本發(fā)明涉及一種多聚聯(lián)芐化合物及其制備方法與用途。

背景技術：

現(xiàn)有文獻報道了如下所示的聯(lián)芐類化合物，具有抑制被動皮膚過敏反應(passive cutaneous anaphylaxis)以及抑制RBL-2H3細胞(嗜堿性細胞白血病細胞)釋放β-己糖胺酶的藥效和用途(見：Matsuda H et al.Antiallergic Phenanthrenes and…Planta Med 2004；70:847-855)：

目前，未見有本發(fā)明式Ⅰ所示多聚聯(lián)芐化合物的研究報道，更未見有本發(fā)明式Ⅰ所示多聚聯(lián)芐化合物用于制備抗腫瘤藥物的研究報道。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種結構和藥用價值都不同的新的多聚聯(lián)芐化合物：式Ⅰ所示的化合物。

本發(fā)明提供的式Ⅰ所示的化合物或其藥學上可接受的鹽、晶型、溶劑合物：

其中，

R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈分別獨立地選自H、羥基、巰基、C₁～C₄烷基或C₁～C₄烷氧基。

進一步的，R₁、R₃、R₅、R₈分別獨立地選自C₁～C₄烷基或C₁～C₄烷氧基；R₂、R₄、R₆、R₇分別獨立地選自H、羥基或巰基。

進一步的，R₁、R₃、R₅、R₈分別獨立地選自甲氧基、乙氧基、正丙氧基或異丙氧基；R₂、R₄、R₆、R₇分別獨立地選自羥基或巰基。

進一步的，所述的化合物為

本發(fā)明提高了一種制備化合物Y的方法，它包括以下步驟：

i、取白及，用乙醇提取，得到乙醇提取液；

ii、取乙醇提取液，濃縮，得到流浸膏；

iii、將流浸膏用水分散，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，合并乙酸乙酯部分，回收溶劑，得到乙酸乙酯浸膏；

iv、取乙酸乙酯浸膏，采用硅膠柱色譜，依次以石油醚-丙酮＝100:1、50:1、30:1為洗脫劑進行梯度洗脫，得到石油醚-丙酮＝30:1時的洗脫液Fr.16；

v、Fr.16上反相聚苯乙烯型樹脂柱，依次以乙醇-水＝10:90、30:70、50:50、70:30、90:10、100:0為洗脫劑進行梯度洗脫，得到乙醇-水＝100:0時的Fr.16-j；

vi、Fr.16-j上葡聚糖凝膠色譜柱，以二氯甲烷-甲醇＝1:1為洗脫劑，依次洗脫0.8倍柱體積、2.2倍柱體積，分別得到Fr.16-j-1、Fr.16-j-2；

vii、Fr.16-j-2經(jīng)過硅膠柱色譜，依次以二氯甲烷-甲醇＝1:0、200:1、100:1為洗脫劑，分別洗脫3個柱體積，回收溶劑，收集二氯甲烷-甲醇＝100:1時的Fr.16-j-2c；

viii、Fr.16-j-2c經(jīng)過制備薄層色譜，以二氯甲烷-丙酮＝20:1為展開劑，R_f＝0.60，得到樣品，然后用反相高效液相色譜進行分離，以甲醇-水＝78:22為洗脫劑進行洗脫，在210nm波長下進行檢測，收集28min的組分，得到化合物Y。

進一步的，

步驟iv中，所述乙酸乙酯浸膏的量為155～165g，梯度洗脫的條件如下：

步驟v中，所述Fr.16的量為15～20g，梯度洗脫的條件如下：

本發(fā)明還提供了上述的化合物或其藥學上可接受的鹽、晶型、溶劑合物在制備治療和/或預防腫瘤的藥物中的用途。

進一步的，所述的腫瘤為肺癌和/或急性白血病。

本發(fā)明還提供了一種治療和/或預防腫瘤的藥物組合物，它是以上述化合物或其藥學上可接受的鹽、晶型、溶劑合物為活性成分，加上藥學上常用的輔料制備得到的制劑。

進一步的，所述的腫瘤為肺癌和/或急性白血病。

本發(fā)明的多聚聯(lián)芐化合物，與現(xiàn)有的聯(lián)芐類化合物相比，在結構上差異很大；并且，本發(fā)明多聚聯(lián)芐化合物具有新的藥效：對腫瘤細胞具有很好的抑制作用，特別是，對肺癌細胞具有很好的抑制作用，此外，本發(fā)明多聚聯(lián)芐化合物還對急性單白血病細胞的增殖具有顯著的抑制活性；同時，本發(fā)明多聚聯(lián)芐化合物的制備方法簡便，反應條件溫和，便于操作和控制，能耗小，產(chǎn)率高，成本低，非常適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

