：本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種工程化線粒體藥物的組成、制備方法及其在防治炎癥、氧化應(yīng)激相關(guān)疾病及線粒體功能失調(diào)相關(guān)疾病中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

0、
背景技術(shù)：

1、線粒體是細(xì)胞內(nèi)主要的能量來源，同時也是活性氧(ros)的主要產(chǎn)生者，參與細(xì)胞的許多重要過程，尤其是在細(xì)胞氧化還原/氧化平衡中發(fā)揮巨大的作用，與細(xì)胞的生長和凋亡息息相關(guān)。線粒體活性氧主要來源于電子傳遞鏈的活動,是正常線粒體在氧化磷酸化和分子氧還原產(chǎn)生能量過程中由于電子泄露而產(chǎn)生的超氧化物，這些超氧化物可以進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為過氧化氫，參與細(xì)胞信號傳導(dǎo)路徑，調(diào)節(jié)多種生理過程。在正常生理?xiàng)l件下，ros的產(chǎn)生是受到嚴(yán)格調(diào)控的，盡管低水平的ros可以作為信號分子促進(jìn)細(xì)胞生長和存活，然而在異常的疾病微環(huán)境下，線粒體的功能可能會受到影響，受損的線粒體會釋放大量的活性氧，當(dāng)活性氧的生成超過了細(xì)胞的抗氧化能力則會導(dǎo)致氧化應(yīng)激，這種失衡會導(dǎo)致細(xì)胞死亡，引起組織損傷，參與多種急慢性炎癥或氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的病理進(jìn)程。因此，針對線粒體功能和氧化應(yīng)激的治療策略正在成為研究的熱點(diǎn)，旨在通過改善線粒體功能和減少氧化、炎癥損傷來延緩疾病的進(jìn)展。

2、鑒于線粒體是活性氧的主要產(chǎn)生者，將抗氧化劑選擇性地靶向至線粒體以清除已產(chǎn)生的過量活性氧是治療上述疾病的一個重要策略。目前，主要通過線粒體靶向單元直接修飾藥物分子或利用納米遞送載體實(shí)現(xiàn)藥物的線粒體靶向，常用的靶向修飾單元多為離域親脂性陽離子，如三苯基膦、羅丹明、地喹氯銨等。這些陽離子具有較好的親脂性，既能夠穿透細(xì)胞的細(xì)胞膜和線粒體膜，又不會因?yàn)橛H脂性過高而積聚在細(xì)胞膜中。由于線粒體的內(nèi)膜電位為負(fù)，正電荷物質(zhì)可輕易穿過線粒體膜，在線粒體內(nèi)大量聚集，因此可通過將親脂性陽離子附著到生物活性化合物上，以改善其線粒體攝取。此外，ss31作為一種線粒體穿透肽，近年來在治療多種線粒體相關(guān)疾病中顯示出良好的前景。該肽通過靶向線粒體內(nèi)膜，能夠有效地傳遞藥物和其他生物活性分子，從而改善線粒體功能并減輕氧化應(yīng)激。

3、近年來，臨床前研究和臨床試驗(yàn)均表明，基于直接線粒體移植或細(xì)胞間線粒體轉(zhuǎn)移的線粒體療法可有效治療多種與線粒體功能障礙相關(guān)的疾病，包括急性肺損傷、帕金森病、缺血性中風(fēng)、心力衰竭、心肌梗死、脂肪肝、肺纖維化等疾病。如專利申請?zhí)枮閏n202110454259.3的專利公開了一種工程化線粒體及其制備方法，其工程化的線粒體由外源細(xì)胞膜結(jié)合至外源線粒體的外膜，可以制備得到具有較高的生物活性，對線粒體功能障礙性疾病具有較好的治療效果的線粒體，從機(jī)制上，外源性轉(zhuǎn)移的線粒體在進(jìn)入受體細(xì)胞后，可以與胞內(nèi)原有的線粒體網(wǎng)絡(luò)融合、觸發(fā)受體細(xì)胞的自噬過程，調(diào)控、修復(fù)受損的線粒體以減少活性氧的釋放，同時在細(xì)胞能量代謝中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。但是，外源線粒體并未被報道具有高效的活性氧清除能力，在某些情況下，外源性線粒體的移植反而可能導(dǎo)致ros的積累，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)，限制其在氧化應(yīng)激相關(guān)疾病中的療效。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

