排尿)，而膀胱壁內(nèi)膜則起到隔離和保護(hù)相鄰組織和器官的作用，使其免受儲(chǔ)存在膀胱中的尿液(包括尿液中的有毒溶質(zhì)和代謝物)的接觸。通過(guò)這種方式，膀胱壁內(nèi)膜提供了一個(gè)高效的屏障，阻止尿液滲透。然而，這種高度特化的功能帶來(lái)的一個(gè)不利后果是，膀胱壁也會(huì)阻礙潛在治療分子的滲透。這給膀胱疼痛綜合癥和/或間質(zhì)性膀胱炎的任何治療都帶來(lái)了重大挑戰(zhàn)，因?yàn)橹委煼肿颖仨毷紫却┻^(guò)膀胱壁屏障，才能對(duì)位于膀胱壁深層的目標(biāo)細(xì)胞產(chǎn)生臨床相關(guān)的效果。

24、雖然非侵入性方法引起了一些關(guān)注，但這些方法的一個(gè)常見(jiàn)問(wèn)題是，它們最多只能提供有限的有益效果，而且起效非常緩慢(可能需要長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月的時(shí)間)。此外，還需要頻繁重復(fù)給藥。迄今為止，(即戊聚糖多硫酸鈉)仍然是美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(fda)唯一批準(zhǔn)的用于口服治療膀胱疼痛綜合癥/間質(zhì)性膀胱炎的藥物。戊聚糖多硫酸鈉的結(jié)構(gòu)與膀胱內(nèi)膜的天然糖胺聚糖涂層相似，被認(rèn)為可以對(duì)膀胱內(nèi)膜進(jìn)行暫時(shí)修復(fù)。雖然其確切的作用機(jī)制尚不清楚，但人們知道會(huì)附著在膀胱壁的管腔側(cè)并形成一層，因此它起到了一種化學(xué)填充劑或密封劑的作用，有效地覆蓋了尿路上皮的任何受損區(qū)域。

25、侵入性方法解決了這些缺點(diǎn)，是治療膀胱疼痛綜合癥和/或間質(zhì)性膀胱炎的首選干預(yù)方法。盡管侵入性方法通常涉及某種形式的物理干預(yù)，這帶來(lái)了從麻醉到靜脈鎮(zhèn)靜等額外的患者管理問(wèn)題。最常見(jiàn)的物理干預(yù)程序之一是膀胱逼尿肌內(nèi)注射(見(jiàn)圖1)，該過(guò)程需要小心地將器械通過(guò)尿道開(kāi)口并沿著尿道插入患者的膀胱。然后在膀胱鏡的引導(dǎo)下，將針頭依次操縱至膀胱壁內(nèi)膜上多個(gè)預(yù)先確定的注射部位。每次注射都需要將針頭穿透膀胱壁內(nèi)膜(進(jìn)入逼尿肌)，并在每個(gè)注射部位輸送一定劑量的治療劑。這種程序的不良后果包括局部出血和疼痛，并且可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的患者管理問(wèn)題。特別是，這種程序的副作用，如局部出血和疼痛，可能會(huì)導(dǎo)致患者總體滿意度較低，進(jìn)而可能導(dǎo)致患者對(duì)這種治療方案的依從性降低。

26、另一種方法是膀胱內(nèi)灌注(見(jiàn)圖2)，該方法包括將導(dǎo)管插入患者的尿道并排出膀胱中存在的任何尿液。然后將少量(例如50毫升)藥物通過(guò)導(dǎo)管緩慢注入膀胱。取出導(dǎo)管，并指示患者恢復(fù)正常日?；顒?dòng)，但至少15分鐘內(nèi)不要排空膀胱，最好是至少90分鐘。通過(guò)這種方式，藥物可以接觸并有可能治療整個(gè)膀胱壁內(nèi)膜。然而，不幸的是，這種程序未能解決膀胱壁內(nèi)膜構(gòu)成的不可滲透屏障問(wèn)題，因此其局限性在于它只適用于作用于膀胱壁內(nèi)膜管腔側(cè)的治療方法。

27、人們?cè)鴩L試對(duì)這種程序進(jìn)行修改，以擴(kuò)大治療選擇范圍，包括針對(duì)位于膀胱壁深層的細(xì)胞。一種這樣的方法是依賴使用化學(xué)剝離劑(例如二甲基亞砜(dmso)、硫酸魚(yú)精蛋白、透明質(zhì)酸-磷脂酰乙醇胺)，這些剝離劑溶解在液體灌注混合物中，并作為標(biāo)準(zhǔn)灌注方案的一部分施用于患者。例如，dmso可以以50％的濃度作為單一藥物灌注，或者更常見(jiàn)的是，與甲基強(qiáng)的松龍或氫化可的松、堿化利多卡因和硫酸肝素一起作為“雞尾酒”的一部分使用。一旦施用，剝離劑會(huì)攻擊它們接觸到的任何細(xì)胞，逐漸從尿路上皮層剝離細(xì)胞并使膀胱壁通透。

28、不幸的是，使用剝離劑進(jìn)行灌注并沒(méi)有被證明是治療膀胱疼痛綜合癥和/或間質(zhì)性膀胱炎的理想方法。這有幾個(gè)原因，其中最重要的是化學(xué)剝離劑是有毒的(通常是非選擇性的)刺激物，因此應(yīng)避免患者或醫(yī)生長(zhǎng)時(shí)間接觸。因此，使用剝離劑進(jìn)行灌注不適合重復(fù)使用。此外，一旦開(kāi)始，很難對(duì)剝脫過(guò)程進(jìn)行充分控制，這反過(guò)來(lái)又使得該過(guò)程不可預(yù)測(cè)，因此不可靠。相關(guān)因素包括化學(xué)試劑變量(例如試劑的選擇和濃度)、灌注變量(例如與試劑的接觸時(shí)間)和患者特異性變量(例如現(xiàn)有膀胱壁損傷的程度以及對(duì)所選治療分子或方案的反應(yīng)性)。

29、在考慮將治療分子遞送至相關(guān)靶細(xì)胞以治療膀胱疼痛綜合癥和/或間質(zhì)性膀胱炎時(shí)，膀胱壁內(nèi)膜(尿路上皮)并不是唯一需要解決的結(jié)構(gòu)上的挑戰(zhàn)。例如，當(dāng)靶細(xì)胞位于膀胱壁的深層時(shí)，治療分子必須能夠穿透膀胱壁的底層，才能到達(dá)這些靶細(xì)胞，進(jìn)而發(fā)揮其治療作用。因此，毫不奇怪，膀胱壁結(jié)構(gòu)所帶來(lái)的物理限制本質(zhì)上更有利于小分子治療藥物，這使得這類分子成為治療膀胱疼痛綜合癥和/或間質(zhì)性膀胱炎的首選分子類別。

30、治療干預(yù)還因需要確保治療分子選擇性地遞送至相關(guān)靶細(xì)胞而變得更加復(fù)雜，從而避免或最小化任何不良的非靶向效應(yīng)。在治療膀胱疼痛綜合癥和/或間質(zhì)性膀胱炎的背景下，這需要優(yōu)先選擇性地指向膀胱壁底層組織中的感覺(jué)傳入神經(jīng)纖維，而不是傳出神經(jīng)纖維。

31、通過(guò)膀胱逼尿肌內(nèi)注射使用梭菌神經(jīng)毒素，特別是肉毒桿菌神經(jīng)毒素a(bont/a)來(lái)治療膀胱疼痛綜合癥是已知的。bont/a的膀胱逼尿肌內(nèi)注射具有高度侵入性，會(huì)同時(shí)靶向膀胱壁的所有三個(gè)神經(jīng)支配水平，即：尿路上皮；固有層的傳入神經(jīng)末梢；以及逼尿肌的傳出神經(jīng)末梢(見(jiàn)圖3)。這種方法無(wú)法實(shí)現(xiàn)bont/a對(duì)感覺(jué)傳入纖維(相對(duì)于傳出纖維)的選擇性靶向。此外，bont/a與逼尿肌傳出神經(jīng)末梢的結(jié)合可能會(huì)導(dǎo)致不良的副作用，如出血。

32、另一方面，膀胱腔內(nèi)灌注bont/a(不進(jìn)行注射)由于膀胱尿路上皮對(duì)大分子的不可滲透性以及bont/a會(huì)被尿液中的蛋白酶降解，無(wú)法將bont/a遞送至膀胱壁-見(jiàn)khera,m.等人(2005年)urology,66,208-212；以及shimizu,s.(2012年)j.urol.,187,e370。人們?cè)鴩L試使用脂質(zhì)體包裹的bont/a來(lái)解決降解問(wèn)題。

33、雖然有報(bào)道稱(當(dāng)通過(guò)膀胱腔內(nèi)灌注與dmso、硫酸魚(yú)精蛋白或透明質(zhì)酸-磷脂酰乙醇胺共同給藥時(shí))bont/a有一定程度的遞送，但這種使用剝離劑的方法未能提供一種受認(rèn)可的、比bont/a膀胱逼尿肌內(nèi)注射有顯著改進(jìn)的方法，bont/a膀胱逼尿肌內(nèi)注射仍然是目前治療膀胱疼痛綜合癥的首選治療干預(yù)方法。

34、也有報(bào)道稱，當(dāng)以水凝膠制劑或脂質(zhì)體包裹制劑的形式(通過(guò)膀胱腔內(nèi)灌注)給藥時(shí)，bont/a有一定程度的遞送。然而，與使用剝離劑的方法類似，水凝膠或脂質(zhì)體的使用未能提供一種受認(rèn)可的、比bont/a膀胱逼尿肌內(nèi)注射有顯著改進(jìn)的方法，bont/a?膀胱逼尿肌內(nèi)注射仍然是目前治療膀胱疼痛綜合癥的首選治療干預(yù)方法。

35、因此，本領(lǐng)域需要一種治療膀胱疼痛綜合癥和/或間質(zhì)性膀胱炎的方法，該方法優(yōu)先選擇性地靶向膀胱壁中的感覺(jué)傳入纖維，而不是傳出纖維，同時(shí)具有微創(chuàng)性(例如，比膀胱逼尿肌內(nèi)注射侵入性更小)。還有避免使用剝離劑的需求。

36、本發(fā)明解決了上述一個(gè)或多個(gè)問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

0、發(fā)明概要

1、本發(fā)明涉及梭菌神經(jīng)毒素，如肉毒桿菌神經(jīng)毒素(bonts)，作為治療有需要的受試者的膀胱疼痛綜合癥(bps)，特別是間質(zhì)性膀胱炎(ic)的治療劑的用途。

2、更詳細(xì)地說(shuō)，本發(fā)明人首次令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，通過(guò)一種獨(dú)特的方法，即使用含有所述神經(jīng)毒素的溶液對(duì)膀胱進(jìn)行輕壓灌注來(lái)給藥梭菌神經(jīng)毒素(例如bont/a)，可以減輕或消除與膀胱疼痛綜合癥，特別是間質(zhì)性膀胱炎相關(guān)的疼痛，顯著改善患者的生活質(zhì)量，且?guī)缀鯖](méi)有副作用，這與傳統(tǒng)方法不同。

3、發(fā)明人的一個(gè)驚人發(fā)現(xiàn)是，這種方法會(huì)對(duì)膀胱的尿路上皮層產(chǎn)生一種輕機(jī)械力，足以使梭菌神經(jīng)毒素?cái)U(kuò)散穿過(guò)尿路上皮層并進(jìn)入固有層，同時(shí)限制神經(jīng)毒素進(jìn)一步擴(kuò)散到膀胱壁的更深層，特別是逼尿肌。這種由輕壓力驅(qū)動(dòng)的梭菌神經(jīng)毒素?cái)U(kuò)散使得毒素能夠靶向位于固有層內(nèi)的初級(jí)感覺(jué)傳入神經(jīng)，抑制其中神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，從而緩解疼痛感。

4、這是可能的，因?yàn)榛加邪螂滋弁淳C合癥，特別是間質(zhì)性膀胱炎的受試者的膀胱尿路上皮層是受損且多孔的，因此溶液能夠在本發(fā)明的輕壓灌注技術(shù)的輔助下穿過(guò)這一層。進(jìn)一步的優(yōu)點(diǎn)是不需要針頭或刺激性的輔料，因此只需要一種簡(jiǎn)單的基于生理鹽水的溶液。這與現(xiàn)有方法形成對(duì)比，現(xiàn)有方法使用痛苦的針頭注射或刺激性強(qiáng)的配方，將梭菌神經(jīng)毒素(例如bont)輸送到固有層及更深層。因此，與傳統(tǒng)方法故意損傷尿路上皮層及更深層組織不同，本發(fā)明的給藥技術(shù)(輕壓灌注)對(duì)尿路上皮細(xì)胞層的完整性沒(méi)有影響或幾乎沒(méi)有影響，例如不會(huì)造成比已有損傷更嚴(yán)重的損害。

5、在實(shí)際操作中，通常在輕壓灌注前對(duì)患者的膀胱進(jìn)行沖洗/清潔。之后，通過(guò)簡(jiǎn)單的導(dǎo)管等方式將梭菌神經(jīng)毒素溶液注入膀胱，這會(huì)對(duì)尿路上皮層施加輕壓力。這種注入過(guò)程會(huì)持續(xù)進(jìn)行，直至但不超過(guò)患者產(chǎn)生排尿沖動(dòng)的點(diǎn)。在健康成年人中，這(通常)發(fā)生在膀胱容納約300-400毫升液體時(shí)，不過(guò)在膀胱疼痛綜合癥患者中，這通常發(fā)生在膀胱容納200-300毫升液體時(shí)，有時(shí)甚至更少。當(dāng)膀胱中的牽張感受器向副交感神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)出信號(hào)，刺激逼尿肌的毒蕈堿受體收縮，從而啟動(dòng)排尿時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生排尿沖動(dòng)。因此，可能需要根據(jù)每個(gè)患者的具體情況進(jìn)行一些嘗試和調(diào)整，以確定會(huì)觸發(fā)膀胱排空的液體閾值體積。然后，只需從這個(gè)閾值體積倒推計(jì)算出一個(gè)減少的體積(例如減少5％或10％)，以建立一個(gè)安全系數(shù)，確?；颊咴诮邮芩缶窠?jīng)毒素溶液治療期間不會(huì)排尿。一旦注入了所需體積的梭菌神經(jīng)毒素溶液，就關(guān)閉導(dǎo)管，讓溶液擴(kuò)散穿過(guò)尿路上皮層。

6、重要的是，發(fā)明人觀察到這種由輕壓力驅(qū)動(dòng)的梭菌神經(jīng)毒素?cái)U(kuò)散通常局限于固有層內(nèi)。特別是，這種擴(kuò)散不會(huì)延伸到膀胱肌肉層，使得梭菌神經(jīng)毒素不會(huì)像傳統(tǒng)的膀胱逼尿肌內(nèi)注射那樣靶向逼尿肌的傳出神經(jīng)末梢，從而避免了諸如出血和肌肉麻痹等不良副作用。相反，新方法能夠精確地遞送梭菌神經(jīng)毒素，使該神經(jīng)毒素在膀胱壁的尿路上皮層和固有層中全身擴(kuò)散，以靶向定位在固有層內(nèi)的傳入神經(jīng)末梢(能夠傳遞疼痛信號(hào)的感覺(jué)末梢)(見(jiàn)圖4)。本發(fā)明的新給藥方法(輕壓灌注)的優(yōu)點(diǎn)在于，它提供了一種簡(jiǎn)單、無(wú)痛且非侵入性的給藥方式(無(wú)需針頭的梭菌神經(jīng)毒素給藥)，因此該操作不僅可以由護(hù)士進(jìn)行，患者自己也有可能操作。這種方法的非侵入性與期望的治療效果相結(jié)合，提高了患者的整體滿意度，進(jìn)而增強(qiáng)了患者對(duì)這種治療方案的依從性。

