本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥，具體涉及一種快速捕獲并清除細(xì)菌的糖接枝金屬-共價(jià)有機(jī)框架人工酶及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、由病原菌引起的傳染病對(duì)人類健康造成不可逆轉(zhuǎn)的損害，而抗生素過(guò)度使用導(dǎo)致的抗生素耐藥基因的流行。為了解決這一問(wèn)題，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種新型細(xì)菌滅活方法，包括酶療法、光動(dòng)力療法、離子滅菌療法、光熱療法（ptt）等多種技術(shù)。其中，光療和酶療法是兩種重要的治療手段。以過(guò)氧化物酶（pod）為例，它可以在酸性ime中被過(guò)表達(dá)的h2o2激活，成為一種有前景的原位細(xì)菌滅活治療方法。然而，盡管感染引發(fā)的h2o2水平相較于正常組織有所升高，但其水平仍然遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足，這為依賴h2o2依賴性羥基自由基（?oh）生成的酶療法帶來(lái)了重大挑戰(zhàn)。

2、目前，由于單一治療模式的療效有限，細(xì)菌耐藥性的困境尚未得到有效緩解。如何在有效消除細(xì)菌的同時(shí)避免細(xì)菌耐藥性的發(fā)展，仍然是臨床和科研人員面臨的重大挑戰(zhàn)。細(xì)菌附著在感染過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，它們可以通過(guò)庫(kù)侖力、范德華力和氫鍵等多種力附著在感染部位。隨后，這些細(xì)菌聚集、失去鞭毛，并開(kāi)始分泌細(xì)胞外基質(zhì)（ecm），導(dǎo)致不可逆的粘附，尤其是在免疫微環(huán)境（ime）中。因此，為了有效解決這一問(wèn)題，迫切需要開(kāi)發(fā)能夠干擾細(xì)菌與感染部位相互作用的細(xì)菌靶向智能材料，這些材料不僅可以根除和捕獲病原菌，還能有效重塑ime，克服細(xì)菌威脅。目前，通過(guò)合理的材料設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)功能轉(zhuǎn)化是研究的重點(diǎn)和挑戰(zhàn)，這種設(shè)計(jì)可以阻礙細(xì)菌的作用，最終延緩生物膜的形成。

3、共價(jià)有機(jī)框架（cofs）是一類新興的多功能材料，通過(guò)有機(jī)構(gòu)建單元以共價(jià)鍵連接而成。其多樣的化學(xué)鍵類型和結(jié)構(gòu)構(gòu)建單元為cofs提供了無(wú)盡的研究可能性，并在各種應(yīng)用中展現(xiàn)出巨大潛力。cofs具有獨(dú)特的化學(xué)穩(wěn)定性和可調(diào)性，可以作為結(jié)構(gòu)與功能的集成體，實(shí)現(xiàn)對(duì)材料性能的精確控制，預(yù)計(jì)將在生物醫(yī)學(xué)研究和臨床實(shí)踐中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。這些獨(dú)特特性使cofs能夠分離和聚集細(xì)菌細(xì)胞，最大限度地減少不良損害。然而，仍需要進(jìn)一步研究，通過(guò)合理的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和后修飾來(lái)解決功能靶向cofs生產(chǎn)中的挑戰(zhàn)，以實(shí)現(xiàn)功能集成，最大化其治療效果。糖類在生物體中無(wú)處不在，是構(gòu)成生命過(guò)程中三種關(guān)鍵物質(zhì)之一，涉及細(xì)菌感染、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和炎癥等生理過(guò)程。值得注意的是，細(xì)菌感染過(guò)程主要通過(guò)特定的糖-蛋白結(jié)合相互作用促進(jìn)，細(xì)菌對(duì)細(xì)胞的粘附依賴于宿主細(xì)胞表面糖分子的識(shí)別。糖生物學(xué)已成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)重要研究方向，然而如果用糖與細(xì)菌的糖-蛋白結(jié)合這種特異性識(shí)別來(lái)捕獲細(xì)菌，細(xì)菌與糖結(jié)合后會(huì)通過(guò)吞噬糖進(jìn)行代謝，反而促進(jìn)細(xì)菌的繁殖，無(wú)法實(shí)現(xiàn)捕獲并清除細(xì)菌。因此需要設(shè)計(jì)一種既能含有糖和共價(jià)有機(jī)框架的材料，不僅能實(shí)現(xiàn)捕獲并清除細(xì)菌，還能實(shí)現(xiàn)快速捕獲并清除細(xì)菌。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一種快速捕獲并清除細(xì)菌的糖接枝金屬-共價(jià)有機(jī)框架人工酶及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明首先制備了共價(jià)有機(jī)框架聚合物，然后將糖接枝在共價(jià)有機(jī)框架聚合物上，再將銅錨定到共價(jià)有機(jī)框架聚合物中，從而得到能快速捕獲并清除細(xì)菌的人工酶，可以在極低濃度、極短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)細(xì)菌的捕獲并清除。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明的第一方面，提供一種快速捕獲并清除細(xì)菌的糖接枝金屬-共價(jià)有機(jī)框架人工酶，所述糖接枝金屬-共價(jià)有機(jī)框架人工酶包括具有多孔結(jié)構(gòu)的共價(jià)有機(jī)框架聚合物；所述共價(jià)有機(jī)框架聚合物為含有卟啉的共價(jià)有機(jī)框架聚合物，所述卟啉通過(guò)四配位中心與金屬配位，使得金屬錨定在共價(jià)有機(jī)框架聚合物中；所述共價(jià)有機(jī)框架聚合物上接枝糖；所述糖為單糖；所述金屬為銅。

