本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種治療膿毒癥的熱敏水凝膠及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、膿毒癥是一種高度異質(zhì)性綜合征，是由宿主對(duì)感染的不平衡反應(yīng)引起的。膿毒癥被定義為一種由機(jī)體對(duì)感染反應(yīng)失調(diào)引起的危及生命的器官功能障礙。在膿毒癥的發(fā)病過程中，盡管感染是觸發(fā)事件，但當(dāng)感染被成功治療后，異常的免疫反應(yīng)往往仍然存在。而身體啟動(dòng)抗感染的過程中，會(huì)導(dǎo)致器官功能不良。因此，膿毒癥可能發(fā)展為感染性休克，導(dǎo)致血壓驟降，會(huì)損害肺、腎、肝和其他器官，嚴(yán)重時(shí)甚至可能導(dǎo)致死亡。

2、在過去幾十年中，已經(jīng)實(shí)施了幾種針對(duì)膿毒癥的治療方案，但是膿毒癥死亡率卻依然很高。最新研究表明，由于病原體感染，機(jī)體中會(huì)產(chǎn)生大量脂多糖(lps)和cfdna，使機(jī)體反應(yīng)過激，進(jìn)而導(dǎo)致“炎癥因子風(fēng)暴”的發(fā)生，這里的炎癥因子即促炎細(xì)胞因子，而大多數(shù)的促炎細(xì)胞因子等電點(diǎn)小于7.4，即在弱堿性的人體環(huán)境中，促炎細(xì)胞因子帶負(fù)電荷。由病原體產(chǎn)生的lps和由宿主細(xì)胞損傷產(chǎn)生的cfdna均帶負(fù)電。針對(duì)這一特性，有研究報(bào)導(dǎo)，將帶正電荷的固態(tài)樹脂植入腹腔中，通過靜電吸附與促炎細(xì)胞因子結(jié)合，阻斷“炎癥因子風(fēng)暴”的發(fā)生，使得小鼠生存率顯著上升。

3、熱敏水凝膠材料是一種具有獨(dú)特性能的新型材料，具有熱敏性和水凝膠特性。通過外界溫度變化改變其物理狀態(tài)，通常在低溫條件下保持液態(tài)，而37℃條件下轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)。由于其具有可注射性，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)病變組織精準(zhǔn)給藥，與病變組織緊密貼合，且固化水凝膠會(huì)發(fā)生溶脹，釋放水凝膠網(wǎng)絡(luò)中的藥物。此外，因其快速的溫度響應(yīng)、微創(chuàng)的給藥方式、藥物的高載藥率和高釋藥率等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，使其在載藥、機(jī)體、細(xì)胞水平研究等醫(yī)學(xué)方面發(fā)揮極大的作用。

4、但是現(xiàn)在常用的熱敏水凝膠主要通過殺菌達(dá)到消炎的目的，作用方式比較單一，而且，熱敏水凝膠在制備過程中涉及多步聚合反應(yīng)，還要去除未反應(yīng)的單體和雜質(zhì)等，導(dǎo)致制備過程復(fù)雜，在一定程度上限制了熱敏水凝膠的應(yīng)用范圍。

5、因此，開發(fā)一種制備過程簡單、作用方式多樣的熱敏水凝膠，對(duì)于進(jìn)一步擴(kuò)大其在膿毒癥的應(yīng)用具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)上述難題，本發(fā)明提供了一種治療膿毒癥的熱敏水凝膠及其制備方法和應(yīng)用，該熱敏水凝膠fk/ag?np@gcs具有抗菌、抗炎、抗氧化、清除炎癥介質(zhì)等作用，可以從多角度干擾膿毒癥的發(fā)展進(jìn)程。

2、為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

3、一種治療膿毒癥的熱敏水凝膠，包括抗菌成分、抗炎成分、抗氧化部分和炎癥介質(zhì)清除部分；所述抗菌成分和抗炎成分包括抗菌肽fk13-a1和納米銀；所述抗氧化部分包括修飾在納米銀顆粒表面的單寧酸分子；所述炎癥介質(zhì)清除部分包括胍基乙酸修飾的殼聚糖、抗菌肽fk13-a1和納米銀。