本發(fā)明中提供的化合物和衍生物可以根據(jù)IUPAC(國際純粹與應用化學聯(lián)合會)或CAS(化學文摘服務社，Columbus，OH)命名系統(tǒng)命名。

關于本發(fā)明的使用術語的定義：除非另有說明，本文中基團或者術語提供的初始定義適用于整篇說明書的該基團或者術語；對于本文沒有具體定義的術語，應該根據(jù)公開內容和上下文，給出本領域技術人員能夠給予它們的含義。

“取代”是指分子中的氫原子被其它不同的原子或分子所替換。

碳氫基團中碳原子含量的最小值和最大值通過前綴表示，例如，前綴C_a～C_b烷基表明任何包含“a”至“b”個碳原子的烷基。因此，例如，C₁～C₄烷基是指包含1～4個碳原子的烷基，換句話說，C₁～C₄烷基包括甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基。

術語“藥學上可接受的”是指某載體、運載物、稀釋劑、輔料，和/或所形成的鹽通常在化學上或物理上與構成某藥物劑型的其它成分相兼容，并在生理上與受體相兼容。

術語“鹽”和“可藥用的鹽”是指上述化合物或其立體異構體，與無機和/或有機酸和堿形成的酸式和/或堿式鹽，也包括兩性離子鹽(內鹽)，還包括季銨鹽，例如烷基銨鹽。這些鹽可以是在化合物的最后分離和純化中直接得到。也可以是通過將上述化合物，或其立體異構體，與一定數(shù)量的酸或堿適當(例如等當量)進行混合而得到。這些鹽可能在溶液中形成沉淀而以過濾方法收集，或在溶劑蒸發(fā)后回收而得到，或在水介質中反應后冷凍干燥制得。本發(fā)明中所述鹽可以是化合物的鹽酸鹽、硫酸鹽、枸櫞酸鹽、苯磺酸鹽、氫溴酸鹽、氫氟酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽、丙酸鹽、丁二酸鹽、草酸鹽、蘋果酸鹽、琥珀酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸鹽、酒石酸鹽或三氟乙酸鹽。

本發(fā)明化合物或藥物組合物的施用方式?jīng)]有特別限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、腸胃外(靜脈內、肌肉內或皮下)、和局部給藥。

用于口服給藥的固體劑型包括膠囊劑、片劑、丸劑、散劑和顆粒劑。在這些固體劑型中，活性化合物與至少一種常規(guī)惰性賦形劑(或載體)混合，如檸檬酸鈉或磷酸二鈣，或與下述成分混合：(a)填料或增容劑，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合劑，例如，羥甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯膠；(c)保濕劑，例如，甘油；(d)崩解劑，例如，瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些復合硅酸鹽、和碳酸鈉；(e)緩溶劑，例如石蠟；(f)吸收加速劑，例如，季胺化合物；(g)潤濕劑，例如鯨蠟醇和單硬脂酸甘油酯；(h)吸附劑，例如，高嶺土；和(i)潤滑劑，例如，滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、十二烷基硫酸鈉，或其混合物。膠囊劑、片劑和丸劑中，劑型也可包含緩沖劑。

固體劑型如片劑、糖丸、膠囊劑、丸劑和顆粒劑可采用包衣和殼材制備，如腸衣和其它本領域公知的材料。它們可包含不透明劑，并且，這種組合物中活性化合物或化合物的釋放可以延遲的方式在消化道內的某一部分中釋放?？刹捎玫陌窠M分的實例是聚合物質和蠟類物質。必要時，活性化合物也可與上述賦形劑中的一種或多種形成微膠囊形式。