7、詳細(xì)描述

8、一方面，本發(fā)明提供了一種治療患有膀胱疼痛綜合癥的患者的方法，該方法包括：

9、·將含有梭菌神經(jīng)毒素的溶液注入患者的膀胱；

10、·增加膀胱內(nèi)含有梭菌神經(jīng)毒素的溶液的體積，從而對(duì)尿路上皮層的內(nèi)表面施加機(jī)械力；

11、·將膀胱內(nèi)含有梭菌神經(jīng)毒素的溶液維持在不會(huì)引起患者排尿的體積，并持續(xù)至少30分鐘，從而使梭菌神經(jīng)毒素?cái)U(kuò)散穿過(guò)尿路上皮層并進(jìn)入固有層，在固有層中梭菌神經(jīng)毒素與初級(jí)感覺(jué)傳入神經(jīng)纖維結(jié)合，抑制神經(jīng)遞質(zhì)從其中分泌，進(jìn)而緩解膀胱疼痛。

12、一方面，本發(fā)明提供了一種含有梭菌神經(jīng)毒素的溶液，用于治療患有膀胱疼痛綜合癥的患者的方法，該方法包括：

13、·將含有梭菌神經(jīng)毒素的溶液注入患者的膀胱；

14、·增加膀胱內(nèi)含有梭菌神經(jīng)毒素的溶液的體積，從而對(duì)尿路上皮層的內(nèi)表面施加機(jī)械力；

15、·將膀胱內(nèi)含有梭菌神經(jīng)毒素的溶液維持在不會(huì)引起患者排尿的體積，并持續(xù)至少30分鐘，從而使梭菌神經(jīng)毒素?cái)U(kuò)散穿過(guò)尿路上皮層并進(jìn)入固有層，在固有層中梭菌神經(jīng)毒素與初級(jí)感覺(jué)傳入神經(jīng)纖維結(jié)合，抑制神經(jīng)遞質(zhì)從其中分泌，進(jìn)而緩解膀胱疼痛。

16、膀胱壁包括三個(gè)細(xì)胞層：尿路上皮、固有層和逼尿肌。尿路上皮是膀胱壁的最內(nèi)層，是一種獨(dú)特的、高度特化的上皮襯里，起到將膀胱腔內(nèi)容物與尿路上皮下方組織分隔開(kāi)的屏障作用。固有層是一層疏松的結(jié)締組織，將尿路上皮與逼尿肌分隔開(kāi)，逼尿肌由縱向和環(huán)形的平滑肌纖維組成。

17、有利的是，發(fā)明人觀察到，用含有梭菌神經(jīng)毒素的溶液將患有膀胱疼痛綜合癥/間質(zhì)性膀胱炎的患者的膀胱充盈至但不超過(guò)患者產(chǎn)生排尿沖動(dòng)的點(diǎn)值，會(huì)對(duì)尿路上皮層施加輕壓力，使梭菌神經(jīng)毒素在輕壓力的驅(qū)動(dòng)下擴(kuò)散穿過(guò)該層并進(jìn)入固有層。

18、可以使用多種方法來(lái)確定患者觸發(fā)膀胱排空的液體閾值體積。例如，可以使用排尿日記、尿流率測(cè)定、超聲掃描和膀胱測(cè)壓法。

19、排尿日記可以是記錄患者24小時(shí)內(nèi)每日液體攝入量和排尿情況(包括偶然的漏尿)的記錄。

20、尿流率測(cè)定可能包括讓患者排尿，由尿流率計(jì)記錄尿液從膀胱排出的總體積、速度和時(shí)間長(zhǎng)度。隨后可進(jìn)行膀胱掃描，以評(píng)估患者膀胱中是否有殘余尿量。然后可根據(jù)尿流率計(jì)和膀胱掃描的結(jié)果計(jì)算出觸發(fā)膀胱排空的液體閾值體積。

21、超聲掃描是對(duì)膀胱充盈(排尿前)的患者進(jìn)行盆腔區(qū)域掃描，以確定患者膀胱中的液體量。超聲掃描可以提供有關(guān)患者膀胱大小、充盈程度和/或膀胱壁的信息。

22、膀胱測(cè)壓法的操作是在患者處于坐姿時(shí)，將一根5-f的導(dǎo)管插入患者膀胱，并以每分鐘50毫升的速度向膀胱內(nèi)注入生理鹽水。記錄患者無(wú)法再憋尿時(shí)注入膀胱的生理鹽水的量(以毫升為單位)，以此確定觸發(fā)膀胱排空的液體閾值體積。

23、本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，對(duì)于患有膀胱疼痛綜合癥/間質(zhì)性膀胱炎(bps/ic)的患者，觸發(fā)排尿的液體閾值體積可能因個(gè)體差異而有所不同。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)理解，bps/ic患者與健康患者的該閾值體積也可能存在差異。

24、為了在治療過(guò)程中防止患者排尿，同時(shí)又能對(duì)尿路上皮層施加輕壓力，可以給予低于觸發(fā)排尿的液體閾值體積的含有梭菌神經(jīng)毒素的溶液。與同一患者觸發(fā)排尿的液體閾值體積相比，給予患者的含有梭菌神經(jīng)毒素的溶液的體積可減少至少5％、10％、15％、20％、25％、30％。與同一患者觸發(fā)排尿的液體閾值體積相比，給予患者的含有梭菌神經(jīng)毒素的溶液的體積可減少小于或等于70％、60％、50％或40％。與同一患者觸發(fā)排尿的液體閾值體積相比，給予患者的含有梭菌神經(jīng)毒素的溶液的體積可減少5-70％、10-60％、15-50％、20-40％或25-30％。

25、給予患者的含有梭菌神經(jīng)毒素的溶液的減少體積可以至少為150、175、200、225、250、275或300毫升。給予患者的含有梭菌神經(jīng)毒素的溶液的減少體積可以小于或等于400、375、350、325、300、275或250毫升。給予患者的含有梭菌神經(jīng)毒素的溶液的減少體積可以為150-400、175-375、200-350、225-325或250-300毫升。

26、在一個(gè)實(shí)施方案中，用含有梭菌神經(jīng)毒素的溶液進(jìn)行單次治療灌注的持續(xù)時(shí)間為規(guī)定的時(shí)長(zhǎng)，例如，持續(xù)時(shí)間至少為15分鐘、20分鐘、25分鐘、30分鐘或40分鐘，優(yōu)選至少為45分鐘，更優(yōu)選至少為50分鐘(例如至少1小時(shí))。在一個(gè)實(shí)施方案中，用含有梭菌神經(jīng)毒素的溶液進(jìn)行單次治療灌注的持續(xù)時(shí)間小于或等于2小時(shí)、1小時(shí)45分鐘、1小時(shí)30分鐘或1小時(shí)25分鐘，優(yōu)選小于或等于1小時(shí)15分鐘，更優(yōu)選小于或等于1小時(shí)10分鐘(例如至少1小時(shí))。在一個(gè)實(shí)施方案中，用含有梭菌神經(jīng)毒素的溶液進(jìn)行單次治療灌注的持續(xù)時(shí)間為15分鐘至2小時(shí)、30分鐘至1小時(shí)45分鐘、45分鐘至1小時(shí)30分鐘，優(yōu)選45分鐘至1小時(shí)15分鐘，更優(yōu)選50分鐘至1小時(shí)10分鐘(例如1小時(shí))。在此之后，醫(yī)生可能會(huì)要求患者排尿，以將溶液從患者膀胱中排出。

27、患者可能接受一個(gè)療程的治療，該療程包括在規(guī)定時(shí)間內(nèi)進(jìn)行多次治療灌注，例如在2周內(nèi)進(jìn)行多次治療灌注。在一個(gè)實(shí)施方案中，作為療程治療的一部分，通過(guò)輕壓灌注給予含有梭菌神經(jīng)毒素的溶液，其中該療程治療包括在至少2周、3周、4周的規(guī)定時(shí)間內(nèi)進(jìn)行多次離散灌注，優(yōu)選至少5周，更優(yōu)選至少6周(例如至少7周)。在一個(gè)實(shí)施方案中，作為療程治療的一部分，通過(guò)輕壓灌注給予含有梭菌神經(jīng)毒素的溶液，其中該療程治療包括在小于或等于12周、11周或10周的規(guī)定時(shí)間內(nèi)進(jìn)行多次離散灌注，優(yōu)選小于或等于9周，更優(yōu)選小于或等于8周(例如小于或等于7周)。在一個(gè)實(shí)施方案中，作為療程治療的一部分，通過(guò)輕壓灌注給予含有梭菌神經(jīng)毒素的溶液，其中該療程治療包括在2-12周、3-11周或4-10周的規(guī)定時(shí)間內(nèi)進(jìn)行多次離散灌注，優(yōu)選5-9周，更優(yōu)選6-8周(例如7周)。

28、多次離散灌注可以每周至少1次或2次的頻率進(jìn)行給藥。多次離散灌注可以每周小于或等于4次、3次、2次或1次的頻率進(jìn)行給藥。多次離散灌注可以每周1-4次、1-3次或2-3次的頻率進(jìn)行給藥，優(yōu)選每周2-3次。

29、術(shù)語(yǔ)“水?dāng)U張”是指一種使用膀胱鏡將無(wú)菌液體注入膀胱直至膀胱過(guò)度擴(kuò)張的方法。水?dāng)U張可能涉及以60-80cmh0的壓力用溶液填充膀胱(inoue等人，“hydrodistentionof?the?bladder?in?patients?with?interstitial?cystitis--clinical?efficacy?andits?association?with?immunohistochemical?findings?for?bladder?tissues.”hinyokika?kiyo?52(10)(2006):765-8)。水?dāng)U張依賴于使用高壓使膀胱過(guò)度擴(kuò)張。

30、本發(fā)明的給藥方法與水?dāng)U張不同且不等同。

31、因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，向患者給藥含有梭菌神經(jīng)毒素的溶液不涉及對(duì)患者膀胱進(jìn)行水?dāng)U張。在一個(gè)實(shí)施方案中，向患者給藥含有梭菌神經(jīng)毒素的溶液不涉及將膀胱擴(kuò)張至至少50、60、70或80cmh0的壓力。在一個(gè)實(shí)施方案中，向患者給藥含有梭菌神經(jīng)毒素的溶液不涉及將膀胱擴(kuò)張至小于或等于50-100、60-90或70-80cmh0的壓力。

32、在一個(gè)實(shí)施方案中，梭菌神經(jīng)毒素選擇性地結(jié)合初級(jí)感覺(jué)傳入神經(jīng)纖維。在一個(gè)實(shí)施方案中，梭菌神經(jīng)毒素基本保留在固有層內(nèi)(優(yōu)選地，梭菌神經(jīng)毒素不會(huì)擴(kuò)散到膀胱壁的逼尿肌中)。因此，有利的是，與傳統(tǒng)方法不同，本發(fā)明的方法避免了靶向定位在逼尿肌中的傳出神經(jīng)末梢(這可能導(dǎo)致出血和肌肉麻痹)。

33、在一個(gè)實(shí)施方案中，含有梭菌神經(jīng)毒素的溶液在膀胱壁的固有層中全身擴(kuò)散，并且其中梭菌神經(jīng)毒素抑制其中基本上所有副交感傳入神經(jīng)元的神經(jīng)遞質(zhì)釋放。因此，與傳統(tǒng)方法(如膀胱逼尿肌內(nèi)注射)不同，本發(fā)明的方法可以實(shí)現(xiàn)梭菌神經(jīng)毒素的局部給藥，幾乎沒(méi)有或很少擴(kuò)散到周圍區(qū)域，并且很少有全身循環(huán)(更好地靶向感覺(jué)纖維)。

34、術(shù)語(yǔ)“系統(tǒng)地”是指溶液在整個(gè)組織(優(yōu)選膀胱壁的固有層)中的分布。該溶液可以在膀胱壁的多達(dá)兩層中均勻分散。該溶液可以在尿路上皮層和/或固有層中分散。該溶液可以在固有層中系統(tǒng)地?cái)U(kuò)散，而不會(huì)擴(kuò)散到膀胱壁的更深層，如逼尿肌。

35、在抑制副交感傳入神經(jīng)元釋放神經(jīng)遞質(zhì)的背景下，術(shù)語(yǔ)“基本上”可以意味著抑制固有層中50-100％、60-90％或70-80％的副交感傳入神經(jīng)元的神經(jīng)遞質(zhì)釋放。優(yōu)選地，梭菌神經(jīng)毒素可以抑制固有層中100％的副交感傳入神經(jīng)元的神經(jīng)遞質(zhì)釋放。

36、在一個(gè)實(shí)施方案中，溶液通過(guò)導(dǎo)管注入膀胱。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法基本上是非侵入性的，優(yōu)選地，該方法對(duì)尿路上皮層和/或固有層基本上不造成物理?yè)p傷。因此，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于通過(guò)一種非侵入性方法給藥梭菌神經(jīng)毒素，該方法避免使用針頭，因此是無(wú)痛的。

37、在一個(gè)實(shí)施方案中，該溶液可以避免對(duì)尿路上皮細(xì)胞和固有層細(xì)胞造成進(jìn)一步損傷。在一個(gè)實(shí)施方案中，該溶液包含(優(yōu)選由......組成)梭菌神經(jīng)毒素和生理惰性緩沖液。優(yōu)選地，生理惰性緩沖液可以是磷酸鹽緩沖鹽水。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法避免使用剝離劑，從而防止對(duì)膀胱壁造成進(jìn)一步損傷。剝離劑可以是dmso、硫酸魚(yú)精蛋白和/或透明質(zhì)酸-磷脂酰乙醇胺。換句話說(shuō)，與傳統(tǒng)方法使用化學(xué)刺激劑(如dmso)使膀胱壁細(xì)胞通透不同，本發(fā)明可以給藥一種無(wú)害的(不含如dmso等刺激性輔料)且包含梭菌神經(jīng)毒素的溶液。

38、術(shù)語(yǔ)“惰性”是指一種溶液可能是化學(xué)上不活躍的，例如不會(huì)引起刺激或組織損傷。

39、在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法不會(huì)引起患者排尿(優(yōu)選地，梭菌神經(jīng)毒素不會(huì)結(jié)合副交感傳出神經(jīng)元以刺激逼尿肌中的毒蕈堿受體來(lái)收縮逼尿肌)。因此，有利的是，該方法為含有梭菌神經(jīng)毒素的溶液提供了足夠的時(shí)間來(lái)擴(kuò)散穿過(guò)尿路上皮層，并且在患者排尿之前，使患者能夠從該溶液的治療效果中受益。

40、在一個(gè)實(shí)施方案中，用含有梭菌神經(jīng)毒素的溶液進(jìn)行單次治療灌注的時(shí)間至少為1小時(shí)。

41、綜上所述，本發(fā)明通過(guò)降低或消除患者感知到的疼痛水平并改善患者的生活質(zhì)量，有效地治療了膀胱疼痛綜合癥。

42、因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，使用本發(fā)明的給藥方法，在使用含有梭菌神經(jīng)毒素的溶液治療后，膀胱疼痛得到減輕。例如，與未用含有梭菌神經(jīng)毒素的溶液治療的(對(duì)照)患者的疼痛水平相比，使用本發(fā)明的給藥方法，用含有梭菌神經(jīng)毒素的溶液治療患有bps/ic的患者后，其疼痛水平可以降低或消除。

