本發(fā)明涉及疫苗，具體涉及一種腺病毒載體重組新型冠狀病毒sars-cov-2疫苗及其制備方法和應(yīng)用，更具體而言，涉及一種腺病毒載體重組新型冠狀病毒omicron變異株xbb.1.5亞型疫苗、制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、omicron(奧密克戎)針對(duì)原始毒株而言致病力減弱，而傳播能力更強(qiáng)，速度更快。這主要是因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)與原始毒株相比，刺突蛋白(spike,s)中含有多個(gè)突變位點(diǎn)，并且多個(gè)突變位點(diǎn)位于受體結(jié)合區(qū)。刺突蛋白中累積的大量突變使得該流行株一定程度上能夠逃逸新冠原型株疫苗激發(fā)的抗體，進(jìn)而引起新冠原型株疫苗失效或保護(hù)力降低。xbb是一種奧密克戎亞型變異毒株。

2、國際上來看，xbb是ba.2突變株bj.1(ba.2.10.1.1)和ba.2.75(ba.2.75.3.1.1.1)的重組毒株，而不是來自于單一突變。2022年8月中旬首次在印度發(fā)現(xiàn)；美國疾控中心(cdc)于2022年12月30更新的最新新冠毒株檢測數(shù)據(jù)，xbb.1.5突變株已經(jīng)占到美國新檢出毒株的40.5％，并且約是一周前的2倍、2周前的4倍。xbb可能會(huì)導(dǎo)致接種過疫苗或既往感染人群繼續(xù)感染。以疫苗接種獲得的抗體效力看，近期在全球范圍內(nèi)流行的bq.1.1.10、xbb等對(duì)于三針滅活疫苗(coronavac)接種者的血漿顯示出嚴(yán)重的逃逸能力；即使是接種三針疫苗后又感染ba.1、ba.2、ba.5乃至bf.7的康復(fù)者，其血漿對(duì)于最新的xbb等突變株的中和滴度也較弱。

3、進(jìn)化中，在ba.2的基礎(chǔ)上，xbb出現(xiàn)了s蛋白中的14個(gè)新突變，其中包括n端結(jié)構(gòu)域(ntd)中的5個(gè)位點(diǎn)，以及受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(rbd)中的9個(gè)突變，rbd結(jié)構(gòu)域的其中7個(gè)關(guān)鍵突變可能會(huì)導(dǎo)致xbb的傳播能力還要比bq.1.1更勝一籌。rbd上的大量突變使xbb亞型毒株獲得了更強(qiáng)的免疫逃逸能力。xbb.1.16、xbb.1.5、xbb.1均屬于xbb家族。其中xbb.1還另外具有g(shù)252v突變；xbb.1.5在除高度免疫逃逸能力外，xbb.1.5另一可能有助于傳播的“技能”在于——該毒株在486位點(diǎn)有一個(gè)關(guān)鍵突變，這使得它可以更緊密地與ace2結(jié)合。xbb.1.16在刺突蛋白中有一個(gè)額外突變，研究顯示xbb.1.16的傳播效率比xbb.1和xbb.1.5毒株高約1.17至1.27倍。

4、新冠病毒不斷發(fā)生變異；即使是前期接種過疫苗的也無法抵御新型變異病毒；同時(shí)在新型變異毒株的流行中，原始株以及前期變異株也存在感染風(fēng)險(xiǎn)，因此開發(fā)一種可以預(yù)防新型變異病毒，同時(shí)可以進(jìn)一步加強(qiáng)前期接種疫苗免疫能力的新型疫苗十分重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的一個(gè)方面，選擇編碼新型冠狀病毒omicron變異株xbb.1.5亞型s蛋白作為表達(dá)蛋白，以經(jīng)過優(yōu)化之后的核酸序列制備重組病毒載體疫苗，免疫后機(jī)體可產(chǎn)生針對(duì)xbb.1.5變異株病毒的結(jié)合抗體及中和抗體和細(xì)胞免疫反應(yīng)，具備良好免疫原性；同時(shí)還可產(chǎn)生針對(duì)原型株、ba.4/5、bf.7、xbb.1.16、ba.2.75變異株的中和抗體，具備更全面的保護(hù)性。