4、優(yōu)選的，所述共價(jià)有機(jī)框架聚合物由2,6-雙(2-丙炔氧基)萘-1,5-二甲醛和四氨基苯基卟啉共聚得到。

5、優(yōu)選的，所述單糖為甘露糖。

6、本發(fā)明的第二方面，提供糖接枝金屬-共價(jià)有機(jī)框架人工酶的制備方法，包括以下步驟：

7、（1）將四氨基苯基卟啉和2,6-雙(2-丙炔氧基)萘-1,5-二甲醛加入有機(jī)溶劑中，加熱反應(yīng)得到深紫色粉末pn-cof；

8、（2）向thf、h2o和叔丁醇的混合液中加入碘化亞銅、pn-cof、n,n-二異丙基乙胺和疊氮修飾的糖得到懸浮液，懸浮液在保護(hù)氛圍下室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，反應(yīng)結(jié)束后，過(guò)濾固體并洗滌、干燥，得到棕色固體cof-糖；

9、（3）將cof-糖和醋酸銅加入甲醇中，加熱回流反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，冷卻并過(guò)濾，得到紫黑色粉末cu-cof-糖；

10、（4）向cu-cof-糖中加入甲醇溶液，超聲分散均勻；隨后加入含有甲醇鈉的甲醇溶液，室溫下在保護(hù)氣氛中靜置過(guò)夜，過(guò)濾、洗滌、干燥，得到棕色固體scu-cof-糖，即為糖接枝金屬-共價(jià)有機(jī)框架人工酶。

11、優(yōu)選的，步驟（1）中，所述四氨基苯基卟啉和2,6-雙(2-丙炔氧基)萘-1,5-二甲醛的摩爾比為1：2；所述有機(jī)溶劑為1,4-二氧六環(huán)、均三甲苯和乙酸按體積比6:3:2混合得到的；所述加熱反應(yīng)的溫度為120℃，加熱反應(yīng)的時(shí)間為5天。

12、優(yōu)選的，步驟（2）中，所述thf、h2o和叔丁醇的體積比為3：1：1；所述碘化亞銅、pn-cof、n,n-二異丙基乙胺和疊氮修飾的糖的加入量之比為27.69?mg：100?mg：87?μl：10?mg。

13、優(yōu)選的，所述疊氮修飾的糖為疊氮修飾的甘露糖。

14、優(yōu)選的，步驟（3）中，所述cof-糖和醋酸銅的質(zhì)量比為5：1；所述加熱回流反應(yīng)的溫度為65℃，加熱回流反應(yīng)的時(shí)間為5天。

15、優(yōu)選的，步驟（4）中，所述cu-cof-糖、甲醇和含有甲醇鈉的甲醇溶液的加入量之比為25：4：1；所述含有甲醇鈉的甲醇溶液的濃度為1m。

16、本發(fā)明的第三方面，提供糖接枝金屬-共價(jià)有機(jī)框架人工酶（scu-cof-man）在制備抗菌藥物或清除生物膜藥物中的應(yīng)用，所述糖接枝金屬-共價(jià)有機(jī)框架人工酶濃度為75?μg/ml，在1~2h內(nèi)捕獲并清除細(xì)菌。

17、本發(fā)明的有益效果：

18、（1）本發(fā)明制備的糖接枝金屬-共價(jià)有機(jī)框架人工酶（scu-cof-man）具有光響應(yīng)性，可作為高效殺菌、傷口愈合的智能平臺(tái)。糖分子在整個(gè)抗菌過(guò)程中不僅促進(jìn)了光熱治療（ptt）和光動(dòng)力治療（pdt）效果，還對(duì)細(xì)菌具有強(qiáng)吸附作用，并抑制了細(xì)菌細(xì)胞膜的合成。同時(shí)，金屬離子的加入還提供了過(guò)氧化氫酶活性，生成大量有毒的ros以提供殺菌力；并且scu-cof-man在治療劑量下具有非凡的生物安全性，極大地?cái)U(kuò)展了應(yīng)用前景。這項(xiàng)工作為開(kāi)發(fā)具有新型糖修飾的cof結(jié)構(gòu)提供了創(chuàng)新策略。

19、（2）本發(fā)明的scu-cof-man不僅能實(shí)現(xiàn)捕獲并清除細(xì)菌，還能實(shí)現(xiàn)快速捕獲并清除細(xì)菌，可在極低濃度下（75?μg/ml）在1~2h內(nèi)快速捕獲并清除細(xì)菌，與采用電荷吸附細(xì)菌的多孔聚合物人工酶相比，殺菌速度更快，且藥物濃度極低。為快速捕獲細(xì)菌并殺菌提供了新的思路。

20、（3）本發(fā)明利用糖對(duì)于病原體的靶向能力以及糖所含的多羥基基團(tuán)介導(dǎo)定向功能化，立體化學(xué)多樣性實(shí)現(xiàn)空間調(diào)控，天然生物相容性保障生理耐受性。