43、在一個(gè)實(shí)施方案中，在用含有梭菌神經(jīng)毒素的溶液對(duì)膀胱進(jìn)行輕壓灌注后，膀胱疼痛至少減輕2天。

44、在一個(gè)實(shí)施方案中，在用含有梭菌神經(jīng)毒素的溶液對(duì)膀胱進(jìn)行輕壓灌注后，膀胱疼痛至少減輕1天，優(yōu)選至少2天，更優(yōu)選至少3天(例如至少4天)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在用含有梭菌神經(jīng)毒素的溶液對(duì)膀胱進(jìn)行輕壓灌注后，膀胱疼痛減輕小于或等于9天、8天或7天，優(yōu)選小于或等于6天，更優(yōu)選小于或等于5天(例如小于或等于4天)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在用含有梭菌神經(jīng)毒素的溶液對(duì)膀胱進(jìn)行輕壓灌注后，膀胱疼痛減輕1-7天或2-6天，優(yōu)選2-5天，更優(yōu)選3-5天(例如4天)。

45、在一個(gè)實(shí)施方案中，在用含有梭菌神經(jīng)毒素的溶液對(duì)膀胱進(jìn)行輕壓灌注后，膀胱疼痛至少減輕3個(gè)月、4個(gè)月、5個(gè)月或6個(gè)月，優(yōu)選至少7個(gè)月，更優(yōu)選至少8個(gè)月(例如至少9個(gè)月)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在用含有梭菌神經(jīng)毒素的溶液對(duì)膀胱進(jìn)行輕壓灌注后，膀胱疼痛減輕小于或等于14個(gè)月、13個(gè)月或12個(gè)月，優(yōu)選小于或等于11個(gè)月，更優(yōu)選小于或等于10個(gè)月(例如小于或等于9個(gè)月)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在用含有梭菌神經(jīng)毒素的溶液對(duì)膀胱進(jìn)行輕壓灌注后，膀胱疼痛在6-14個(gè)月或7-13個(gè)月減輕，優(yōu)選在8-12個(gè)月減輕，更優(yōu)選在9-11個(gè)月減輕(例如小于或等于9個(gè)月)。

46、一種可能代表膀胱疼痛綜合癥的疼痛類型是異常性疼痛。異常性疼痛意味著“其他疼痛”。它是一種由通常不會(huì)引起疼痛的刺激導(dǎo)致的疼痛?；加小坝|覺(jué)”異常性疼痛(也稱為靜態(tài)觸覺(jué)異常性疼痛或機(jī)械性異常性疼痛)的患者在休息時(shí)可能會(huì)感到疼痛，例如腹部疼痛、壓力和壓痛，或者在排尿時(shí)感到疼痛。因此，異常性疼痛被認(rèn)為是“由通常不會(huì)引起疼痛的刺激導(dǎo)致的疼痛”，與痛覺(jué)過(guò)敏不同。

47、本文所用的術(shù)語(yǔ)“痛覺(jué)過(guò)敏”是指對(duì)通常會(huì)引起疼痛的刺激產(chǎn)生增強(qiáng)的疼痛反應(yīng)。組織或神經(jīng)損傷可誘導(dǎo)痛覺(jué)過(guò)敏，導(dǎo)致患者對(duì)疼痛的感知增加。損傷誘導(dǎo)的痛覺(jué)過(guò)敏可分為兩種亞型：原發(fā)性痛覺(jué)過(guò)敏(導(dǎo)致在損傷局部部位的疼痛感知增加)和繼發(fā)性痛覺(jué)過(guò)敏(在遠(yuǎn)離損傷部位的身體其他部位感知到疼痛)。

48、因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，膀胱疼痛包括異常性疼痛或痛覺(jué)過(guò)敏。

49、在一個(gè)實(shí)施方案中，使用本發(fā)明的方法給予梭菌神經(jīng)毒素后，患者的痛覺(jué)閾值增加。在一個(gè)實(shí)施方案中，與未接受含有梭菌神經(jīng)毒素的溶液的患者相比，患者的痛覺(jué)閾值可能增加至少30％、40％、50％、60％、70％或80％。在一個(gè)實(shí)施方案中，與未接受含有梭菌神經(jīng)毒素的溶液的患者相比，患者的痛覺(jué)閾值可能增加30-100％、40-90％、50-80％或60-70％。

50、術(shù)語(yǔ)“痛覺(jué)閾值”是指患者感知疼痛所需的有害刺激水平。

51、下面提供了本發(fā)明所涵蓋的梭菌神經(jīng)毒素的更多詳細(xì)信息，以及技術(shù)背景信息。

52、梭菌屬中的細(xì)菌會(huì)產(chǎn)生高效且特異性的蛋白質(zhì)毒素，這些毒素可以毒害神經(jīng)元以及其他它們所作用到的細(xì)胞。這類梭菌神經(jīng)毒素的例子包括破傷風(fēng)桿菌(c.tetani)產(chǎn)生的神經(jīng)毒素(tent)、肉毒桿菌(c.botulinum)血清型a-g和x產(chǎn)生的神經(jīng)毒素(見(jiàn)wo?2018/009903?a2)，以及由巴氏梭菌(c.baratii)和丁酸梭菌(c.butyricum)產(chǎn)生的神經(jīng)毒素。

53、梭菌神經(jīng)毒素是已知的一些最強(qiáng)大的毒素之一。例如，肉毒桿菌神經(jīng)毒素對(duì)小鼠的半數(shù)致死劑量(ld50)值因血清型而異，范圍為0.5至5ng/kg。破傷風(fēng)毒素和肉毒桿菌神經(jīng)毒素均通過(guò)抑制受影響神經(jīng)元的功能發(fā)揮作用，具體來(lái)說(shuō)是抑制神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。肉毒桿菌毒素作用于神經(jīng)肌肉接頭，抑制外周神經(jīng)系統(tǒng)中的膽堿能傳遞，而破傷風(fēng)毒素則作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。

54、在自然界中，梭菌神經(jīng)毒素最初被合成為單鏈多肽，在翻譯后通過(guò)蛋白水解切割事件進(jìn)行修飾，形成由二硫鍵連接在一起的兩條多肽鏈。切割發(fā)生在一個(gè)特定的切割位點(diǎn)，通常稱為激活位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于形成鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基之間。正是這種雙鏈形式才是毒素的活性形式。這兩條鏈分別被稱為重鏈(h鏈)，其分子量約為100kda，以及輕鏈(l鏈)，其分子量約為50kda。h鏈包含一個(gè)n端轉(zhuǎn)運(yùn)組件(hn結(jié)構(gòu)域)和一個(gè)c端靶向組件(hc結(jié)構(gòu)域)。切割位點(diǎn)位于l鏈和易位結(jié)構(gòu)域組件之間。在hc結(jié)構(gòu)域與靶神經(jīng)元結(jié)合并且結(jié)合的毒素通過(guò)內(nèi)體被內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞后，hn結(jié)構(gòu)域?qū)鏈轉(zhuǎn)運(yùn)穿過(guò)內(nèi)體膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，l鏈則提供蛋白酶功能(也稱為非細(xì)胞毒性蛋白酶)。

55、非細(xì)胞毒性蛋白酶通過(guò)蛋白水解切割一種稱為snare蛋白(例如snap-25、vamp或syntaxin)的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白發(fā)揮作用-見(jiàn)gerald?k(2002年)《cell?and?molecularbiology》(第4版，john?wiley&sons,inc.)。snare這個(gè)縮寫(xiě)詞來(lái)源于“可溶性n-乙基馬來(lái)酰亞胺敏感因子附著受體”，其中nsf表示乙基馬來(lái)酰亞胺敏感因子。snare蛋白對(duì)于細(xì)胞內(nèi)囊泡融合至關(guān)重要，因此對(duì)于通過(guò)囊泡運(yùn)輸從細(xì)胞中分泌分子也至關(guān)重要。蛋白酶功能是一種鋅依賴性內(nèi)肽酶活性，對(duì)snare蛋白具有高度的底物特異性。因此，一旦被遞送到所需的靶細(xì)胞，非細(xì)胞毒性蛋白酶就能夠抑制靶細(xì)胞的細(xì)胞分泌。梭菌神經(jīng)毒素的l鏈蛋白酶就是能夠切割snare蛋白的非細(xì)胞毒性蛋白酶。

56、鑒于snare蛋白的普遍存在，諸如肉毒桿菌神經(jīng)毒素等梭菌神經(jīng)毒素已成功應(yīng)用于廣泛的治療領(lǐng)域。

57、例如，william?j.lipham在《cosmetic?and?clinical?applications?ofbotulinum?toxin》(slack,inc.,2004年)中描述了使用梭菌神經(jīng)毒素，如肉毒桿菌神經(jīng)毒素(bonts)、bont/a、bont/b、bont/c1、bont/d、bont/e、bont/f和bont/g，以及破傷風(fēng)神經(jīng)毒素(tent)，在多種治療和美容應(yīng)用中抑制神經(jīng)元傳遞-例如，botoxtm目前已被批準(zhǔn)用于以下治療適應(yīng)癥：治療疼痛(見(jiàn)美國(guó)專利6,869,610；6,641,820；6,464,986和6,113,915)；治療肌肉損傷(見(jiàn)美國(guó)專利6,423,319)；治療竇性頭痛(見(jiàn)美國(guó)專利6,838,434)；治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如帕金森病(見(jiàn)美國(guó)專利6,620,415；6,306,403)以及治療神經(jīng)精神疾病(見(jiàn)美國(guó)專利申請(qǐng)2004/0180061；2003/0211121)。上述所有出版物均通過(guò)引用整體并入本文。

58、肉毒桿菌神經(jīng)毒素(bont)由肉毒桿菌以大蛋白復(fù)合物的形式產(chǎn)生，該復(fù)合物由bont本身與一些輔助蛋白復(fù)合而成。目前存在九種不同類別的肉毒桿菌神經(jīng)毒素，即：肉毒桿菌神經(jīng)毒素血清型a、b、c1、d、e、f、g、h和x，它們都具有相似的結(jié)構(gòu)和作用方式。不同的bont血清型可以通過(guò)特定的中和抗血清的滅活作用來(lái)區(qū)分，這種按血清型的分類與氨基酸水平的序列同一性百分比相關(guān)。給定血清型的bont蛋白還會(huì)根據(jù)氨基酸百分比序列同一性進(jìn)一步細(xì)分為不同的亞型。

59、bonts可在胃腸道被吸收，進(jìn)入血液循環(huán)后，會(huì)與膽堿能神經(jīng)末梢的突觸前膜結(jié)合，阻止神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的釋放。bont/b、bont/d、bont/f和bont/g會(huì)切割突觸小泡相關(guān)膜蛋白(synaptobrevin/vamp)；bont/c1、bont/a?和bont/e會(huì)切割25kda的突觸體相關(guān)蛋白(snap-25)；而bont/c1還會(huì)切割syntaxin。bont/x已被發(fā)現(xiàn)可切割snap-25、vamp1、vamp2、vamp3、vamp4、vamp5、ykt6和syntaxin?1。

60、破傷風(fēng)毒素由破傷風(fēng)桿菌產(chǎn)生，只有一種血清型。丁酸梭菌產(chǎn)生bont/e，而巴氏梭菌產(chǎn)生bont/f。

61、盡管存在這些差異，但bont/a仍是治療中首選的血清型，市場(chǎng)上有三種常見(jiàn)的商業(yè)制劑(和)，而目前市場(chǎng)上只有一種bont/b產(chǎn)品時(shí)至今日，這些從梭菌菌株中純化的bont/a和bont/b產(chǎn)品，是目前監(jiān)管機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)用于人類的僅有的兩種bont血清型，其應(yīng)用范圍包括但不限于痙攣、膀胱功能障礙或多汗癥(針對(duì)bont/a)(例如，見(jiàn)https://www.medicines.org.uk/emc/medicine/112，https://www.medicines.org.uk/emc/medicine/870，https://www.medicines.org.uk/emc/medicine/2162，這些內(nèi)容均通過(guò)引用整體并入本文)以及頸部肌張力障礙(針對(duì)bont/b)(例如，見(jiàn)https://www.medicines.org.uk/emc/medicine/20568，該內(nèi)容通過(guò)引用整體并入本文)。

62、與細(xì)胞毒性蛋白酶(例如蓖麻毒素、白喉毒素、假單胞菌外毒素)不同，細(xì)胞毒性蛋白酶通過(guò)殺死其天然靶細(xì)胞發(fā)揮作用，而梭菌神經(jīng)毒素是非細(xì)胞毒性蛋白酶，通過(guò)暫時(shí)使天然靶細(xì)胞的細(xì)胞功能喪失來(lái)發(fā)揮作用。重要的是，非細(xì)胞毒性蛋白酶不會(huì)殺死它所作用的天然靶細(xì)胞。除了梭菌神經(jīng)毒素(例如以dysporttm、neurobloctm和botoxtm等名稱銷售的肉毒桿菌神經(jīng)毒素)之外，一些最知名的非細(xì)胞毒性蛋白酶例子包括iga蛋白酶(例如，見(jiàn)wo99/032272)和antarease蛋白酶(例如，見(jiàn)wo2011/022357)。

63、術(shù)語(yǔ)“梭菌神經(jīng)毒素”涵蓋由梭菌屬細(xì)菌產(chǎn)生的任何能夠進(jìn)入神經(jīng)元并抑制神經(jīng)遞質(zhì)釋放的多肽，以及通過(guò)重組技術(shù)或化學(xué)技術(shù)產(chǎn)生的此類多肽。就本發(fā)明而言，該術(shù)語(yǔ)包括上述功能等效的非細(xì)胞毒性蛋白酶。優(yōu)選地，梭菌神經(jīng)毒素是肉毒桿菌神經(jīng)毒素(bont)。

64、bont/a?神經(jīng)毒素氨基酸序列的一個(gè)實(shí)例由seq?id?no:2編碼，其核苷酸序列如seq?id?no:1所示。bont/b神經(jīng)毒素氨基酸序列的一個(gè)示例如seq?id?no:3所示(uniprot登錄號(hào)b1inp5)。bont/c神經(jīng)毒素氨基酸序列的一個(gè)示例如seq?id?no:4所示(uniprot登錄號(hào)p18640)。bont/d神經(jīng)毒素氨基酸序列的一個(gè)示例如seq?id?no:5所示(uniprot登錄號(hào)p19321)。bont/e神經(jīng)毒素氨基酸序列的一個(gè)示例如seq?id?no:6所示(登錄號(hào)wp_003372387)。bont/f神經(jīng)毒素氨基酸序列的一個(gè)示例如seq?id?no:7所示(uniprot登錄號(hào)q57236)或如seq?id?no:8所示(uniprot/uniparc登錄號(hào)upi0001de3dac)。bont/g神經(jīng)毒素氨基酸序列的一個(gè)示例如seq?id?no:9所示(登錄號(hào)wp_039635782)。bont/d-c神經(jīng)毒素氨基酸序列的一個(gè)示例如seq?id?no:10所示(登錄號(hào)bam65681)。bont/x神經(jīng)毒素氨基酸序列的一個(gè)示例如seq?id?no:12所示(登錄號(hào)baq12790.1)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所選用的bont是bont/a，例如野生型bont/a。

65、本文所用的術(shù)語(yǔ)“hc結(jié)構(gòu)域”是指神經(jīng)毒素重鏈中一個(gè)功能上獨(dú)特的區(qū)域，其分子量約為50kda，能夠使神經(jīng)毒素結(jié)合到靶細(xì)胞表面的受體上。hc結(jié)構(gòu)域由兩個(gè)結(jié)構(gòu)上不同的亞結(jié)構(gòu)域組成，即“hcn亞結(jié)構(gòu)域”(hc結(jié)構(gòu)域的n端部分)和“hcc亞結(jié)構(gòu)域”(hc結(jié)構(gòu)域的c端部分)，每個(gè)亞結(jié)構(gòu)域的分子量約為25kda。