2、本發(fā)明提供了一種針對(duì)sars-2-cov型冠狀病毒刺突蛋白的優(yōu)化設(shè)計(jì)，該設(shè)計(jì)在刺突蛋白的氨基酸序列特定位點(diǎn)中引入至少一個(gè)突變，改變s蛋白構(gòu)象，提高其免疫產(chǎn)生中和抗體的水平。

3、另一個(gè)方面，本發(fā)明的腺病毒載體重組新型冠狀病毒疫苗使用不會(huì)影響到各抗原成分的免疫原性；腺病毒載體重組新冠病毒原始毒株抗原蛋白和xbb.1.5變異株抗原蛋白之間化學(xué)相容性良好。之間不會(huì)產(chǎn)生免疫反應(yīng)的相互干擾，可以制備為注射或吸入疫苗。疫苗原始毒株抗原蛋白和xbb.1.5變異株抗原蛋白不會(huì)發(fā)生抗原競爭。輔料與抗原間的種類及比例合適?？梢杂行ПＷo(hù)機(jī)體免受xbb.1.5變異株和原始毒株的感染。

4、另一個(gè)方面，本發(fā)明的腺病毒載體重組新型冠狀病毒疫苗還可同時(shí)有效保護(hù)機(jī)體免受覆蓋ba.4/5、bf.7、xbb.1.16、ba.2.75變異株的感染。

5、另一個(gè)方面，本發(fā)明的腺病毒載體重組新型冠狀病毒疫苗還可同時(shí)有效保護(hù)機(jī)體免受覆蓋ba.4/5、bf.7、xbb.1.16、ba.2.75變異株的感染。

6、另一個(gè)方面，本發(fā)明的腺病毒載體重組新型冠狀病毒疫苗，可引發(fā)機(jī)體的再次免疫反應(yīng)，有效保護(hù)機(jī)體免受覆蓋xbb.1.5、ba.4/5、bf.7、xbb.1.16、ba.2.75變異株的感染。

7、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種含多核苷酸的重組腺病毒載體，所述重組腺病毒表達(dá)多核苷酸分子編碼的新型冠狀病毒xbb.1.5變異株刺突蛋白。

8、優(yōu)選地，所述腺病毒為人腺病毒或黑猩猩腺病毒；優(yōu)選地，所述人腺病毒選自：adhu2、adhu4、adhu5、adhu7、adhu11、adhu26、adhu35、adhu55；更優(yōu)選為adhu5型。

9、優(yōu)選地，所述編碼序列為新型冠狀病毒omicron變異株xbb.1.5亞型刺突蛋白的序列的s1/s2兩個(gè)亞基之間的furin裂解位點(diǎn)666rrar669位突變，優(yōu)選的，包含666rrar669突變?yōu)間sag。

10、同時(shí)，為提升抗原蛋白在人體內(nèi)的表達(dá)水平，優(yōu)選地，所述編碼序列為新型冠狀病毒omicron變異株xbb.1.5亞型s蛋白的序列1-12位氨基酸信號(hào)肽序列替換為信號(hào)肽為tpa。

11、優(yōu)選地，信號(hào)肽tpa序列為mdamkrglccvlllcgavfvsns。

12、具體地，編碼新型冠狀病毒omicron變異株xbb.1.5亞型s蛋白的氨基酸的序列如seq?id?no:2所示具有至少75％的同源性，優(yōu)選地，具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％的同源性。

13、本發(fā)明提供一種重組腺病毒載體疫苗，具體地，所述重組腺病毒載體及藥學(xué)上可接受的輔料。優(yōu)選地，所述疫苗為注射劑，優(yōu)選的，更優(yōu)選地，為肌肉注射劑。

14、具體地，所述疫苗還包含藥學(xué)上可接受的輔料；優(yōu)選地，所述藥學(xué)上可接受的輔料可選自：緩沖劑、保護(hù)劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑等中的一種或多種；更優(yōu)選地，所述藥學(xué)上可接受的輔料包括蔗糖、甘露醇、氯化鈉、甘油、hepes、氯化鎂、吐溫80、人血白蛋白和明膠；更優(yōu)選地，各組分的含量為：甘露醇1-100mg/ml、氯化鈉1-50mg/ml、hepes0.1-5mg/ml、聚山梨酯80?0.05-5mg/ml、甘油0.5-10mg/ml、氯化鎂0.1-10mg/ml、蔗糖5-50mg/ml。