用于口服給藥的液體劑型包括藥學上可接受的乳液、溶液、懸浮液、糖漿或酊劑。除了活性化合物外，液體劑型可包含本領域中常規(guī)采用的惰性稀釋劑，如水或其它溶劑，增溶劑和乳化劑，例知，乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特別是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油或這些物質的混合物等。

除了這些惰性稀釋劑外，組合物也可包含助劑，如潤濕劑、乳化劑和懸浮劑、甜味劑、矯味劑和香料。

除了活性化合物外，懸浮液可包含懸浮劑，例如，乙氧基化異十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脫水山梨醇酯、微晶纖維素、甲醇鋁和瓊脂或這些物質的混合物等。

用于腸胃外注射的組合物可包含生理上可接受的無菌含水或無水溶液、分散液、懸浮液或乳液，和用于重新溶解成無菌的可注射溶液或分散液的無菌粉末。適宜的含水和非水載體、稀釋劑、溶劑或賦形劑包括水、乙醇、多元醇及其適宜的混合物。

用于局部給藥的本發(fā)明化合物的劑型包括軟膏劑、散劑、貼劑、噴射劑和吸入劑?；钚猿煞衷跓o菌條件下與生理上可接受的載體及任何防腐劑、緩沖劑，或必要時可能需要的推進劑一起混合。

本發(fā)明所述藥學上可接受的輔料，是指除活性成分以外包含在劑型中的物質。

本發(fā)明所述藥學上可接受的輔助性成分，它具有一定生理活性，但該成分的加入不會改變上述藥物組合物在疾病治療過程中的主導地位，而僅僅發(fā)揮輔助功效，這些輔助功效僅僅是對該成分已知活性的利用，是醫(yī)藥領域慣用的輔助治療方式。若將上述輔助性成分與本發(fā)明藥物組合物配合使用，仍然屬于本發(fā)明保護的范圍。

顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

以下通過實施例形式的具體實施方式，對本發(fā)明的上述內容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內容所實現(xiàn)的技術均屬于本發(fā)明的范圍。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1所得化合物Y的HR-ESI-MS譜。