66、本文所用的術(shù)語(yǔ)“l(fā)hn結(jié)構(gòu)域”是指一種不含hc結(jié)構(gòu)域的神經(jīng)毒素，它由一個(gè)內(nèi)肽酶結(jié)構(gòu)域(“l(fā)”或“輕鏈”)和負(fù)責(zé)將內(nèi)肽酶轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中的結(jié)構(gòu)域(重鏈的hn結(jié)構(gòu)域)組成。

67、如前所述，梭菌神經(jīng)毒素由兩條多肽鏈形成，重鏈(h鏈)分子量約為100kda，輕鏈(l鏈)分子量約為50kda。h鏈包含一個(gè)c端靶向組件(受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或hc結(jié)構(gòu)域)和一個(gè)n端轉(zhuǎn)運(yùn)組件(hn結(jié)構(gòu)域)。

68、輕鏈參考序列的示例包括：

69、·肉毒桿菌a型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基1-448

70、·肉毒桿菌b型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基1-440

71、·肉毒桿菌c1型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基1-441

72、·肉毒桿菌d型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基1-445

73、·肉毒桿菌e型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基1-422

74、·肉毒桿菌f型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基1-439

75、·肉毒桿菌g型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基1-441

76、·破傷風(fēng)神經(jīng)毒素：氨基酸殘基1-457

77、對(duì)于最近發(fā)現(xiàn)的bont/x，其l鏈據(jù)報(bào)道對(duì)應(yīng)于其中的氨基酸1-439，l鏈邊界可能會(huì)有大約25個(gè)氨基酸的差異(例如1-414或1-464)。

78、上述確定的參考序列應(yīng)被視為指導(dǎo)，因?yàn)楦鶕?jù)亞型可能會(huì)有輕微變化。例如，美國(guó)專利申請(qǐng)2007/0166332(通過(guò)引用整體并入本文)引用了略有不同的梭菌序列：

79、·肉毒桿菌a型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基m1-k448

80、·肉毒桿菌b型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基m1-k441

81、·肉毒桿菌c1型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基m1-k449

82、·肉毒桿菌d型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基m1-r445

83、·肉毒桿菌e型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基m1-r422

84、·肉毒桿菌f型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基m1-k439

85、·肉毒桿菌g型神經(jīng)毒素：氨基酸殘基m1-k446

86、·破傷風(fēng)神經(jīng)毒素：氨基酸殘基m1-a457

87、術(shù)語(yǔ)“激活環(huán)”是指包含蛋白水解切割位點(diǎn)的多肽結(jié)構(gòu)域。神經(jīng)毒素的激活環(huán)在本領(lǐng)域已有描述，例如在wo2016156113(通過(guò)引用整體并入本文)中。

88、在一個(gè)實(shí)施方案中，梭菌神經(jīng)毒素由具有與seq?id?no:2、seq?id?no:3、seq?idno:4、seq?id?no:5、seq?id?no:6、seq?id?no:7、seq?id?no:8、seq?id?no:9、seq?id?no:10或seq?id?no:12中任一個(gè)至少70％，優(yōu)選至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列組成，或包含這樣的氨基酸序列。

89、在一個(gè)實(shí)施方案中，梭菌神經(jīng)毒素由具有與seq?id?no:2至少70％，優(yōu)選至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列組成，或包含這樣的氨基酸序列。

90、在一個(gè)實(shí)施方案中，梭菌神經(jīng)毒素由seq?id?no:2的氨基酸序列組成(例如bont/a)，或包含該氨基酸序列。

91、術(shù)語(yǔ)“梭菌神經(jīng)毒素”還旨在涵蓋修飾的梭菌神經(jīng)毒素及其衍生物，包括但不限于以下所述的那些。與梭菌神經(jīng)毒素的天然(未修飾)形式相比，修飾的梭菌神經(jīng)毒素或衍生物可能包含一個(gè)或多個(gè)經(jīng)過(guò)修飾的氨基酸，或者可能包含一個(gè)或多個(gè)在天然(未修飾)形式中不存在的插入氨基酸。例如，修飾的梭菌神經(jīng)毒素相對(duì)于天然(未修飾)梭菌神經(jīng)毒素序列，可能在一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域中具有修飾的氨基酸序列。這些修飾可改變毒素的功能特性，例如生物活性或持久性。

92、一種優(yōu)選的修飾的bont/a包含在一個(gè)或多個(gè)選自以下的氨基酸殘基處的修飾：asn?886、asn?905、gln?915、asn?918、glu?920、asn?930、asn?954、ser?955、gln?991、glu992、gln?995、asn?1006、asn?1025、asn?1026、asn?1032、asn?1043、asn?1046、asn?1052、asp?1058、his1064、asn?1080、glu?1081、glu?1083、asp?1086、asn?1188、asp?1213、gly1215、asn?1216、gln?1229、asn?1242、asn?1243、ser?1274和thr?1277。與已知的bont/a相比，這種修飾的bont/a顯示出副作用減少或沒(méi)有副作用。本發(fā)明的修飾的bont/a增加的組織保留特性還提供了更高的效力和/或更長(zhǎng)的作用持續(xù)時(shí)間，并且與已知的梭菌毒素治療劑相比，可以使用更低的劑量(或者在不產(chǎn)生任何額外不良影響的情況下使用更高的劑量)，從而提供了進(jìn)一步的優(yōu)勢(shì)。

93、所述修飾是與如seq?id?no:2所示的未修飾的bont/a相比的修飾，其中氨基酸殘基編號(hào)是通過(guò)與seq?id?no:2比對(duì)確定的。由于seq?id?no:2(以及本文所述的修飾的bont/a多肽對(duì)應(yīng)的seq?id?nos)中位置1處的甲硫氨酸殘基是可選的，本領(lǐng)域技術(shù)人員在確定氨基酸殘基編號(hào)時(shí)將考慮甲硫氨酸殘基的存在與否。例如，如果seq?id?no:2包含甲硫氨酸，則位置編號(hào)將如上述定義(例如asn?886將是seq?id?no:2中的asn?886)?；蛘?，如果seq?idno:2中不存在甲硫氨酸，則氨基酸殘基編號(hào)應(yīng)調(diào)整為減1(例如asn?886將是seq?id?no:2中的asn?885)。當(dāng)本文所述的其他多肽序列中位置1處的甲硫氨酸存在/不存在時(shí)，也有類似的考慮，本領(lǐng)域技術(shù)人員將使用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)容易地確定正確的氨基酸殘基編號(hào)。

94、所指示的用于修飾的氨基酸殘基是表面暴露的氨基酸殘基。

95、一種修飾的bont/a可包含在一個(gè)或多個(gè)選自以下的氨基酸殘基處的修飾：asn886、asn?930、asn?954、ser?955、gln?991、asn?1025、asn?1026、asn?1052、asn?1188、asp1213、gly?1215、asn?1216、gln?1229、asn?1242、asn?1243、ser?1274和thr?1277。所述修飾的bont/a可由與選自seq?id?nos:13、15、17和19的核酸序列具有至少70％序列同一性的核酸序列編碼。例如，與選自seq?id?nos:13、15、17和19的核酸序列具有至少80％、90％、95％或99.9％序列同一性的核酸序列。優(yōu)選地，用于本發(fā)明的修飾的bont/a可由包含(或由......組成)seq?id?no:13、15、17和19。

96、優(yōu)選地，用于本發(fā)明的修飾的bont/a可由包含(或由......組成)seq?id?no:13、15、17和19的核酸序列編碼。所述修飾的bont/a可包含與選自seq?id?nos:14、16、18和20的多肽序列具有至少70％序列同一性的多肽序列。例如，與選自seq?id?nos:14、16、18和20的多肽序列具有至少80％、90％、95％或99.9％序列同一性的多肽序列。更優(yōu)選地，用于本發(fā)明的修飾的bont/a?可包含(更優(yōu)選由......組成)選自seq?id?nos:14、16、18和20的多肽序列。

97、當(dāng)在修飾的bont/a的上下文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基”優(yōu)選是指至少2、3、4、5、6或7個(gè)所指示的氨基酸殘基。因此，修飾的bont/a可在指示的氨基酸殘基處包含至少2、3、4、5、6或7(優(yōu)選7)個(gè)修飾。修飾的bont/a可包含1-30、3-20或5-10個(gè)氨基酸修飾。更優(yōu)選地，當(dāng)在修飾的bont/a的上下文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基”是指所有指示的氨基酸殘基。

98、優(yōu)選地，除了在指示的氨基酸殘基處的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾之外，與seq?idno:2相比，修飾的bont/a不包含任何進(jìn)一步的氨基酸修飾。

99、最優(yōu)選地，修飾的bont/a包含(更優(yōu)選由......組成)在一個(gè)或多個(gè)選自以下的氨基酸殘基處的修飾：asn?886、asn?930、ser?955、gln?991、asn?1026、asn?1052和gln?1229。所述修飾的bont/a可由與seq?id?no:13具有至少70％序列同一性的核酸序列編碼。例如，與seq?id?no:13具有至少80％、90％、95％或99.9％序列同一性的核酸序列。優(yōu)選地，用于本發(fā)明的修飾的bont/a可由包含(或由......組成)seq?id?no:13的核酸序列編碼。所述修飾的bont/a可包含與seq?id?no:14具有至少70％序列同一性的多肽序列。例如，與seq?idno:14具有至少80％、90％、95％或99.9％序列同一性的多肽序列。更優(yōu)選地，用于本發(fā)明的修飾的bont/a?可包含(更優(yōu)選由......組成)seq?id?no:14。

100、所述修飾可選自：

101、i.用堿性氨基酸殘基替換酸性表面暴露氨基酸殘基；

102、ii.用不帶電氨基酸殘基替換酸性表面暴露氨基酸殘基；

103、iii.用堿性氨基酸殘基替換不帶電表面暴露氨基酸殘基；

104、iv.插入堿性氨基酸殘基；以及

105、v.刪除酸性表面暴露氨基酸殘基。

106、上述修飾導(dǎo)致與相應(yīng)的未修飾的bont/a相比，修飾的bont/a具有增加的表面正電荷和增加的等電點(diǎn)。

107、等電點(diǎn)(pi)是給定蛋白質(zhì)的一種特定屬性。如本領(lǐng)域眾所周知的，蛋白質(zhì)由特定的氨基酸序列組成(在蛋白質(zhì)中也稱為氨基酸殘基)。標(biāo)準(zhǔn)的二十種氨基酸中的每一種都有不同的側(cè)鏈(或r基團(tuán))，這意味著蛋白質(zhì)中的每個(gè)氨基酸殘基都表現(xiàn)出不同的化學(xué)性質(zhì)，如電荷和疏水性。這些性質(zhì)可能會(huì)受到周圍化學(xué)環(huán)境的影響，如溫度和ph值。蛋白質(zhì)的整體化學(xué)特性將取決于這些各種因素的總和。

108、某些氨基酸殘基(如下所述)具有可離子化的側(cè)鏈，其可能根據(jù)周圍的ph值顯示出電荷。在給定的ph值下，這樣的側(cè)鏈?zhǔn)欠駧щ娙Q于相關(guān)可離子化基團(tuán)的pka，其中pka是共軛堿中特定質(zhì)子的酸解離常數(shù)(ka)的負(fù)對(duì)數(shù)。

109、例如，酸性殘基如天冬氨酸和谷氨酸具有側(cè)鏈羧酸基團(tuán)，其pka值約為4.1(精確的pka值可能取決于溫度、離子強(qiáng)度和可離子化基團(tuán)的微環(huán)境)。因此，在ph值為7.4(通常稱為“生理ph”)時(shí)，這些側(cè)鏈帶有負(fù)電荷。在低ph值下，這些側(cè)鏈將被質(zhì)子化并失去電荷。

110、相反，堿性殘基如賴氨酸和精氨酸具有含氮的側(cè)鏈基團(tuán)，其pka值約為10-12。因此，在ph值為7.4時(shí)，這些側(cè)鏈帶有正電荷。在高ph值下，這些側(cè)鏈將去質(zhì)子化并失去電荷。

111、因此，蛋白質(zhì)分子的整體(凈)電荷取決于蛋白質(zhì)中存在的酸性和堿性殘基的數(shù)量(及其表面暴露程度)以及周圍的ph值。改變周圍的ph值會(huì)改變蛋白質(zhì)的整體電荷。因此，對(duì)于每種蛋白質(zhì)，都存在一個(gè)特定的ph值，在該ph值下，正電荷和負(fù)電荷的數(shù)量相等，蛋白質(zhì)顯示出沒(méi)有整體凈電荷。這個(gè)點(diǎn)被稱為等電點(diǎn)(pi)。等電點(diǎn)是蛋白質(zhì)生物化學(xué)中的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)概念，本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)此應(yīng)該很熟悉。

112、等電點(diǎn)(pi)因此被定義為蛋白質(zhì)顯示凈電荷為零的ph值。pi值的增加意味著需要更高的ph值才能使蛋白質(zhì)顯示凈電荷為零。因此，pi值的增加代表在給定ph值下蛋白質(zhì)凈正電荷的增加。相反，pi值的降低意味著需要更低的ph值才能使蛋白質(zhì)顯示凈電荷為零。因此，pi值的降低代表在給定ph值下蛋白質(zhì)凈正電荷的減少。

113、測(cè)定蛋白質(zhì)pi值的方法在本領(lǐng)域是已知的，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該很熟悉。例如，蛋白質(zhì)的pi值可以根據(jù)蛋白質(zhì)中存在的每個(gè)氨基酸的平均pka值來(lái)計(jì)算(“pi計(jì)算值”)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行此類計(jì)算，例如expasy的compute?pi/mw?tool(https://web.expasy.org/compute_pi/)，這是根據(jù)本發(fā)明計(jì)算pi值的優(yōu)選方法。不同分子之間pi值的比較應(yīng)該使用相同的計(jì)算技術(shù)/程序進(jìn)行。

114、在適當(dāng)?shù)那闆r下，可以使用等電聚焦技術(shù)(“pi觀測(cè)值”)通過(guò)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)蛋白質(zhì)的計(jì)算pi值。該技術(shù)使用電泳根據(jù)蛋白質(zhì)的pi值分離蛋白質(zhì)。等電聚焦通常使用具有固定ph梯度的凝膠進(jìn)行。當(dāng)施加電場(chǎng)時(shí)，蛋白質(zhì)在ph梯度中遷移，直到它到達(dá)其凈電荷為零的ph值，這個(gè)點(diǎn)就是蛋白質(zhì)的pi值。等電聚焦提供的結(jié)果通常在本質(zhì)上是相對(duì)低分辨率的，因此本發(fā)明人認(rèn)為使用上述計(jì)算pi值(如所描述的)提供的結(jié)果更適合使用。

115、在本說(shuō)明書(shū)中，除非另有說(shuō)明，“pi”是指“pi計(jì)算值”。

116、蛋白質(zhì)的pi值可以通過(guò)改變其表面顯示的堿性和/或酸性基團(tuán)的數(shù)量來(lái)增加或降低。這可以通過(guò)修飾蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸來(lái)實(shí)現(xiàn)。例如，可以通過(guò)減少酸性殘基的數(shù)量或增加堿性殘基的數(shù)量來(lái)提高pi值。