15、本發(fā)明一種重組腺病毒載體疫苗，包含所述重組腺病毒載體及藥學(xué)上可接受的輔料；優(yōu)選地，疫苗為黏膜給藥制劑，更優(yōu)選地，所述黏膜給藥制劑為吸入給藥制劑，更優(yōu)選地，為鼻吸入或經(jīng)口吸入；更優(yōu)選地，所述吸入給藥制劑為液體吸入制劑或干粉吸入制劑。優(yōu)選地，所述黏膜包括鼻黏膜、口腔黏膜或肺粘膜。

16、優(yōu)選地，所述藥學(xué)上可接受的輔料包括不限于：緩沖劑、保護(hù)劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑中的一種或多種。

17、優(yōu)選地，所述黏膜給藥制劑選自：液體劑型、固體劑型、半固體劑型；優(yōu)選地為氣霧劑、噴霧劑、滴鼻劑、粉霧劑、粉末劑、凝膠劑、微球劑、脂質(zhì)體、膜劑、混懸劑；更優(yōu)選地，所述黏膜給藥制劑為噴霧劑或霧化給藥制劑。

18、本發(fā)明提供一種疫苗制備方法，包括制備新型冠狀病毒omicron變異株xbb.1.5亞型抗原蛋白的重組腺病毒載體，任選的，加入藥學(xué)上可接受的輔料。

19、具體的，重組腺病毒載體的制備包括以下步驟：

20、(1)構(gòu)建穿梭質(zhì)粒；

21、(2)將步驟(1)所得重組腺病毒穿梭質(zhì)粒與攜帶腺病毒大部分基因組的骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入包裝細(xì)胞，重組包裝復(fù)制缺陷型腺病毒；

22、本發(fā)明提供一種疫苗試劑盒，包括，分開包裝的：第一免疫原性組合物和第二種免疫原性組合物；優(yōu)選地，所述第一免疫原性組合物為含有前述的腺病毒載體；所述第二免疫原性組合物包含編碼新型冠狀病毒原型株s蛋白的基因序列的重組腺病毒載體。更優(yōu)選地，所述免疫原性組合物還包含藥學(xué)上可接受的輔料。

23、具體地，編碼新型冠狀病毒原型株s蛋白的氨基酸序列如seq?id?no:5所示具有至少75％的同源性，優(yōu)選地，具有至少85％、90％、95％、97％、98％、99％的同源性。

24、具體地，所述第二免疫原性組合物可以為液體劑型、固體劑型、半固體劑型；優(yōu)選地，為口服制劑、肌肉注射制劑、靜脈注射制劑或吸入制劑。

25、具體地，所述重組腺病毒載體疫苗或免疫原性組合物中重組病毒載體的含量為1×108～1×1012vp/ml，優(yōu)選地為5×1010vp/ml。

26、本發(fā)明提供一種疫苗試劑盒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

27、s1：制備編碼新型冠狀病毒原型株抗原蛋白的重組腺病毒載體，任選的，加入藥學(xué)上可接受的輔料；

28、s2：制備新型冠狀病毒omicron變異株xbb.1.5亞型抗原蛋白的重組腺病毒載體，任選的，加入藥學(xué)上可接受的輔料。

29、具體地，重組腺病毒載體的制備包括以下步驟：

30、(1)構(gòu)建質(zhì)粒；

31、(2)將步驟(1)所得重組腺病毒穿梭質(zhì)粒與攜帶腺病毒大部分基因組的骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝；

32、優(yōu)選地，(1)分別構(gòu)建原始毒株質(zhì)粒和其他新型冠狀病毒變異毒株質(zhì)粒；

33、(2)將步驟(1)所得重組腺病毒穿梭質(zhì)粒與攜帶腺病毒大部分基因組的骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝；