4、本發(fā)明使用胍基乙酸改性殼聚糖為基底材料，在其中添加納米銀和fk13-a1，以β-甘油磷酸鈉(β-gp)為熱敏劑制備熱敏水凝膠fk/ag?np@gcs，該水凝膠在4℃條件下為清澈透明的膠狀液體，當(dāng)外界溫度提升至37℃時(shí)，水凝膠物理狀態(tài)發(fā)生改變，由原來的液態(tài)變?yōu)槿彳浀墓虘B(tài)，并且顏色變?yōu)槿榘咨?。在腹腔感染引發(fā)的膿毒癥防治過程中，通過腹腔注射的方式將液態(tài)水凝膠注射入腹腔，在體溫條件下水凝膠轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)，并釋放納米銀和抗菌肽fk13-a1發(fā)揮抗菌和抗炎作用，同時(shí)抗菌肽還會(huì)與細(xì)菌裂解時(shí)釋放的lps相互結(jié)合，而含有豐富羥基的單寧酸可通過氫鍵與內(nèi)環(huán)境中的cfdna分子結(jié)合，在源頭上清除病原體，同時(shí)減少病原相關(guān)分子模式和損傷相關(guān)分子模式進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，引發(fā)嚴(yán)重的“炎癥因子風(fēng)暴”。同時(shí)免疫細(xì)胞過度產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子會(huì)被腹腔中的改性殼聚糖所捕獲，進(jìn)一步抑制“炎癥因子風(fēng)暴”的發(fā)生。因此，本發(fā)明成功開發(fā)了一種安全、有效且吸附效果良好的熱敏水凝膠，具有重要的應(yīng)用前景。

5、單寧酸是一種天然的抗氧化劑，在其分子中含有豐富的羥基。在本發(fā)明中，將單寧酸作為保護(hù)劑，使用硼氫化鈉為還原劑，成功合成了直徑大概50nm的納米銀。

6、優(yōu)選地，所述抗菌肽fk13-a1的氨基酸序列為ac-wkrivrrikrwlr-nh2(seq?idno.1)。

7、fk13-a1是一種由13個(gè)氨基酸組成的α-螺旋短肽，是將人源抗菌肽ll-37通過優(yōu)化修飾而得到的一段氨基酸序列，由于其序列中含有多個(gè)堿性氨基酸，因此分子整體帶正電荷。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，納米銀和fk13-a1均具有良好的抗菌和抗炎活性，通過對(duì)銅綠假單胞菌和大腸桿菌的fic實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)納米銀和fk13-a1有協(xié)同抗菌作用。

8、本發(fā)明還提供了一種所述的熱敏水凝膠的制備方法，包括如下過程：

9、s1、納米銀合成：以agno3為合成原料，單寧酸作為保護(hù)劑，硼氫化鈉作為催化劑合成納米銀，凍干成粉末狀備用；

10、s2、配制β甘油磷酸鈉預(yù)備液，備用；

11、s3、胍基乙酸修飾的殼聚糖的合成：在1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs/edc)作為催化劑的條件下，將氨基乙酸修飾到殼聚糖分子上，進(jìn)一步通過透析和凍干，制得；

12、s4、fk/ag?np@gcs的構(gòu)建：將步驟s3制得的胍基乙酸修飾的殼聚糖，步驟s2配制的fk13-a1預(yù)備液，步驟s1制得的納米銀，冰浴條件下充分?jǐn)嚢杌靹颍缓笙蚱渲芯徛渭硬襟Es2制得的β甘油磷酸鈉預(yù)備液，待水凝膠出現(xiàn)清澈-渾濁-清澈的現(xiàn)象，隨后將水凝膠在4℃下保存，得到液態(tài)水凝膠。

13、殼聚糖是自然界唯一帶正電荷的多糖，可從甲殼類動(dòng)物中獲取。殼聚糖不溶于水，可溶解于質(zhì)量濃度為1％的酸中，這是由殼聚糖的晶體結(jié)構(gòu)所決定的。而胍基乙酸是一種天然的氨基酸衍生物，是肌酸的直接前體。在本發(fā)明中，使用催化劑nhs/edc將胍基乙酸的羧基與殼聚糖2號(hào)位上的氨基通過酰胺鍵結(jié)合到一起，破壞了殼聚糖的晶體結(jié)構(gòu)，使得改性后的殼聚糖可溶解于水中，同時(shí)在原有氨基的基礎(chǔ)上，成功修飾上胍基，使得殼聚糖分子的正電荷密度提升。