圖2為本發(fā)明實施例1所得化合物Y的¹H NMR譜。

圖3為本發(fā)明實施例1所得化合物Y的¹³C NMR譜。

具體實施方式

本發(fā)明具體實施方式中使用的原料、設備均為已知產(chǎn)品，通過購買市售產(chǎn)品獲得。

實驗材料：

①試劑

柱層析硅膠，200～300目(試劑級)，購于青島海洋硅膠干燥劑廠；

薄層層析硅膠G、GF254和H(化學純)，購于青島海洋硅膠干燥劑廠；

MCI gel CHP 20P，75～150μm，為反相聚苯乙烯型樹脂，購于日本三菱化學公司；

Sephadex LH-20葡聚糖凝膠，購于瑞典Amersham公司；

GF254硅膠制備薄層，購于煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司；

95％乙醇(成都科龍化工試劑廠)；

甲醇(成都科龍化工試劑廠)；

二氯甲烷(成都科龍化工試劑廠)；

二甲基亞砜(成都科龍化工試劑廠)；

二甲基亞砜(色譜級)(Sigma公司)；

IMDM(Gibco公司生成)；

1640培養(yǎng)基、胎牛血清(Hyclone公司生產(chǎn))；

胰蛋白酶(Gibco公司)；

MTT(Amresco公司)；

所用其它試劑均為分析純。

②實驗儀器

Waters Synapt G₂HDMS高分辨飛行時間質譜(美國Waters)；

Bruker-AV-600核磁共振儀(瑞士Bruker)；

BP211D十萬分之一電子天平(瑞士Sartorius)；

R-210旋轉蒸發(fā)器(瑞士BUCHI)；

DZG-6050型真空干燥箱(上海森信)；

酶標儀(Thermo 3001，Thermo Fisher Scientific公司)；

電子天平(ESJ120-4型，沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司)；

超凈臺(MCV-B161F(T)，日本SANYO公司)；

顯微鏡(Primo Vert，AxioCam ERc 5s，ZEISS公司)；

CO₂培養(yǎng)箱(HH.CP-T，上海齊欣科學儀器有限公司)。

③細胞

肺癌細胞A549、人急性淋巴髓單核細胞白血病細胞MV4-11均來源于美國ATCC公司。

實施例1、本發(fā)明多聚聯(lián)芐化合物的提取以及結構鑒定

(1)藥材的提取：

干燥的白及藥材粗粉(3kg)，以95％乙醇回流提取3次(30L×3)，每次2h；

(2)成分的分離純化：

①、乙醇提取液(90L)經(jīng)減壓濃縮干燥得半固體流浸膏510g；

②、將半固體流浸膏(500g)用水(5L)分散，依次用乙酸乙酯(20L)、正丁醇(20L)萃取，合并乙酸乙酯部分，減壓回收溶劑，得乙酸乙酯浸膏160g；

③、采用硅膠柱色譜對乙酸乙酯浸膏(160g)進行分離，石油醚：丙酮進行梯度洗脫，洗脫液經(jīng)薄層色譜法檢測，得到石油醚：丙酮＝30:1時的洗脫液Fr.16；

梯度洗脫的條件如下：

④、Fr.16組分(18g)經(jīng)過MCI處理以10％-100％v/v的乙醇水進行梯度洗脫，并結合薄層色譜進行檢測，分別得到10個組分Fr.16-a～Fr.16-j；

梯度洗脫的條件如下：

⑤、Fr.16-j組分(3.0g)經(jīng)過凝膠LH-20色譜柱，以二氯甲烷-甲醇＝1:1為洗脫劑，進行洗脫，F(xiàn)r.16-j-1、Fr.16-j-2、Fr.16-j-3分別為洗脫0.8倍柱體積、2.2倍柱體積、3倍柱體積時依次收集的組分，其中Fr.16-j-2組分為聯(lián)芐化合物的集中部位；

⑥、Fr.16-j-2組分(1.8g)經(jīng)過硅膠柱色譜，分別以二氯甲烷-甲醇＝1：0、200：1、100：1、50：1進行洗脫，每個比例洗脫劑洗脫3個柱體積，減壓回收溶劑，收集100：1洗脫部位Fr.16-j-2c；

⑦、Fr.16-j-2c組分(390mg)以制備薄層色譜(展開劑為二氯甲烷-丙酮＝20:1，R_f＝0.60)進行分離，再將薄層板制備得到的樣品用反相高效液相色譜進行分離，以78％甲醇-水進行洗脫，以210nm波長進行檢測，收集28min洗脫得到的色譜峰，得到本發(fā)明化合物Y；

薄層色譜顯色時，噴以10％硫酸乙醇試液，于105℃下顯色3min多顯黃色、橘紅色至微紅色斑點，可以用于聯(lián)芐的追蹤檢測；

本發(fā)明化合物Y的分子式C₄₆H₄₆O₈，高分辨質譜數(shù)據(jù)：HR-ESI-MS m/z 725.3094[M-H]^-(C₄₆H₄₅O₈的計算值為725.3114)，不飽和度為24；

該化合物的核磁共振氫譜(¹H-NMR)和核磁共振碳譜(¹³C-NMR)由Bruker-AV-600核磁共振儀測定，具體數(shù)據(jù)見表1；

表1、本發(fā)明化合物Y的¹H NMR(600MHz)和¹³C NMR(150MHz)in CD₃COCD₃的數(shù)據(jù)

由上述波譜學數(shù)據(jù)，結合HSQC、COSY、HMBC二維核磁共振數(shù)據(jù)，確定本發(fā)明化合物Y為3,3′-雙(對羥基芐基)-4,6′-二甲氧基-2,2′-雙(3-甲氧基苯乙基)-(1,1′-聯(lián)苯)-6,4′-二醇，其結構如下：

實施例2、本發(fā)明多聚聯(lián)芐化合物的抗肺癌A549活性試驗

①細胞接種

用0.25％胰酶消化對數(shù)生長期的細胞。用含10％FBS的細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)配成單細胞懸液。采用細胞計數(shù)板計數(shù)，將狀態(tài)良好的A549腫瘤細胞接種于96孔板，使細胞密度為4×10³個/mL，每孔加入細胞懸液100μL，置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24h。