0、
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

1、(一)解決的技術(shù)問題

2、針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種工程化線粒體藥物，并驗(yàn)證該工程化線粒體藥物通過清除局部活性氧和調(diào)控線粒體功能的協(xié)同作用在防治各種炎癥、氧化應(yīng)激相關(guān)疾病及線粒體功能失調(diào)相關(guān)疾病中的作用優(yōu)勢，可以解決現(xiàn)有的外源性線粒體可能導(dǎo)致ros的積累，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)，限制其在氧化應(yīng)激相關(guān)疾病中療效的問題。

3、(二)技術(shù)方案

4、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案：

5、一種工程化線粒體藥物，包括線粒體及其表面修飾模塊，其中所述線粒體和所述表面修飾模塊的質(zhì)量比為0.5:1到50:1之間(0.5-50:1)，所述工程化線粒體藥物的粒徑在100-500nm之間。

6、進(jìn)一步地，所述表面修飾模塊由骨架材料、線粒體靶向單元和生物活性功能單元構(gòu)成，所述骨架材料、所述線粒體靶向單元和所述生物活性單元的質(zhì)量比為0.01:1:1到4:1:1之間(0.01-4:1:1)。

7、進(jìn)一步地，所述表面修飾模塊的所述骨架材料為八臂聚乙二醇，所述生物活性單元為4-羥甲基苯硼酸頻哪醇酯或tempol，所述線粒體靶向單元為線粒體穿透肽ss31，所述表面修飾模塊的化學(xué)結(jié)構(gòu)為

8、

9、其中：

10、主體骨架材料為8arm-peg-cooh，mw＝10kda；

11、r為且每個環(huán)糊精分子中至少有一個r基團(tuán)

12、八臂聚乙二醇作為偶聯(lián)生物活性單元和線粒體靶向單元的生物相容性支架；生物活性單元4-羥甲基苯硼酸頻哪醇酯作為ros響應(yīng)/清除基團(tuán)，tempol作為超氧化物歧化酶模擬單元；線粒體靶向單元為線粒體穿透肽ss31，具有靶向線粒體內(nèi)膜心磷脂的偶聯(lián)作用。

13、所述線粒體包括從組織或細(xì)胞分離純化提取的線粒體，所述表面修飾模塊在溶于水后與重懸于水中的所述線粒體混合，5000-10000×g離心10-20分鐘后，去除上清收集沉淀，即為工程化修飾的線粒體。

14、本發(fā)明還提供了一種表面修飾模塊的制備方法，通過pbe和線粒體靶向單元在八臂聚乙二醇羧基上的順序偶聯(lián)，合成一種抗氧化大分子材料；

15、上述制備方法具體包括以下步驟：

16、s1，將八臂聚乙二醇羧基、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺和n-羥基丁二酰亞胺溶解在有機(jī)溶劑中，于25～65℃攪拌12～24h后，用鹽水洗滌反應(yīng)溶液，收集得到有機(jī)相；用硫酸鎂進(jìn)行干燥，有機(jī)溶劑經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去后得到粗產(chǎn)物。

17、s2，將得到的粗產(chǎn)物溶解于有機(jī)溶劑中，用冷醚沉淀得到白色的八臂聚乙二醇琥珀酰亞胺酯(8peg-nhs)固體產(chǎn)物。將8peg-nhs、甘氨酸偶聯(lián)pbe(gly-pbe)和三乙胺溶于有機(jī)溶劑中，25～65℃攪拌1～4h后，在反應(yīng)溶液中加入線粒體靶向單元和三乙胺。15～35℃反應(yīng)12～24h后，將溶液放入透析袋在有機(jī)溶劑中透析1～2天，將收集的透析液從乙醚中析出，得到白色的固體產(chǎn)物8arm?peg-pbap/ss31(psp)，此為所述表面修飾模塊psp。