14、優(yōu)選地，步驟s2中所述β甘油磷酸鈉預(yù)備液的配制過程為：將β-gp粉末加入到雙蒸水中，配制成質(zhì)量濃度為45～55％的溶液，即得。

15、優(yōu)選地，步驟s4中胍基乙酸修飾的殼聚糖，fk13-a1預(yù)備液，納米銀的加入量為：步驟s4中胍基乙酸修飾的殼聚糖，fk13-a1粉末，步驟s1制得的納米銀粉末的加入的質(zhì)量之比為mcs：mfk13-a1：magnp＝20：1：1。

16、優(yōu)選地，步驟s4中所述冰浴條件下充分?jǐn)嚢杈鶆虻臈l件為：于0～3℃下，500～800rpm轉(zhuǎn)速攪拌15～25min。

17、本發(fā)明還提供了一種所述的熱敏水凝膠在制備治療膿毒癥藥物中的應(yīng)用。

18、優(yōu)選地，所述藥物中還包括生理鹽水和藥學(xué)上常用的載體。

19、腹腔感染引發(fā)的膿毒癥發(fā)生過程中涉及多種細(xì)胞和分子的相互作用，包括病原體入侵、病原相關(guān)分子模式釋放、損傷相關(guān)分子模式釋放、炎癥細(xì)胞的激活和細(xì)胞因子的釋放等。本發(fā)明以殼聚糖為基底材料，使用胍基乙酸修飾，破壞殼聚糖晶體結(jié)構(gòu)的同時(shí)在殼聚糖分子的2號(hào)位上修飾上胍基，增加殼聚糖的陽離子基團(tuán)數(shù)量，進(jìn)一步增強(qiáng)其對(duì)陰離子或帶負(fù)電分子的吸附效果；其次，將一定量的抗菌肽fk13-a1和ag?np(納米銀)摻入殼聚糖溶液中，并加入熱敏劑β-gp，制成在4℃條件下為液態(tài)而在37℃條件下轉(zhuǎn)化為固態(tài)的水凝膠。在膿毒癥的防治過程中，液態(tài)水凝膠通過注射方式進(jìn)入腹腔，在37℃體溫條件下水凝膠轉(zhuǎn)化為固態(tài)，并在腹腔中發(fā)生溶脹，釋放抗菌肽fk13-a1和ag?np，二者協(xié)同抗菌；其次，釋放的抗菌肽fk13-a1和ag?np具有顯著抗炎作用，抗菌肽fk13-a1會(huì)與lps結(jié)合，ag?np表面的ta(單寧酸)存在豐富的羥基，可通過氫鍵與lps和cfdna結(jié)合，防止lps和cfdna擴(kuò)散；最后，在人體正常生理ph條件下，經(jīng)胍基乙酸改性的殼聚糖帶正電，而經(jīng)相關(guān)研究報(bào)道，大多數(shù)促炎細(xì)胞因子的等電點(diǎn)pi小于7，例如tnf-α(pi＝6.4)、il-6(pi＝6.2)、il-1β(pi＝4.7)和hmgb?1(pi＝5.6)，在中性環(huán)境中帶負(fù)電。因此改性殼聚糖可以通過靜電吸附與促炎細(xì)胞因子結(jié)合，防止炎癥因子風(fēng)暴的產(chǎn)生。

20、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的熱敏水凝膠的技術(shù)優(yōu)勢(shì)如下：

21、(1)本發(fā)明提供了一種胍基乙酸修飾的殼聚糖，相較于殼聚糖，修飾后的殼聚糖具有更好的水溶性，并且有更好的抗菌抗炎效果。

22、(2)本發(fā)明提供的熱敏水凝膠fk/ag?np@gcs，可以通過注射的方式進(jìn)入腹腔，實(shí)現(xiàn)了腹腔內(nèi)抗感染、抗炎和清除炎癥介質(zhì)，從多角度干擾膿毒癥發(fā)展進(jìn)程，實(shí)現(xiàn)了對(duì)膿毒癥的多方位防治；

23、(3)本發(fā)明提供的熱敏水凝膠fk/ag?np@gcs制備方法簡單易操作，適用于工業(yè)化生產(chǎn)，為進(jìn)一步擴(kuò)大熱敏水凝膠的應(yīng)用范圍奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。