117、本發(fā)明的修飾的bont/a的pi值可能比未修飾的bont/a(例如seq?id?no:2)的pi值高至少0.2、0.4、0.5或1個(gè)pi單位。優(yōu)選地，修飾的bont/a的pi值至少為6.6，例如至少為6.8。

118、20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的特性如下表所示：

119、 氨基酸 側(cè)鏈 天冬氨酸 asp d 帶電荷(酸性) 谷氨酸 glu e 帶電荷(酸性) 精氨酸 arg r 帶電荷(堿性) 賴氨酸 lys k 帶電荷(堿性) 組氨酸 his h 不帶電(極性) 天冬酰胺 asn n 不帶電(極性) 谷氨酰胺 gln q 不帶電(極性) 絲氨酸 ser s 不帶電(極性) 蘇氨酸 thr t 不帶電(極性) 酪氨酸 tyr y 不帶電(極性) 甲硫氨酸 met m 不帶電(極性) 色氨酸 trp w 不帶電(極性) 半胱氨酸 cys c 不帶電(極性) 丙氨酸 ala a 不帶電(疏水) 甘氨酸 gly g 不帶電(疏水) 纈氨酸 val v 不帶電(疏水) 亮氨酸 leu l 不帶電(疏水) 異亮氨酸 ile i 不帶電(疏水) 脯氨酸 pro p 不帶電(疏水) 苯丙氨酸 phe f 不帶電(疏水)

120、以下氨基酸被認(rèn)為是帶電荷的氨基酸：天冬氨酸(負(fù)電荷)、谷氨酸(負(fù)電荷)、精氨酸(正電荷)和賴氨酸(正電荷)。

121、在ph值為7.4時(shí)，天冬氨酸(pka?3.1)和谷氨酸(pka?4.1)的側(cè)鏈帶有負(fù)電荷，而精氨酸(pka?12.5)和賴氨酸(pka?10.8)的側(cè)鏈帶有正電荷。天冬氨酸和谷氨酸被稱為酸性氨基酸殘基。精氨酸和賴氨酸被稱為堿性氨基酸殘基。

122、以下氨基酸被認(rèn)為是不帶電、極性(意味著它們可以參與氫鍵形成)的氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺、組氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸和色氨酸。

123、以下氨基酸被認(rèn)為是不帶電、疏水的氨基酸：丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸和甘氨酸。

124、在氨基酸插入中，一個(gè)額外的氨基酸殘基(一個(gè)通常不存在的氨基酸殘基)被摻入到bont/a多肽序列中，從而增加了該序列中的氨基酸殘基總數(shù)。在氨基酸缺失中，一個(gè)氨基酸殘基從梭菌毒素氨基酸序列中被去除，從而減少了該序列中的氨基酸殘基總數(shù)。

125、優(yōu)選地，所述修飾是取代，其有利地保持修飾的bont/a中氨基酸殘基的數(shù)量不變。在氨基酸取代中，bont/a多肽序列中的一個(gè)氨基酸殘基被不同的氨基酸殘基取代。取代的氨基酸殘基可以是上述20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸之一。或者，在氨基酸取代中，取代的氨基酸可以是非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸(一種不屬于上述標(biāo)準(zhǔn)20種氨基酸集合的氨基酸)。例如，取代的氨基酸可以是堿性非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸，例如l-鳥(niǎo)氨酸、l-2-氨基-3-胍基丙酸，或賴氨酸、精氨酸和鳥(niǎo)氨酸的d-異構(gòu)體)。將非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸引入蛋白質(zhì)的方法在本領(lǐng)域是已知的，包括使用大腸桿菌營(yíng)養(yǎng)缺陷型表達(dá)宿主進(jìn)行重組蛋白質(zhì)合成。

126、在一個(gè)實(shí)施方案中，所述取代選自：用堿性氨基酸殘基取代酸性氨基酸殘基、用不帶電氨基酸殘基取代酸性氨基酸殘基以及用堿性氨基酸殘基取代不帶電氨基酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)所述取代是用不帶電氨基酸殘基取代酸性氨基酸殘基時(shí)，酸性氨基酸殘基被其相應(yīng)的不帶電酰胺氨基酸殘基取代(即天冬氨酸被天冬酰胺取代，谷氨酸被谷氨酰胺取代)。

127、優(yōu)選地，堿性氨基酸殘基是賴氨酸殘基或精氨酸殘基。換句話說(shuō)，所述取代是用賴氨酸或精氨酸取代。最優(yōu)選地，所述修飾是用賴氨酸取代。

128、易位結(jié)構(gòu)域是一種能夠使蛋白酶轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入靶細(xì)胞，從而使蛋白酶活性在靶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮功能的分子。任何分子(例如蛋白質(zhì)或肽)是否具有本發(fā)明所需的轉(zhuǎn)運(yùn)功能可以通過(guò)許多常規(guī)測(cè)定中的任何一種來(lái)確認(rèn)。

129、例如，shone?c.(1987年)描述了一種使用脂質(zhì)體的體外測(cè)定方法，用測(cè)試分子對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行挑戰(zhàn)。通過(guò)監(jiān)測(cè)脂質(zhì)體中k+和/或標(biāo)記的nad的釋放來(lái)確認(rèn)所需轉(zhuǎn)運(yùn)功能的存在，這可以很容易地監(jiān)測(cè)到[見(jiàn)shone?c.(1987年)eur.j.biochem；第167(1)卷：第175-180頁(yè)]。

130、blaustein?r.(1987年)提供了另一個(gè)例子，其描述了一種使用平面磷脂雙層膜的簡(jiǎn)單體外測(cè)定方法。用測(cè)試分子對(duì)膜進(jìn)行挑戰(zhàn)，通過(guò)膜的電導(dǎo)率增加來(lái)確認(rèn)所需的轉(zhuǎn)運(yùn)功能[見(jiàn)blaustein(1987年)febs?letts；第226卷，第1期：第115-120頁(yè)]。

131、《methods?in?enzymology》第220卷和221卷《membrane?fusion?techniques》的a部分和b部分(academic?press?1993年)提供了其他用于評(píng)估膜融合從而識(shí)別適用于本發(fā)明的易位結(jié)構(gòu)域的方法。

132、本發(fā)明還涵蓋變體易位結(jié)構(gòu)域，只要變體結(jié)構(gòu)域仍然顯示出所需的轉(zhuǎn)運(yùn)活性。例如，變體與參考易位結(jié)構(gòu)域可能具有至少70％，優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少95％或至少98％的氨基酸序列同源性。當(dāng)用于易位結(jié)構(gòu)域時(shí)，術(shù)語(yǔ)“片段”是指具有參考易位結(jié)構(gòu)域至少20個(gè)，優(yōu)選至少40個(gè)，更優(yōu)選至少80個(gè)，最優(yōu)選至少100個(gè)氨基酸殘基的肽。對(duì)于梭菌易位結(jié)構(gòu)域，該片段優(yōu)選具有參考易位結(jié)構(gòu)域(例如hn結(jié)構(gòu)域)至少100個(gè)，優(yōu)選至少150個(gè)，更優(yōu)選至少200個(gè)，最優(yōu)選至少250個(gè)氨基酸殘基。本發(fā)明的轉(zhuǎn)運(yùn)“片段”涵蓋基于參考序列的變體易位結(jié)構(gòu)域的片段。

133、易位結(jié)構(gòu)域優(yōu)選能夠在低ph條件下在脂質(zhì)膜中形成離子滲透孔。優(yōu)選地，已發(fā)現(xiàn)它僅使用蛋白質(zhì)分子中能夠在內(nèi)體膜中形成孔的那些部分。

134、易位結(jié)構(gòu)域可以從微生物蛋白質(zhì)來(lái)源獲得，特別是從細(xì)菌或病毒蛋白質(zhì)來(lái)源獲得。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，易位結(jié)構(gòu)域是一種酶的易位結(jié)構(gòu)域，例如細(xì)菌毒素或病毒蛋白質(zhì)的易位結(jié)構(gòu)域。

135、有充分的文獻(xiàn)記載，某些細(xì)菌毒素分子的結(jié)構(gòu)域能夠形成這樣的孔。也已知某些病毒表達(dá)的膜融合蛋白的易位結(jié)構(gòu)域能夠形成這樣的孔。這些結(jié)構(gòu)域可用于本發(fā)明。

136、易位結(jié)構(gòu)域可以源自梭菌，例如hn結(jié)構(gòu)域(或其功能組件)。hn是指梭菌神經(jīng)毒素重鏈的一部分或片段，大約相當(dāng)于重鏈的n端一半，或者是完整重鏈中與該片段對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)域。

137、合適的(參考)易位結(jié)構(gòu)域的示例包括：

138、·肉毒桿菌a型神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(449-871)

139、·肉毒桿菌b型神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(441-858)

140、·肉毒桿菌c型神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(442-866)

141、·肉毒桿菌d型神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(446-862)

142、·肉毒桿菌e型神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(423-845)

143、·肉毒桿菌f型神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(440-864)

144、·肉毒桿菌g型神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(442-863)

145、·破傷風(fēng)神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(458-879)

146、上述確定的參考序列應(yīng)被視為指導(dǎo)，因?yàn)楦鶕?jù)亞型可能會(huì)有輕微變化。例如，美國(guó)專利申請(qǐng)2007/0166332(通過(guò)引用整體并入本文)引用了略有不同的梭菌序列：

147、·肉毒桿菌a型神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(a449-k871)

148、·肉毒桿菌b型神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(a442-s858)

149、·肉毒桿菌c型神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(t450-n866)

150、·肉毒桿菌d型神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(d446-n862)

151、·肉毒桿菌e型神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(k423-k845)

152、·肉毒桿菌f型神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(a440-k864)

153、·肉毒桿菌g型神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(s447-s863)

154、·破傷風(fēng)神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(s458-v879)

155、在本發(fā)明的背景下，多種包含易位結(jié)構(gòu)域的梭菌神經(jīng)毒素hn區(qū)域可用于本發(fā)明的各個(gè)方面，前提是這些活性片段能夠促進(jìn)非細(xì)胞毒性蛋白酶(例如梭菌l鏈)從細(xì)胞內(nèi)囊泡釋放到靶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，從而參與執(zhí)行梭菌神經(jīng)毒素對(duì)底物進(jìn)行蛋白水解切割的整體細(xì)胞機(jī)制。梭菌神經(jīng)毒素重鏈的hn區(qū)域長(zhǎng)度約為410-430個(gè)氨基酸，包含一個(gè)易位結(jié)構(gòu)域。研究表明，梭菌神經(jīng)毒素重鏈的整個(gè)hn區(qū)域長(zhǎng)度對(duì)于易位結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)運(yùn)活性并非必需。因此，該實(shí)施方案的各個(gè)方面可以包括包含易位結(jié)構(gòu)域的梭菌神經(jīng)毒素hn區(qū)域，其長(zhǎng)度例如為至少350個(gè)氨基酸、至少375個(gè)氨基酸、至少400個(gè)氨基酸和至少425個(gè)氨基酸。該實(shí)施方案的其他方面可以包括包含易位結(jié)構(gòu)域的梭菌神經(jīng)毒素hn區(qū)域，其長(zhǎng)度例如為至多350個(gè)氨基酸、至多375個(gè)氨基酸、至多400個(gè)氨基酸和至多425個(gè)氨基酸。

156、有關(guān)肉毒桿菌和破傷風(fēng)桿菌產(chǎn)生毒素的遺傳基礎(chǔ)的更多詳細(xì)信息，請(qǐng)參考henderson等人(1997年)發(fā)表于academic?press的文章《the?clostridia:molecularbiology?and?pathogenesis》。

157、術(shù)語(yǔ)hn涵蓋天然存在的神經(jīng)毒素hn部分，以及具有天然不存在的氨基酸序列和/或合成氨基酸殘基的修飾hn部分，只要修飾的hn部分仍然顯示出上述轉(zhuǎn)運(yùn)功能。

158、或者，易位結(jié)構(gòu)域可以源自非梭菌。非梭菌(參考)易位結(jié)構(gòu)域來(lái)源的示例包括但不限于：白喉毒素的易位結(jié)構(gòu)域[o’keefe等人，proc.natl.acad.sci.usa(1992年)89,6202-6206；silverman等人，j.biol.chem.(1993年)269,22524-22532；以及l(fā)ondon,e.(1992年)biochem.biophys.acta.,1112,第25-51頁(yè)]，假單胞菌外毒素a的易位結(jié)構(gòu)域[prior等人，biochemistry(1992年)31,3555-3559]，炭疽毒素的易位結(jié)構(gòu)域[blanke等人，proc.natl.acad.sci.usa(1996年)93,8437-8442]，多種具有轉(zhuǎn)運(yùn)功能的融合或疏水肽[plank等人，j.biol.chem.(1994年)269,12918-12924；以及wagner等人(1992年)pnas,89,第7934-7938頁(yè)]，以及兩親性肽[murata等人(1992年)biochem.,31,第1986-1992頁(yè)]。易位結(jié)構(gòu)域可以與天然存在的蛋白質(zhì)中存在的易位結(jié)構(gòu)域相似，或者可以包括氨基酸變化，只要這些變化不會(huì)破壞易位結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)運(yùn)能力。

159、梭菌神經(jīng)毒素hc結(jié)構(gòu)域參考序列的示例包括：

160、·bont/a-n872-l1296

161、·bont/b-e859-e1291

162、·bont/c1-n867-e1291

163、·bont/d-s863-e1276

164、·bont/e-r846-k1252

165、·bont/f-k865-e1274

166、·bont/g-n864-e1297

167、·tent-i880-d1315

168、對(duì)于最近發(fā)現(xiàn)的bont/x，hc結(jié)構(gòu)域據(jù)報(bào)道對(duì)應(yīng)于其中的氨基酸893-1306，結(jié)構(gòu)域邊界可能會(huì)有大約25個(gè)氨基酸的差異(例如868-1306或918-1306)。

169、本文所述的梭菌神經(jīng)毒素還可包含轉(zhuǎn)運(yùn)促進(jìn)結(jié)構(gòu)域。所述結(jié)構(gòu)域有助于將非細(xì)胞毒性蛋白酶遞送到靶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，例如在wo?08/008803和wo?08/008805中有所描述，這兩篇文獻(xiàn)均通過(guò)引用整體并入本文。

170、例如，合適的轉(zhuǎn)運(yùn)促進(jìn)結(jié)構(gòu)域包括包膜病毒融合肽結(jié)構(gòu)域，例如，合適的融合肽結(jié)構(gòu)域包括流感病毒融合肽結(jié)構(gòu)域(例如23個(gè)氨基酸的甲型流感病毒融合肽結(jié)構(gòu)域)、甲病毒融合肽結(jié)構(gòu)域(例如26個(gè)氨基酸的辛德畢斯森林病毒融合肽結(jié)構(gòu)域)、水泡性口炎病毒融合肽結(jié)構(gòu)域(例如21個(gè)氨基酸的水泡性口炎病毒融合肽結(jié)構(gòu)域)、呼吸道病毒融合肽結(jié)構(gòu)域(例如25個(gè)氨基酸的仙臺(tái)病毒融合肽結(jié)構(gòu)域)、麻疹病毒融合肽結(jié)構(gòu)域(例如25個(gè)氨基酸的犬瘟熱病毒融合肽結(jié)構(gòu)域)、禽副粘病毒融合肽結(jié)構(gòu)域(例如25個(gè)氨基酸的新城疫病毒融合肽結(jié)構(gòu)域)、亨尼帕病毒融合肽結(jié)構(gòu)域(例如25個(gè)氨基酸的亨德拉病毒融合肽結(jié)構(gòu)域)、偏肺病毒融合肽結(jié)構(gòu)域(例如25個(gè)氨基酸的人偏肺病毒融合肽結(jié)構(gòu)域)或泡沫病毒融合肽結(jié)構(gòu)域，如猴泡沫病毒融合肽結(jié)構(gòu)域；或其片段或變體。