34、更優(yōu)選地，所述其他新型冠狀病毒變異毒株為編碼新型冠狀病毒omicron變異株xbb.1.5亞型變異株。

35、優(yōu)選地，所述包裝細(xì)胞為hek293細(xì)胞或者其衍生細(xì)胞系。

36、本發(fā)明提供根一種重組腺病毒載體疫苗或疫苗試劑盒在制備預(yù)防和/或治療疾病的藥物中的應(yīng)用；優(yōu)選地，所述疾病為新型冠狀病毒感染(covid-19)。

37、本發(fā)明提供一種所述的重組腺病毒載體疫苗或疫苗試劑盒在制備預(yù)防和/或治療疾病的藥物中的應(yīng)用；所述疾病為新型冠狀病毒原型株、xbb.1.5、ba.4/5、bf.7、xbb.1.16、ba.2.75變異株引發(fā)的感染。

38、本發(fā)明提供一種所述的重組腺病毒載體疫苗或疫苗試劑盒在制備預(yù)防和/或治療疾病的藥物中的應(yīng)用；所述疾病為新型冠狀病毒原型株、xbb.1.5、ba.4/5、bf.7、xbb.1.16、ba.2.75變異株引發(fā)的感染。優(yōu)選地，所述重組腺病毒載體疫苗或疫苗試劑盒用于引發(fā)機(jī)體再次免疫。

39、本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)的有益效果為：

40、選擇編碼新型冠狀病毒omicron變異株xbb.1.5亞型s蛋白作為表達(dá)蛋白，以經(jīng)過優(yōu)化之后的核酸序列制備重組病毒載體疫苗，免疫后機(jī)體可產(chǎn)生針對(duì)xbb.1.5變異株病毒的結(jié)合抗體及中和抗體和細(xì)胞免疫反應(yīng)，具備良好免疫原性。

41、本發(fā)明的多價(jià)腺病毒載體重組新型冠狀病毒疫苗通過分別制備編碼新性冠狀病毒原型株抗原蛋白的重組腺病毒載體疫苗和編碼新型冠狀病毒omicron變異株xbb.1.5亞型抗原蛋白的重組腺病毒載體疫苗，再組合成多劑試劑盒。解決了將奧密克戎(omicron,xbb.1.5)變異株的s基因和原型株rbd基因的質(zhì)粒共表達(dá)制備腺病毒載體疫苗免疫抑制的問題。使用本發(fā)明多價(jià)疫苗不會(huì)影響到各抗原成分的免疫原性；同時(shí)施用時(shí)，腺病毒載體重組新冠病毒原始毒株抗原蛋白和xbb.1.5變異株抗原蛋白之間化學(xué)相容性良好。之間不會(huì)產(chǎn)生免疫反應(yīng)的相互干擾；原始毒株抗原蛋白和xbb.1.5變異株抗原蛋白不會(huì)發(fā)生抗原競爭；可以有效保護(hù)機(jī)體免受xbb.1.5變異株和原始毒株的感染。

42、本發(fā)明的多價(jià)腺病毒載體重組新型冠狀病毒疫苗可以有效保護(hù)機(jī)體免受原型株、ba.4/5、bf.7、xbb.1.16、ba.2.75變異株的感染。

43、本發(fā)明疫苗制劑所用輔料不會(huì)對(duì)原始毒株疫苗原液和xbb.1.5變異株疫苗原液以及其他變異株產(chǎn)生免疫抑制，相容性良好。

44、本發(fā)明的新型冠狀病毒疫苗多劑試劑盒在對(duì)機(jī)體進(jìn)行免疫后，針對(duì)原始毒株及變異株xbb.1.5均能產(chǎn)生中和抗體。不僅可以預(yù)防新型冠狀病毒的原始毒株，還可以有效的預(yù)防xbb.1.5變異株，此外還可以產(chǎn)生針對(duì)原型株、ba.4/5、bf.7、xbb.1.16、ba.2.75變異株的中和抗體，本發(fā)明提供的腺病毒載體重組新型冠狀病毒疫苗具有良好的穩(wěn)定性、安全高效，可以有效對(duì)抗新型冠狀病毒不同的分化毒株。