②藥物處理

每個樣品從10μg/mL開始，用培養(yǎng)基梯度稀釋樣品，2倍稀釋，設置5個藥物濃度，每個濃度做復孔測試。以濃度為10、5、2.5、1.25、0.625μg/mL每孔加藥100μL，每個濃度設3個復孔，重復3次。陰性對照組為含有適量DMSO的培養(yǎng)基溶液，空白對照組為不含細胞的培養(yǎng)基和溶媒。將96孔板放回培養(yǎng)箱，37℃作用72h。

③顯色及IC₅₀的計算

72h作用完畢后，避光條件下每孔加入MTT溶液(5g/L)20μL，繼續(xù)溫育培養(yǎng)4h后，棄掉上清液，每孔加入150μL DMSO，置于搖床上慢速振搖10min，使甲瓚充分溶解后，用酶標儀測量570nm波長處的OD值。

采用改良寇氏法IC₅₀＝log^-1[Xm-i(∑P-0.5)]進行計算，其中Xm：設計的最大濃度的對數(shù)值；i：各濃度倍比濃度的對數(shù)值；ΣP：各組生長抑制率之和；0.5：經(jīng)驗常數(shù)。通過重復三次試驗，計算得到3個IC₅₀值(保留兩位小數(shù))，求平均值，得到本發(fā)明實施例1所得化合物Y的IC₅₀值為0.9μM。

上述結果表明，本發(fā)明的多聚聯(lián)芐化合物，對肺癌細胞的增殖具有顯著的抑制活性，能夠用于治療和/或預防肺癌，具有良好的臨床應用前景。

實施例3、本發(fā)明多聚聯(lián)芐化合物的抗急性單白血病MV4-11活性試驗

①細胞接種

用0.25％胰酶消化對數(shù)生長期的細胞。用含10％FBS的細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)配成單細胞懸液。采用細胞計數(shù)板計數(shù)，將狀態(tài)良好的MV4-11細胞接種于96孔板，使細胞密度為2×10⁴個/mL，每孔加入細胞懸液100μL，置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24h。

②藥物處理

每個樣品從20μg/mL開始，用培養(yǎng)基梯度稀釋樣品，2倍稀釋，設置5個藥物濃度，每個濃度做復孔測試。以濃度為20、10、5、2.5、1.25μg/mL每孔加藥100μL，每個濃度設3個復孔，重復3次。陰性對照組為含有適量DMSO的培養(yǎng)基溶液，空白對照組為不含細胞的培養(yǎng)基和溶媒。將96孔板放回培養(yǎng)箱，37℃作用72h。

③顯色及IC₅₀的計算

72h作用完畢后，避光條件下每孔加入MTT溶液(5g/L)20μL，繼續(xù)溫育培養(yǎng)4h后，棄掉上清液，每孔加入150μL DMSO，置于搖床上慢速振搖10min，使甲瓚充分溶解后，用酶標儀測量570nm波長處的OD值。

采用改良寇氏法IC₅₀＝log^-1[Xm-i(∑P-0.5)]進行計算，其中Xm：設計的最大濃度的對數(shù)值；i：各濃度倍比濃度的對數(shù)值；ΣP：各組生長抑制率之和；0.5：經(jīng)驗常數(shù)。通過重復三次試驗，計算得到3個IC₅₀值(保留兩位小數(shù))，求平均值，得到本發(fā)明實施例1所得化合物Y的IC₅₀值為13.2μM。

上述結果表明，本發(fā)明的多聚聯(lián)芐化合物，同時還對急性單白血病細胞的增殖具有顯著的抑制活性，能夠用于治療和/或預防急性白血病，具有良好的臨床應用前景。

綜上所述，本發(fā)明的多聚聯(lián)芐化合物，與現(xiàn)有的聯(lián)芐類化合物相比，在結構上差異很大；并且，本發(fā)明多聚聯(lián)芐化合物具有新的藥效：對腫瘤細胞具有很好的抑制作用，特別是，對肺癌細胞具有很好的抑制作用，此外，本發(fā)明多聚聯(lián)芐化合物還對急性單白血病細胞的增殖具有顯著的抑制活性；同時，本發(fā)明多聚聯(lián)芐化合物的制備方法簡便，反應條件溫和，便于操作和控制，能耗小，產(chǎn)率高，成本低，非常適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。