171、再例如，轉(zhuǎn)位促進(jìn)結(jié)構(gòu)域可包含梭菌神經(jīng)毒素hcn結(jié)構(gòu)域或其片段或變體。更詳細(xì)地說(shuō)，梭菌神經(jīng)毒素hcn轉(zhuǎn)位促進(jìn)結(jié)構(gòu)域的長(zhǎng)度可能至少為200個(gè)氨基酸、至少225個(gè)氨基酸、至少250個(gè)氨基酸、至少275個(gè)氨基酸。在這方面，梭菌神經(jīng)毒素hcn轉(zhuǎn)位促進(jìn)結(jié)構(gòu)域的長(zhǎng)度優(yōu)選至多為200個(gè)氨基酸、至多225個(gè)氨基酸、至多250個(gè)氨基酸或至多275個(gè)氨基酸。具體(參考)示例包括：

172、·a型肉毒神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(872-1110)

173、·b型肉毒神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(859-1097)

174、·c型肉毒神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(867-1111)

175、·d型肉毒神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(863-1098)

176、·e型肉毒神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(846-1085)

177、·f型肉毒神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(865-1105)

178、·g型肉毒神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(864-1105)

179、·破傷風(fēng)神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(880-1127)

180、上述序列位置可能會(huì)根據(jù)血清型/亞型略有不同，其他合適的(參考)梭菌神經(jīng)毒素hcn結(jié)構(gòu)域示例包括：

181、·a型肉毒神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(874-1110)

182、·b型肉毒神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(861-1097)

183、·c型肉毒神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(869-1111)

184、·d型肉毒神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(865-1098)

185、·e型肉毒神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(848-1085)

186、·f型肉毒神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(867-1105)

187、·g型肉毒神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(866-1105)

188、·破傷風(fēng)神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(882-1127)

189、上述任何一種促進(jìn)結(jié)構(gòu)域都可以與本發(fā)明中適用的任何一種先前提到的轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域肽段相結(jié)合。因此，舉例來(lái)說(shuō)，非梭菌屬促進(jìn)結(jié)構(gòu)域可以與非梭菌屬轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域肽段或梭菌屬轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域肽段相結(jié)合?；蛘?，梭菌神經(jīng)毒素hcn轉(zhuǎn)位促進(jìn)結(jié)構(gòu)域可以與非梭菌屬轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域肽段相結(jié)合。又或者，梭菌神經(jīng)毒素hcn促進(jìn)結(jié)構(gòu)域可以與梭菌屬轉(zhuǎn)位結(jié)構(gòu)域肽段相結(jié)合，示例如下：

190、·a型肉毒神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(449-1110)

191、·b型肉毒神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(442-1097)

192、·c型肉毒神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(450-1111)

193、·d型肉毒神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(446-1098)

194、·e型肉毒神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(423-1085)

195、·f型肉毒神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(440-1105)

196、·g型肉毒神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(447-1105)

197、·破傷風(fēng)神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(458-1127)

198、天然梭菌神經(jīng)毒素的hc肽包含約400-440個(gè)氨基酸殘基，由兩個(gè)功能不同的結(jié)構(gòu)域組成，每個(gè)結(jié)構(gòu)域約25kda，即n端區(qū)域(通常稱為hcn肽或結(jié)構(gòu)域)和c端區(qū)域(通常稱為hcc肽或結(jié)構(gòu)域)。以下文獻(xiàn)證實(shí)了這一事實(shí)，每篇文獻(xiàn)均全文引入作為參考：umland?tc(1997)《自然結(jié)構(gòu)生物學(xué)》4：788-792；herreros?j(2000)《生物化學(xué)雜志》347：199-204；halpern?j(1993)《生物化學(xué)雜志》268：15，第11188-11192頁(yè)；rummel?a(2007)《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》104：359-364；lacey?db(1998)《自然結(jié)構(gòu)生物學(xué)》5：898-902；knapp(1998)《美國(guó)晶體協(xié)會(huì)摘要論文》25：90；swaminathan和eswaramoorthy(2000)《自然結(jié)構(gòu)生物學(xué)》7：1751-1759；以及rummel?a(2004)《分子微生物學(xué)》51(3)，631-643。此外，已有充分文獻(xiàn)記載，構(gòu)成c端160-200個(gè)氨基酸殘基的c端區(qū)域(hcc)負(fù)責(zé)梭菌神經(jīng)毒素與其天然細(xì)胞受體的結(jié)合，即在神經(jīng)肌肉接頭處與神經(jīng)末梢的結(jié)合-上述文獻(xiàn)也證實(shí)了這一事實(shí)。

199、梭菌hcc參考序列示例如下：

200、·a型肉毒神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(y1111-l1296)

201、·b型肉毒神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(y1098-e1291)

202、·c型肉毒神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(y1112-e1291)

203、·d型肉毒神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(y1099-e1276)

204、·e型肉毒神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(y1086-k1252)

205、·f型肉毒神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(y1106-e1274)

206、·g型肉毒神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(y1106-e1297)

207、·破傷風(fēng)神經(jīng)毒素-氨基酸殘基(y1128-d1315)

208、鑒于根據(jù)亞血清型可能會(huì)出現(xiàn)輕微差異，上述確定的參考序列應(yīng)被視為指導(dǎo)。

209、修飾的梭菌神經(jīng)毒素在重鏈的氨基酸序列中可能具有一個(gè)或多個(gè)修飾(例如修飾的hc結(jié)構(gòu)域)，其中所述修飾的重鏈與天然(未修飾)梭菌神經(jīng)毒素相比，與靶神經(jīng)細(xì)胞的結(jié)合親和力更高或更低。hc結(jié)構(gòu)域中的此類修飾可包括修飾hc結(jié)構(gòu)域中神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合位點(diǎn)或蛋白質(zhì)(sv2或突觸結(jié)合蛋白)結(jié)合位點(diǎn)中的殘基，這些修飾會(huì)改變與靶神經(jīng)細(xì)胞的神經(jīng)節(jié)苷脂受體和/或蛋白質(zhì)受體的結(jié)合。此類修飾的梭菌神經(jīng)毒素的示例在wo?2006/027207和wo?2006/114308中有描述，這兩篇文獻(xiàn)均全文引入作為參考。

210、修飾的梭菌神經(jīng)毒素在輕鏈的氨基酸序列中可能具有一個(gè)或多個(gè)修飾，例如在底物結(jié)合或催化結(jié)構(gòu)域中的修飾，這可能會(huì)改變或修飾修飾后的輕鏈對(duì)snare蛋白的特異性。此類修飾的梭菌神經(jīng)毒素的示例在wo?2010/120766和us2011/0318385中有描述，這兩篇文獻(xiàn)均全文引入作為參考。

211、因此，術(shù)語(yǔ)“梭菌神經(jīng)毒素”旨在涵蓋雜合和嵌合梭菌神經(jīng)毒素。在一個(gè)實(shí)施方案中，修飾的梭菌神經(jīng)毒素可以是雜合或嵌合梭菌神經(jīng)毒素，條件是所述梭菌神經(jīng)毒素包含本發(fā)明的修飾的bont/ahcc結(jié)構(gòu)域。雜合梭菌神經(jīng)毒素包含來(lái)自一種梭菌神經(jīng)毒素或其亞型的輕鏈的至少一部分，以及來(lái)自另一種梭菌神經(jīng)毒素或梭菌神經(jīng)毒素亞型的重鏈的至少一部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，雜合梭菌神經(jīng)毒素可包含來(lái)自一種梭菌神經(jīng)毒素亞型的完整輕鏈和來(lái)自另一種梭菌神經(jīng)毒素亞型的重鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，嵌合梭菌神經(jīng)毒素可包含一種梭菌神經(jīng)毒素亞型重鏈的一部分(例如結(jié)合結(jié)構(gòu)域)，而重鏈的另一部分來(lái)自另一種梭菌神經(jīng)毒素亞型。類似地或可替代地，治療元件可包含來(lái)自不同梭菌神經(jīng)毒素的輕鏈部分。此類雜合或嵌合梭菌神經(jīng)毒素是有用的，例如，作為一種將此類梭菌神經(jīng)毒素的治療益處提供給對(duì)給定梭菌神經(jīng)毒素亞型具有免疫抗性的患者、對(duì)給定梭菌神經(jīng)毒素重鏈結(jié)合域的受體濃度低于平均水平的患者，或?qū)δせ蚰遗荻舅氐孜?例如snap-25、vamp和突觸融合蛋白)具有蛋白酶抗性變體的患者的手段。雜合和嵌合梭菌神經(jīng)毒素在us?8,071,110中有描述，該文獻(xiàn)全文引入作為參考。

212、例如，嵌合神經(jīng)毒素可包含來(lái)自第一種神經(jīng)毒素的lhn結(jié)構(gòu)域與來(lái)自第二種神經(jīng)毒素的hc結(jié)構(gòu)域共價(jià)連接，優(yōu)選地，其中所述第一種和第二種神經(jīng)毒素不同，其中所述lhn結(jié)構(gòu)域的c端氨基酸殘基對(duì)應(yīng)于所述第一種神經(jīng)毒素中分隔lhn和hc結(jié)構(gòu)域的310螺旋的第一個(gè)氨基酸殘基，并且其中所述hc結(jié)構(gòu)域的n端氨基酸殘基對(duì)應(yīng)于所述第二種神經(jīng)毒素中分隔lhn和hc結(jié)構(gòu)域的310螺旋的第二個(gè)氨基酸殘基。

213、在一個(gè)實(shí)施方案中，梭菌神經(jīng)毒素是一種嵌合神經(jīng)毒素，其包含來(lái)自bont/b的hc結(jié)構(gòu)域和來(lái)自bont/a、bont/c、bont/d、bont/e、bont/f、bont/g或bont/x的lhn結(jié)構(gòu)域。

214、例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，hc結(jié)構(gòu)域由對(duì)應(yīng)于seq?id?no：3的氨基酸殘基860至1291的氨基酸序列組成或包含該氨基酸序列，或與該序列具有至少70％、優(yōu)選至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列，并且lhn結(jié)構(gòu)域由選自以下的氨基酸序列組成或包含該氨基酸序列：

215、·seq?id?no：2的氨基酸殘基1至872，或與該序列具有至少70％、優(yōu)選至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列，

216、·seq?id?no：4的氨基酸殘基1至867，或與該序列具有至少70％、優(yōu)選至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列，

217、·seq?id?no：5的氨基酸殘基1至863，或與該序列具有至少70％、優(yōu)選至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列，

218、·seq?id?no：6的氨基酸殘基1至846，或與該序列具有至少70％、優(yōu)選至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列，

219、·seq?id?no：7的氨基酸殘基1至865，或與該序列具有至少70％、優(yōu)選至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列，

220、·seq?id?no：8的氨基酸殘基1至862，或與該序列具有至少70％、優(yōu)選至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列，

221、·seq?id?no：9的氨基酸殘基1至864，或與該序列具有至少70％、優(yōu)選至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列，

222、·seq?id?no：10的氨基酸殘基1至863，或與該序列具有至少70％、優(yōu)選至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的序列。

223、在一個(gè)實(shí)施方案中，梭菌神經(jīng)毒素是bont/x，其包含來(lái)自非bont/x梭菌神經(jīng)毒素的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域(例如bont/x雜合體或嵌合體)。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，梭菌神經(jīng)毒素可包含：

224、i.bont/x輕鏈和非bont/x?hn及hc結(jié)構(gòu)域；

225、ii.bont/x?hn結(jié)構(gòu)域和非bont/x輕鏈及hc結(jié)構(gòu)域；

226、iii.bont/x?hc結(jié)構(gòu)域和非bont/x輕鏈及hn結(jié)構(gòu)域；

227、iv.bont/x輕鏈和hn結(jié)構(gòu)域以及非bont/x?hc結(jié)構(gòu)域；

228、v.bont/x輕鏈和hc結(jié)構(gòu)域以及非bont/x?hn結(jié)構(gòu)域；或

229、vi.bont/x?hn結(jié)構(gòu)域和hc結(jié)構(gòu)域以及非bont/x輕鏈。

230、在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，梭菌神經(jīng)毒素是一種嵌合神經(jīng)毒素，其包含來(lái)自bont/b的hc結(jié)構(gòu)域和來(lái)自bont/a的lhn結(jié)構(gòu)域。

231、在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，hc結(jié)構(gòu)域由對(duì)應(yīng)于seq?id?no：3的氨基酸殘基860至1291的氨基酸序列組成或包含該氨基酸序列，或與該序列具有至少70％、優(yōu)選至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列，并且lhn結(jié)構(gòu)域包含對(duì)應(yīng)于seq?idno：2的氨基酸殘基1至872的氨基酸序列，或與該序列具有至少70％、優(yōu)選至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列。

232、在梭菌神經(jīng)毒素包含來(lái)自bont/b的hc結(jié)構(gòu)域的實(shí)施方案中(例如，梭菌神經(jīng)毒素是bont/b，或包含來(lái)自bont/b的hc結(jié)構(gòu)域的嵌合神經(jīng)毒素)，梭菌神經(jīng)毒素在重鏈的氨基酸序列中(例如在hc結(jié)構(gòu)域中)可能具有一個(gè)或多個(gè)修飾，從而提供“修飾的重鏈”，優(yōu)選地，其中所述修飾的重鏈與天然神經(jīng)毒素相比，與靶神經(jīng)細(xì)胞的結(jié)合親和力更高(或更低)。hc結(jié)構(gòu)域中的此類修飾可包括hcc結(jié)構(gòu)域中神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合位點(diǎn)氨基酸殘基的修飾，這可以改變與靶神經(jīng)細(xì)胞神經(jīng)節(jié)苷脂的結(jié)合，和/或hcc結(jié)構(gòu)域中蛋白質(zhì)受體結(jié)合位點(diǎn)氨基酸殘基的修飾，這可以改變與靶神經(jīng)細(xì)胞蛋白質(zhì)受體的結(jié)合。此類修飾的神經(jīng)毒素的示例在wo2006027207和wo2006114308中有描述，這兩篇文獻(xiàn)均全文引入作為參考。

233、在一個(gè)實(shí)施方案中，如上文所述，本發(fā)明的梭菌神經(jīng)毒素可以既是嵌合的又是經(jīng)過(guò)修飾的。例如，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，梭菌神經(jīng)毒素包含(或由其組成)seq?id?no：11的氨基酸序列，或與該序列具有至少70％、優(yōu)選至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列。

234、在一個(gè)實(shí)施方案中，如上文所述，本發(fā)明的梭菌神經(jīng)毒素可以既是嵌合的又是經(jīng)過(guò)修飾的。例如，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，梭菌神經(jīng)毒素包含(或由其組成)seq?id?no：11(例如bont/abmy)的氨基酸序列，或與該序列具有至少70％、優(yōu)選至少75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列。

235、術(shù)語(yǔ)“梭菌神經(jīng)毒素”還可涵蓋由非梭菌屬微生物表達(dá)的新發(fā)現(xiàn)的肉毒神經(jīng)毒素蛋白家族成員，例如與bont/x具有最接近序列同一性的腸球菌編碼毒素、名為bont/wo的米氏魏斯氏菌編碼毒素(ncbi參考序列：wp_027699549.1)，其在w89-w90處切割vamp2、屎腸球菌編碼毒素(genbank：oto22244.1)，其切割vamp2和snap25，以及派珀黃桿菌編碼毒素(ncbi參考序列：wp_034687872.1)。