18、s3，將步驟s2中的甘氨酸偶聯(lián)pbe?gly-pbe替換為等摩爾量的nh2-tpl，重復(fù)s1與s2的方法可合成8arm?peg-tpl/ss31(pst)，此為所述表面修飾模塊pst。

19、具體地，上述八臂聚乙二醇羧基在有機(jī)相的濃度為0.1-10mg/ml；所述八臂聚乙二醇琥珀酰亞胺酯、甘氨酸偶聯(lián)pbe以及線粒體靶向單元在有機(jī)相的濃度為0.1-100mg/ml；所述有機(jī)溶劑選自二氯甲烷、甲醇或混合溶劑，所述混合溶劑為甲醇/乙醇、甲醇/dmso、甲醇/四氫呋喃、甲醇/丙酮、甲醇/dmf或甲醇/乙腈中的任意一種，上述混合溶劑中甲醇與另一種溶劑的混合比例為1ml：1～10ml。

20、本發(fā)明還提供上述工程化線粒體藥物在預(yù)防和治療各種急慢性炎癥、氧化應(yīng)激相關(guān)疾病及線粒體功能失調(diào)相關(guān)疾病中的應(yīng)用。

21、所述炎癥包括變態(tài)反應(yīng)性炎癥、非特異性炎癥、感染性炎癥以及炎癥相關(guān)性疾病，所述非特異性炎癥為物理性炎癥，包括外傷或手術(shù)引起的紅腫、疼痛；所述感染性炎癥包括細(xì)菌、細(xì)菌產(chǎn)物或病毒造成的炎癥；所述線粒體功能失調(diào)相關(guān)疾病包括骨關(guān)節(jié)炎、椎間盤退行性病變。

22、本發(fā)明以椎間盤退行性病變?yōu)槟Ｐ?，?yàn)證本發(fā)明的藥物在防治炎癥相關(guān)疾病中的作用。所述給藥方式包括關(guān)節(jié)腔內(nèi)局部注射、靜脈注射、皮下注射、肌肉注射，以及以上方式的任意組合。

23、(三)有益效果

24、本發(fā)明的有益效果在于：

25、(1)本發(fā)明提供的工程化線粒體藥物能夠在體外實(shí)現(xiàn)活性氧的有效清除。

26、(2)本發(fā)明提供的表面修飾模塊具有良好的線粒體結(jié)合效果。

27、(3)本發(fā)明提供的表面修飾模塊具有良好的體內(nèi)生物相容性，在體內(nèi)可降解，且降解產(chǎn)物對機(jī)體無毒副作用。

28、(4)本發(fā)明提供的表面修飾模塊可通過在水溶液中的簡單混合、離心，對純化線粒體進(jìn)行修飾；與純化線粒體結(jié)合的表面修飾模塊，在體內(nèi)炎癥氧化應(yīng)激微環(huán)境中仍能夠保持較好的結(jié)合穩(wěn)定性。

29、(5)本發(fā)明提供的工程化線粒體藥物，能夠通過局部活性氧的清除和線粒體移植的協(xié)同作用而發(fā)揮療效，對骨關(guān)節(jié)炎、椎間盤退行性病變、心力衰竭、心肌缺血/再灌注損傷、缺血性腦卒中、炎癥性腸炎和動脈粥樣硬化的治療效果明顯優(yōu)于其它小分子藥物對照組、未經(jīng)修飾的普通線粒體移植對照組。

30、(6)本發(fā)明提供的功能化修飾線粒體的抗炎抗氧化生物材料制備方法相對簡單且成本較低，易于實(shí)現(xiàn)生物材料的產(chǎn)業(yè)化。