236、術(shù)語(yǔ)“梭菌神經(jīng)毒素”旨在涵蓋重新靶向的梭菌神經(jīng)毒素。在重新靶向的梭菌神經(jīng)毒素中，梭菌神經(jīng)毒素經(jīng)過(guò)修飾以包含一種稱為靶向部分(tm)的外源性配體。選擇tm以提供對(duì)所需靶細(xì)胞的結(jié)合特異性，并且作為重新靶向過(guò)程的一部分，梭菌神經(jīng)毒素的天然結(jié)合部分(例如hc結(jié)構(gòu)域或hcc結(jié)構(gòu)域)可能會(huì)被去除。

237、術(shù)語(yǔ)“梭菌神經(jīng)毒素”可涵蓋催化無(wú)活性的梭菌神經(jīng)毒素。本文中就梭菌神經(jīng)毒素輕鏈而言使用的術(shù)語(yǔ)“催化無(wú)活性”是指所述輕鏈基本上不表現(xiàn)出非細(xì)胞毒性蛋白酶活性，優(yōu)選地，本文中就梭菌神經(jīng)毒素輕鏈而言使用的術(shù)語(yǔ)“催化無(wú)活性”是指所述輕鏈不表現(xiàn)出非細(xì)胞毒性蛋白酶活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，催化無(wú)活性的梭菌神經(jīng)毒素輕鏈?zhǔn)侵覆粫?huì)切割靶細(xì)胞中胞吐融合裝置蛋白質(zhì)的輕鏈。術(shù)語(yǔ)“基本上無(wú)非細(xì)胞毒性蛋白酶活性”是指梭菌神經(jīng)毒素輕鏈的非細(xì)胞毒性蛋白酶活性低于催化活性梭菌神經(jīng)毒素輕鏈的5％，例如低于催化活性梭菌神經(jīng)毒素輕鏈非細(xì)胞毒性蛋白酶活性的2％、1％或優(yōu)選低于0.1％。非細(xì)胞毒性蛋白酶活性可以通過(guò)在體外將測(cè)試梭菌神經(jīng)毒素輕鏈與snare蛋白一起孵育，并將測(cè)試梭菌神經(jīng)毒素輕鏈切割的snare蛋白量與相同條件下催化活性梭菌神經(jīng)毒素輕鏈切割的snare蛋白量進(jìn)行比較來(lái)確定。常規(guī)技術(shù)，如sds-page和蛋白質(zhì)免疫印跡法可用于量化被切割的snare蛋白的量。合適的體外測(cè)定方法在wo?2019/145577?a1中有描述，該文獻(xiàn)以引用方式并入本文。

238、本發(fā)明還包括具有非天然蛋白酶切割位點(diǎn)的梭菌神經(jīng)毒素。在這類梭菌神經(jīng)毒素中，天然蛋白酶切割位點(diǎn)(如上文所述，也稱為激活位點(diǎn))被修飾或替換為該梭菌神經(jīng)毒素非天然的蛋白酶切割位點(diǎn)(即外源切割位點(diǎn))。這樣的位點(diǎn)需要外源蛋白酶進(jìn)行切割，從而可以更好地控制切割事件發(fā)生的時(shí)間和位置?？捎糜谒缶窠?jīng)毒素的非天然蛋白酶切割位點(diǎn)包括：

239、·tev(煙草蝕紋病毒)?????(enlyfq↓g)(seq?id?no:26)

240、·凝血酶????????????????(lvpr↓gs)(seq?id?no:27)

241、·prescission???????????(levlfq↓gp)(seq?id?no:28)

242、·腸激酶????????????????(ddddk↓,seq?id?no:29)

243、·凝血因子xa????????????(iegr↓/idgr↓,seq?id?nos:30和31)

244、其他蛋白酶切割位點(diǎn)包括可被非細(xì)胞毒性蛋白酶切割的識(shí)別序列，例如被梭菌神經(jīng)毒素的輕鏈切割。這些包括可被非細(xì)胞毒性蛋白酶(如梭菌神經(jīng)毒素的輕鏈)切割的snare(如snap-25、突觸融合蛋白、vamp)蛋白識(shí)別序列。包含非天然蛋白酶切割位點(diǎn)的梭菌神經(jīng)毒素在us?7,132,259、ep?1206554-b2和us?2007/0166332中有描述，所有這些文獻(xiàn)均以引用方式整體并入本文。術(shù)語(yǔ)蛋白酶切割位點(diǎn)還包括內(nèi)含肽，這是一種自我切割序列。自我剪接反應(yīng)是可控的，例如通過(guò)改變存在的還原劑濃度來(lái)控制。

245、本發(fā)明還包括包含“破壞性切割位點(diǎn)”的梭菌神經(jīng)毒素。在所述梭菌神經(jīng)毒素中，將非天然蛋白酶切割位點(diǎn)引入梭菌神經(jīng)毒素中，選擇的位置使得在該位點(diǎn)的切割會(huì)降低梭菌神經(jīng)毒素的活性或使其失活。如果梭菌神經(jīng)毒素在給藥后遷移到非靶標(biāo)位置，破壞性蛋白酶切割位點(diǎn)可被局部蛋白酶切割。合適的非天然蛋白酶切割位點(diǎn)包括上述那些。包含破壞性切割位點(diǎn)的梭菌神經(jīng)毒素在wo?2010/094905和wo?2002/044199中有描述，這兩篇文獻(xiàn)均以引用方式整體并入本文。

246、本發(fā)明的修飾梭菌神經(jīng)毒素，特別是其輕鏈組分，可以進(jìn)行聚乙二醇化(peg化)——這可能有助于提高穩(wěn)定性，例如輕鏈組分的作用持續(xù)時(shí)間。當(dāng)輕鏈包含bont/a、b或c1蛋白酶時(shí)，peg化尤其優(yōu)選。peg化優(yōu)選包括將聚乙二醇添加到輕鏈組分的n端。例如，輕鏈的n端可以用一個(gè)或多個(gè)氨基酸(如半胱氨酸)殘基進(jìn)行延伸，這些殘基可以相同或不同。所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中的每一個(gè)都可以連接(如共價(jià)連接)有其自身的聚乙二醇分子。這種技術(shù)的一個(gè)示例在wo2007/104567中有描述，該文獻(xiàn)以引用方式整體并入本文。

247、梭菌神經(jīng)毒素的給藥量(如劑量)可以用納克來(lái)衡量。

248、根據(jù)本發(fā)明的梭菌神經(jīng)毒素劑量應(yīng)理解為活性雙鏈梭菌神經(jīng)毒素的劑量，即不包括神經(jīng)毒素可能與之結(jié)合的復(fù)合蛋白的量。換句話說(shuō)，它指的是活性雙鏈梭菌神經(jīng)毒素的劑量，無(wú)論該神經(jīng)毒素是與復(fù)合蛋白結(jié)合還是不與復(fù)合蛋白結(jié)合給予患者。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，活性雙鏈梭菌神經(jīng)毒素能夠結(jié)合膜(如細(xì)胞膜)受體，將輕鏈轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中并切割snare蛋白，而復(fù)合蛋白不顯示這種生物學(xué)活性(即“無(wú)活性”)。

249、另外或可替代地，梭菌神經(jīng)毒素的劑量可以用梭菌神經(jīng)毒素“單位”(u)來(lái)衡量。例如，當(dāng)給予bont/a(或更具體地，例如)時(shí)，以單位衡量劑量可能特別合適。

250、實(shí)際上，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，梭菌神經(jīng)毒素的效力與實(shí)現(xiàn)半數(shù)致死劑量(ld50)單位所需的神經(jīng)毒素量(如納克)相關(guān)；一個(gè)ld50單位定義為半數(shù)致死腹腔注射劑量(以小鼠測(cè)量)。然而，目前市場(chǎng)上的bont藥物制劑含有不同量的150kd神經(jīng)毒素，也含有不同量的ld50單位。此外，在這些制劑中，神經(jīng)毒素可能與無(wú)毒神經(jīng)毒素相關(guān)蛋白(nap，也稱為復(fù)合蛋白)結(jié)合(即組合)，也可能不結(jié)合。為便于換算(如field等人在“abobotulinumtoxinaonabotulinumtoxinaandincobotulinumtoxinaneurotoxin?content?and?potential?implicationsfor?duration?of?response?in?patients”，《毒素》2018年，10(12)，535中所述)：

251、·100單位的(也稱為onabotulinumtoxina)含有約0.9納克的150kdbont/a，以及復(fù)合蛋白；

252、·500單位的(也稱為abobotulinumtoxina)含有約2.69納克的150kdbont/a，以及復(fù)合蛋白；1單位的含有約5.38皮克的bont/a；

253、·100單位的(也稱為incobotulinumtoxina)含有約0.40納克的150kdbont/a，不含復(fù)合蛋白。

254、應(yīng)當(dāng)注意，換算值可能略有不同。例如，frevert在2012年(“content?ofbotulinum?neurotoxin?inand”；《藥物研發(fā)》2010年；10(2):67-73)中報(bào)道的換算值如下：

255、·100單位的(也稱為onabotulinumtoxina)含有約0.73納克的150kdbont/a，以及復(fù)合蛋白；

256、·100單位的(也稱為abobotulinumtoxina)含有約0.65納克的150kdbont/a，以及復(fù)合蛋白；

257、·100單位的(也稱為incobotulinumtoxina)含有約0.44納克的150kdbont/a，不含復(fù)合蛋白；

258、·100單位的(也稱為rimabotulinumtoxinb)含有約0.2納克至約1納克的150kd?bont/b，以及復(fù)合蛋白。

259、本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)用于定量蛋白質(zhì)(優(yōu)選在納克水平)的方法來(lái)測(cè)量梭菌神經(jīng)毒素的量，其中包括質(zhì)譜法，如同位素稀釋質(zhì)譜法(等人，“通過(guò)使用同位素稀釋質(zhì)譜法的氨基酸分析對(duì)蛋白質(zhì)校準(zhǔn)品進(jìn)行定量”，《分析生物化學(xué)》2011年，408，124-131)，或熒光測(cè)定法(poras等人，“通過(guò)一種新型快速體外熒光測(cè)定法檢測(cè)和定量a型肉毒神經(jīng)毒素”，《應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)》2009年7月；75(13):4382-4390)。

260、在一個(gè)實(shí)施方案中，每500毫升溶液給予患者至少5000單位、6000單位、7000單位、8000單位或9000單位，優(yōu)選至少9500單位，更優(yōu)選至少9900單位(如至少10,000單位)的梭菌神經(jīng)毒素。在一個(gè)實(shí)施方案中，每500毫升溶液給予患者小于或等于55,000單位、50,000單位、45,000單位或40,000單位，優(yōu)選小于或等于35,000單位，更優(yōu)選小于或等于31,000單位(如小于或等于30,000單位)的梭菌神經(jīng)毒素。在一個(gè)實(shí)施方案中，每500毫升溶液給予患者5000-35,000單位、6000-34,000單位、7000-33,000單位，優(yōu)選8000-32,000單位，更優(yōu)選9000-31,000單位(如優(yōu)選10,000-30,000單位)的梭菌神經(jīng)毒素。

261、在一個(gè)實(shí)施方案中，每1升溶液給予患者至少16,500單位、17,000單位、17,500單位、18,000單位或18,500單位，優(yōu)選至少19,000單位，更優(yōu)選至少19,500單位(如至少20,000單位)的梭菌神經(jīng)毒素。在一個(gè)實(shí)施方案中，每1升溶液給予患者小于或等于63,000單位、62,500單位、62,000單位或61,500單位，優(yōu)選小于或等于61,000單位，更優(yōu)選小于或等于60,500單位(如小于或等于60,000單位)的梭菌神經(jīng)毒素。在一個(gè)實(shí)施方案中，每1升溶液給予患者16,000-35,000單位、17,000-34,000單位、18,000-33,000單位，優(yōu)選19,000-32,000單位，更優(yōu)選19,500-60,500單位(如優(yōu)選20,000-60,000單位)的梭菌神經(jīng)毒素。

262、在一個(gè)實(shí)施方案中，每500毫升溶液給予患者至少51,000皮克、51,500皮克、52,000皮克或52,500皮克，優(yōu)選至少53,000皮克，更優(yōu)選至少53,500皮克(如至少53,800皮克)的梭菌神經(jīng)毒素。在一個(gè)實(shí)施方案中，每500毫升溶液給予患者小于或等于164,000皮克、163,500皮克、163,000皮克或162,500皮克，優(yōu)選小于或等于162,000皮克，更優(yōu)選小于或等于161,700皮克(如小于或等于161,400皮克)的梭菌神經(jīng)毒素。在一個(gè)實(shí)施方案中，每500毫升溶液給予患者51,500-163,500皮克、52,000-163,000皮克或52,500-162,500皮克，優(yōu)選53,000-162,000皮克，更優(yōu)選53,500-161,700皮克(如53,800-161,400皮克)的梭菌神經(jīng)毒素。

263、在一個(gè)實(shí)施方案中，每1升溶液給予患者至少105,000皮克、105,500皮克、106,000皮克或106,500皮克，優(yōu)選至少107,000皮克，更優(yōu)選至少107,400皮克(如至少107,600皮克)的梭菌神經(jīng)毒素。在一個(gè)實(shí)施方案中，每1升溶液給予患者小于或等于325,500皮克、325,000皮克、324,500皮克或324,000皮克，優(yōu)選小于或等于323,500皮克，更優(yōu)選小于或等于323,000皮克(如小于或等于322,800皮克)的梭菌神經(jīng)毒素。在一個(gè)實(shí)施方案中，每1升溶液給予患者105,000-325,500皮克、105,500-325,000皮克、106,000-324,500皮克或106,500-324,000皮克，優(yōu)選107,000-323,500皮克，更優(yōu)選107,400-323,000皮克(如107,600-322,800皮克)的梭菌神經(jīng)毒素。

264、在一個(gè)實(shí)施方案中，所述溶液包含梭菌神經(jīng)毒素，并且該溶液在生理上是惰性的和/或不含剝離劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述溶液包含梭菌神經(jīng)毒素，并且該溶液是基于鹽水的和/或不含剝離劑。

265、一方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其包含梭菌神經(jīng)毒素以及藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑、佐劑、推進(jìn)劑和/或鹽。

266、一方面，本發(fā)明提供一種用于本發(fā)明方法的試劑盒，其包括：

267、a)一種基本上由梭菌神經(jīng)毒素組成的溶液；以及

268、b)用于插入患者膀胱的導(dǎo)管。

269、術(shù)語(yǔ)“受試者”、“個(gè)體”和“患者”在本文中可互換使用，指哺乳動(dòng)物受試者。在一個(gè)實(shí)施方案中，“受試者”是人、伴侶動(dòng)物(如寵物，如狗、貓和/或兔子)、家畜(如豬、綿羊、牛和/或山羊)和/或馬。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，受試者(患者)是人。

270、本文所用的術(shù)語(yǔ)“病癥”也涵蓋“疾病”。在一個(gè)實(shí)施方案中，病癥是疾病。

271、本文所用的術(shù)語(yǔ)“治療”涵蓋預(yù)防性治療(如預(yù)防病癥發(fā)作)以及矯正性治療(對(duì)已患病癥的受試者進(jìn)行治療)。優(yōu)選地，本文所用的“治療”指矯正性治療。本文所用的術(shù)語(yǔ)“治療”指病癥和/或其癥狀。

272、因此，本發(fā)明的多肽可以治療有效量或預(yù)防有效量給予受試者。優(yōu)選地，本發(fā)明的梭菌神經(jīng)毒素以治療有效量給予受試者。

273、“治療有效量”是指梭菌神經(jīng)毒素的任何量，當(dāng)單獨(dú)或組合給予受試者以治療所述病癥(或其癥狀)時(shí)，該量足以實(shí)現(xiàn)對(duì)該病癥或其癥狀的這種治療。

274、“預(yù)防有效量”是指梭菌神經(jīng)毒素的任何量，當(dāng)單獨(dú)或組合給予受試者時(shí)，該量抑制或延遲病癥(或其癥狀)的發(fā)作或復(fù)發(fā)。在一些實(shí)施方案中，預(yù)防有效量完全防止病癥的發(fā)作或復(fù)發(fā)?！耙种啤卑l(fā)作是指要么降低病癥發(fā)作(或其癥狀)的可能性，要么完全防止發(fā)作。

275、序列同源性

276、可以使用多種序列比對(duì)方法中的任何一種來(lái)確定序列同一性百分比，包括但不限于全局方法、局部方法和混合方法，例如片段方法。確定序列同一性百分比的方案是本領(lǐng)域技術(shù)人員范圍內(nèi)的常規(guī)程序。全局方法從分子的起始到末端對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)，并通過(guò)累加各個(gè)殘基對(duì)的得分并施加空位罰分來(lái)確定最佳比對(duì)。非限制性方法包括，例如，clustal?w，參見(jiàn)，例如，julie?d.thompson等人，“clustal?w：通過(guò)序列加權(quán)、位置特異性空位罰分和權(quán)重矩陣選擇提高漸進(jìn)式多序列比對(duì)的靈敏度”，《核酸研究》22(22)4673-4680(1994)；以及迭代優(yōu)化，參見(jiàn)，例如，osamu?gotoh，“通過(guò)迭代優(yōu)化顯著提高多蛋白質(zhì)序列比對(duì)的準(zhǔn)確性：通過(guò)參考結(jié)構(gòu)比對(duì)評(píng)估”，《分子生物學(xué)雜志》264(4)823-838(1996)。局部方法通過(guò)識(shí)別所有輸入序列共有的一個(gè)或多個(gè)保守基序來(lái)比對(duì)序列。非限制性方法包括，例如，match-box，參見(jiàn)，例如，eric?depiereux和ernest?feytmans，“match-box：一種用于同時(shí)比對(duì)多個(gè)蛋白質(zhì)序列的全新算法”，《計(jì)算機(jī)應(yīng)用生物科學(xué)》8(5)501-509(1992)；吉布斯采樣，參見(jiàn)，例如，c.e.lawrence等人，“檢測(cè)微妙的序列信號(hào)：一種用于多序列比對(duì)的吉布斯采樣策略”，《科學(xué)》262(5131)208-214(1993)；align-m，參見(jiàn)，例如，ivo?van?waiie等人，“align-m-一種用于高度分歧序列多序列比對(duì)的新算法”，《生物信息學(xué)》20(9):1428-1435(2004)。

277、因此，序列同一性百分比通過(guò)常規(guī)方法確定。例如，參見(jiàn)altschul等人，《數(shù)學(xué)生物學(xué)通報(bào)》48:603-16，1986以及henikoff和henikoff，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》89:10915-19，1992。簡(jiǎn)而言之，將兩個(gè)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，使用空位開(kāi)放罰分10、空位延伸罰分1以及henikoff和henikoff(同上)的“blosum?62”評(píng)分矩陣(如下所示，氨基酸用標(biāo)準(zhǔn)單字母代碼表示)來(lái)優(yōu)化比對(duì)得分。

278、兩個(gè)或多個(gè)核酸或氨基酸序列之間的“序列同一性百分比”是序列共有相同位置數(shù)量的函數(shù)。因此，同一性百分比可以計(jì)算為相同核苷酸/氨基酸的數(shù)量除以核苷酸/氨基酸總數(shù)，再乘以100。計(jì)算序列同一性百分比時(shí)，也可以考慮為使兩條或更多條序列達(dá)到最佳比對(duì)所需引入的空位數(shù)量以及每個(gè)空位的長(zhǎng)度。序列比較以及確定兩條或更多條序列之間的同一性百分比，可以使用特定的數(shù)學(xué)算法來(lái)進(jìn)行，比如blast，本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)此應(yīng)該很熟悉。

279、用于確定序列同一性的比對(duì)得分

280、

281、????

282、然后，同一性百分比的計(jì)算方式如下：

283、相同匹配的總數(shù)

284、________________________________________x?100

285、較長(zhǎng)序列的長(zhǎng)度加上為使兩條序列比對(duì)而在較長(zhǎng)序列中引入的空位數(shù)量

286、基本同源的多肽的特征在于具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替換、缺失或添加。這些變化最好是微小的，即保守氨基酸替換(見(jiàn)下文)以及其他不會(huì)顯著影響多肽折疊或活性的替換；小的缺失，通常為1至約30個(gè)氨基酸；以及小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端的甲硫氨酸殘基、長(zhǎng)度至多約20-25個(gè)殘基的小連接肽，或親和標(biāo)簽。

287、保守氨基酸替換

288、·堿性氨基酸：精氨酸、賴氨酸、組氨酸

289、·酸性氨基酸：谷氨酸、天冬氨酸

290、·極性氨基酸：谷氨酰胺、天冬酰胺

291、·疏水氨基酸：亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸

292、·芳香族氨基酸：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸

293、·小氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、甲硫氨酸

294、除了20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸外，非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸(如4-羥基脯氨酸、6-n-甲基賴氨酸、2-氨基異丁酸、異纈氨酸和α-甲基絲氨酸)可替代本發(fā)明多肽中的氨基酸殘基。數(shù)量有限的非保守氨基酸、遺傳密碼未編碼的氨基酸以及非天然氨基酸，也可替代多肽中的氨基酸殘基。本發(fā)明的多肽還可包含非天然存在的氨基酸殘基。

295、非天然存在的氨基酸包括但不限于反式-3-甲基脯氨酸、2,4-亞甲基-脯氨酸、順式-4-羥基脯氨酸、反式-4-羥基-脯氨酸、n-甲基甘氨酸、別蘇氨酸、甲基-蘇氨酸、羥乙基半胱氨酸、羥乙基高半胱氨酸、硝基-谷氨酰胺、高谷氨酰胺、哌可酸、叔亮氨酸、正纈氨酸、2-氮雜苯丙氨酸、3-氮雜苯丙氨酸、4-氮雜苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。本領(lǐng)域已知有幾種將非天然存在的氨基酸殘基摻入蛋白質(zhì)的方法。例如，可以采用體外系統(tǒng)，其中使用化學(xué)氨?；囊种苩rna來(lái)抑制無(wú)義突變。合成氨基酸和氨?；痶rna的方法在本領(lǐng)域是已知的。含有無(wú)義突變的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄和翻譯在包含大腸桿菌s30提取物以及市售酶和其他試劑的無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中進(jìn)行。通過(guò)色譜法純化蛋白質(zhì)。例如，參見(jiàn)robertson等人，《美國(guó)化學(xué)會(huì)志》113:2722,1991；ellman等人，《酶學(xué)方法》202:301,1991；chung等人，《科學(xué)》259:806-9,1993；以及chung等人，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》90:10145-9,1993)。在第二種方法中，通過(guò)顯微注射突變的mrna和化學(xué)氨酰化的抑制trna，在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中進(jìn)行翻譯(turcatti等人，《生物化學(xué)雜志》271:19991-8,1996)。在第三種方法中，在缺乏要被取代的天然氨基酸(如苯丙氨酸)且存在所需的非天然存在氨基酸(如2-氮雜苯丙氨酸、3-氮雜苯丙氨酸、4-氮雜苯丙氨酸或4-氟苯丙氨酸)的情況下培養(yǎng)大腸桿菌細(xì)胞。非天然存在的氨基酸會(huì)取代其天然對(duì)應(yīng)物摻入多肽中。參見(jiàn)koide等人，《生物化學(xué)》33:7470-6,1994。天然存在的氨基酸殘基可通過(guò)體外化學(xué)修飾轉(zhuǎn)化為非天然存在的種類?；瘜W(xué)修飾可與定點(diǎn)誘變相結(jié)合，以進(jìn)一步擴(kuò)大替換范圍(wynn和richards，《蛋白質(zhì)科學(xué)》2:395-403,1993)。

296、數(shù)量有限的非保守氨基酸、遺傳密碼未編碼的氨基酸、非天然存在的氨基酸以及非天然氨基酸，可替代本發(fā)明多肽的氨基酸殘基。

297、本發(fā)明多肽中的必需氨基酸可根據(jù)本領(lǐng)域已知的程序來(lái)鑒定，如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變(cunningham和wells，《科學(xué)》244:1081-5,1989)。生物相互作用位點(diǎn)也可通過(guò)結(jié)構(gòu)的物理分析來(lái)確定，如通過(guò)核磁共振、晶體學(xué)、電子衍射或光親和標(biāo)記等技術(shù)，并結(jié)合對(duì)假定接觸位點(diǎn)氨基酸的突變來(lái)確定。例如，參見(jiàn)de?vos等人，《科學(xué)》255:306-12,1992；smith等人，《分子生物學(xué)雜志》224:899-904,1992；wlodaver等人，《歐洲生物化學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)快報(bào)》309:59-64,1992。必需氨基酸的身份也可通過(guò)與本發(fā)明多肽的相關(guān)組分(如轉(zhuǎn)位或蛋白酶組分)的同源性分析來(lái)推斷。

298、可以使用已知的誘變和篩選方法進(jìn)行多個(gè)氨基酸替換并加以測(cè)試，如reidhaar-olson和sauer(《科學(xué)》241:53-7,1988)或bowie和sauer(《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》86:2152-6,1989)所公開(kāi)的方法。簡(jiǎn)而言之，這些作者公開(kāi)了同時(shí)使多肽中兩個(gè)或更多個(gè)位置隨機(jī)化、選擇有功能的多肽，然后對(duì)誘變后的多肽進(jìn)行測(cè)序以確定每個(gè)位置允許的替換范圍的方法。其他可使用的方法包括噬菌體展示(如lowman等人，《生物化學(xué)》30:10832-7,1991；ladner等人，美國(guó)專利號(hào)5,223,409；huse，世界知識(shí)產(chǎn)權(quán)組織公開(kāi)wo?92/06204)和區(qū)域定向誘變(derbyshire等人，《基因》46:145,1986；ner等人，《dna》7:127,1988)。

299、可以使用已知的誘變和篩選方法進(jìn)行多個(gè)氨基酸替換并加以測(cè)試，如reidhaar-olson和sauer(《科學(xué)》241:53-7,1988)或bowie和sauer(《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊》86:2152-6,1989)所公開(kāi)的方法。簡(jiǎn)而言之，這些作者公開(kāi)了同時(shí)使多肽中兩個(gè)或更多個(gè)位置隨機(jī)化、選擇有功能的多肽，然后對(duì)誘變后的多肽進(jìn)行測(cè)序以確定每個(gè)位置允許的替換范圍的方法。其他可使用的方法包括噬菌體展示(如lowman等人，《生物化學(xué)》30:10832-7,1991；ladner等人，美國(guó)專利號(hào)5,223,409；huse，世界知識(shí)產(chǎn)權(quán)組織公開(kāi)wo?92/06204)和區(qū)域定向誘變(derbyshire等人，《基因》46:145,1986；ner等人，《dna》7:127,1988)。

300、除非另有定義，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本公開(kāi)所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義相同。singleton等人所著的《微生物學(xué)和分子生物學(xué)詞典》第20版，johnwiley?and?sons出版社，紐約(1994年)，以及hale和marham所著的《哈珀柯林斯生物學(xué)詞典》，harper?perennial出版社，紐約(1991年)，為技術(shù)人員提供了本公開(kāi)中許多術(shù)語(yǔ)的通用詞典。

301、本公開(kāi)不受本文所公開(kāi)的示例性方法和材料的限制，任何與本文所述方法和材料相似或等效的方法和材料，均可用于本公開(kāi)實(shí)施方案的實(shí)踐或測(cè)試。數(shù)值范圍包括定義該范圍的數(shù)字。除非另有說(shuō)明，任何核酸序列均按從左到右5'至3'的方向書(shū)寫(xiě)；氨基酸序列則分別按從左到右氨基至羧基的方向書(shū)寫(xiě)。

302、本文提供的標(biāo)題并非對(duì)本公開(kāi)的各個(gè)方面或?qū)嵤┓桨傅南拗啤?/p>

303、本文使用氨基酸的名稱、三字母縮寫(xiě)或單字母縮寫(xiě)來(lái)指代氨基酸。本文所用的“蛋白質(zhì)”一詞包括蛋白質(zhì)、多肽和肽。本文中，“氨基酸序列”一詞與“多肽”和/或“蛋白質(zhì)”一詞同義。在某些情況下，“氨基酸序列”一詞與“肽”一詞同義。在某些情況下，“氨基酸序列”一詞與“酶”一詞同義。本文中“蛋白質(zhì)”和“多肽”這兩個(gè)術(shù)語(yǔ)可互換使用。在本公開(kāi)和權(quán)利要求中，可使用氨基酸殘基的常規(guī)單字母和三字母代碼。氨基酸的三字母代碼是根據(jù)國(guó)際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)-國(guó)際生物化學(xué)與分子生物學(xué)聯(lián)盟聯(lián)合委員會(huì)(iupac-iub?jcbn)的規(guī)定定義的。還應(yīng)理解，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，一種多肽可能由不止一種核苷酸序列編碼。

304、術(shù)語(yǔ)的其他定義可能貫穿整個(gè)說(shuō)明書(shū)出現(xiàn)。在更詳細(xì)地描述示例性實(shí)施方案之前，應(yīng)理解本公開(kāi)并不限于所描述的特定實(shí)施方案，因此可能會(huì)有所變化。還應(yīng)理解，本文所用的術(shù)語(yǔ)僅用于描述特定實(shí)施方案的目的，并非旨在進(jìn)行限制，因?yàn)楸竟_(kāi)的范圍僅由所附權(quán)利要求書(shū)限定。

305、當(dāng)提供一個(gè)數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解在該范圍的上限和下限之間，到下限單位的十分之一(除非上下文另有明確規(guī)定)的每個(gè)中間值也被具體公開(kāi)。在所述范圍內(nèi)的任何所述值或中間值與該范圍內(nèi)的任何其他所述值或中間值之間的每個(gè)較小范圍，均包含在本公開(kāi)內(nèi)。這些較小范圍的上限和下限可獨(dú)立地包含在該范圍中，或者排除在該范圍之外，并且在較小范圍內(nèi)任一個(gè)、兩個(gè)都不包含或兩個(gè)都包含界限的每個(gè)范圍，也都包含在本公開(kāi)內(nèi)，但需服從所述范圍中任何具體排除的界限。當(dāng)所述范圍包含一個(gè)或兩個(gè)界限時(shí)，排除所述包含界限中任一個(gè)或兩個(gè)的范圍也包含在本公開(kāi)內(nèi)。

306、必須注意，如本文和所附權(quán)利要求中所用，除非上下文另有明確規(guī)定，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“該”包括復(fù)數(shù)指代。因此，例如，提及“一種梭菌神經(jīng)毒素”包括多種此類候選物質(zhì)，提及“該梭菌神經(jīng)毒素”包括提及一種或多種梭菌神經(jīng)毒素及其本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的等效物，等等。

307、本文討論的出版物僅為其在本技術(shù)的申請(qǐng)日之前的公開(kāi)內(nèi)容而提供。本文中的任何內(nèi)容均不應(yīng)被解釋為承認(rèn)此類出版物構(gòu)成所附權(quán)利要求的現(xiàn)有技術(shù)。