本公開內(nèi)容涉及用于減少測序文庫中的接頭-二聚體的方法、組合物和試劑盒。

背景技術(shù)：

1、遺傳分析已變得越來越普遍，且其可用于多種分子生物學(xué)應(yīng)用中。例如，個體的基因檢測對于遺傳疾病的早期檢測特別有用，并且可以在特定疾病或病癥的治療選擇中發(fā)揮作用。

2、大規(guī)模平行核酸測序技術(shù)在靶核酸的遺傳分析中起關(guān)鍵作用，但當(dāng)非靶核酸與靶核酸一起測序時會產(chǎn)生不理想的結(jié)果。

3、在大規(guī)模平行核酸測序技術(shù)中，靶向富集方法通常用于減少非靶序列對測序結(jié)果的污染。一種這樣的富集方法依賴于靶核酸測序文庫分子的雜交捕獲。

4、然而，用于大規(guī)模平行核酸測序的測序文庫包括連接至核酸測序文庫分子中的插入序列的接頭序列。接頭包括具有多種功能特性的核酸序列，例如延伸引物結(jié)合位點(diǎn)、用于樣品鑒定的一個或多個索引序列、測序引物結(jié)合位點(diǎn)和擴(kuò)增引物結(jié)合位點(diǎn)。在測序文庫產(chǎn)生的方法的過程中，接頭被連接至目的插入序列。接頭連接至插入序列的不合需要的副產(chǎn)物是接頭可以彼此連接，產(chǎn)生接頭-二聚體。即使少量的接頭-二聚體也會對測序質(zhì)量產(chǎn)生不利影響，因?yàn)榻宇^-二聚體可以通過旨在富集目的插入序列的擴(kuò)增反應(yīng)而有效地擴(kuò)增。

5、進(jìn)一步地，接頭-二聚體可以在富集步驟期間被雜交捕獲保留，從而捕獲接頭-二聚體并浪費(fèi)試劑和時間來測序接頭-二聚體。

6、大規(guī)模平行測序技術(shù)的日益擴(kuò)大的應(yīng)用和日益增長的在單次運(yùn)行中多重處理(multiplex)大量單個文庫的需求導(dǎo)致需要有效抑制接頭-二聚體的形成，并去除那些已經(jīng)形成的接頭-二聚體。

7、持續(xù)需要用于在用于大規(guī)模平行測序的測序文庫中減少接頭-二聚體的組合物和方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、根據(jù)本公開內(nèi)容的方面，提供了在測序文庫中減少接頭-二聚體的方法，其包括：在連接反應(yīng)條件下的混合物中，將各自具有5’末端和3’末端的樣品核酸與3’接頭和連接酶組合，所述3’接頭各自具有長度為至少8個核苷酸的5’末端部分和一個為腺苷酸化核苷酸的5’端，產(chǎn)生1)第一連接產(chǎn)物，其各自包括連接至3’接頭的5’端的樣品核酸的3’末端，和2)混合物中過量的未連接的3’接頭；向所述混合物中加入阻斷劑寡核苷酸(blockeroligonucleotide)，所述阻斷劑寡核苷酸包括：a)第一阻斷劑寡核苷酸，其包括：i)第一阻斷劑寡核苷酸5’部分，其長度為至少8個核苷酸，和ii)第一阻斷劑寡核苷酸3’部分，其長度為至少1至20個核苷酸，并包括第一寡核苷酸3’端，其中所述1至20個核苷酸中的至少1個為非天然存在的核苷酸；和b)第二阻斷劑寡核苷酸，其包括：iii)第二寡核苷酸5’部分，其長度為至少8個核苷酸，和iv)第二阻斷劑寡核苷酸3’部分，其長度為至少1至20個核苷酸，并包括第二阻斷劑寡核苷酸3’端，其中所述1至20個核苷酸中的至少1個是非天然存在的核苷酸；其中所述第一阻斷劑寡核苷酸3'部分和所述第二阻斷劑寡核苷酸3'部分長度相等且彼此互補(bǔ)；并且其中所述第一阻斷劑寡核苷酸5'部分和所述第二阻斷劑寡核苷酸5'部分均與所述3'接頭的5'末端部分互補(bǔ)；并且在雜交條件下孵育混合物，從而使第一阻斷劑寡核苷酸3’部分與第二阻斷劑寡核苷酸3’部分雜交，使第一阻斷劑寡核苷酸5’部分與過量的未連接的3’接頭雜交，并從而使第二阻斷劑寡核苷酸5’部分與過量的未連接的3’接頭雜交，產(chǎn)生雜交復(fù)合體，其中第一阻斷劑寡核苷酸3’端與第一未連接的3’接頭的腺苷酸化5’末端核苷酸相鄰，且第二阻斷劑寡核苷酸3’端與第二未連接的3’接頭的腺苷酸化5’末端核苷酸相鄰，從而減少混合物中過量的未連接的3’接頭，產(chǎn)生純化的混合物。

2、根據(jù)本公開內(nèi)容的方面，第一阻斷劑寡核苷酸3'端和第二阻斷劑寡核苷酸3'端均能夠連接至過量的未連接的3’接頭的5'端處的腺苷酸化核苷酸；且在本公開內(nèi)容的方法中進(jìn)一步包括將雜交復(fù)合體的第一阻斷劑寡核苷酸3’端連接至第一未連接的3’接頭的5’端處的相鄰的腺苷酸化核苷酸，并且將雜交復(fù)合體的第二阻斷劑寡核苷酸3’端連接到第二未連接的3’接頭的5’端處的相鄰的腺苷酸化核苷酸，產(chǎn)生連接復(fù)合體，從而減少混合物中過量的未連接的3’接頭，產(chǎn)生純化的混合物。

3、根據(jù)本公開內(nèi)容的方面，第一阻斷劑寡核苷酸3'部分的至少1至20個核苷酸中的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個是非天然存在的核苷酸，且第二阻斷劑寡核苷酸3'部分的至少1至20個核苷酸中的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個是非天然存在的核苷酸。

4、根據(jù)本公開內(nèi)容的方面，第一阻斷劑寡核苷酸3'部分和第二阻斷劑寡核苷酸3'部分的長度各自為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個核苷酸，且第一阻斷劑寡核苷酸3'部分和第二阻斷劑寡核苷酸3'部分各自包括回文核苷酸序列，其中第一阻斷劑寡核苷酸3'部分的回文核苷酸序列與第二阻斷劑寡核苷酸3'部分的回文核苷酸序列相同。

5、根據(jù)本公開內(nèi)容的方面，第一阻斷劑寡核苷酸和第二阻斷劑寡核苷酸各自具有11至50個核苷酸范圍內(nèi)的長度。

6、根據(jù)本公開內(nèi)容的方面，第一阻斷劑寡核苷酸和第二阻斷劑寡核苷酸具有相同的核苷酸序列。

7、根據(jù)本公開內(nèi)容的方面，減少測序文庫中的接頭-二聚體的方法進(jìn)一步包括向混合物中加入5'接頭，所述5'接頭具有3'端，其中所述第一連接產(chǎn)物各自包括與3'接頭的5'端連接的樣品核酸的3'末端，和與5'接頭的3'端連接的樣品核酸的5'末端，從而產(chǎn)生測序文庫分子，所述測序文庫分子包括位于5'接頭和3'接頭之間并與其結(jié)合的樣品核酸插入片段(insert)。

8、根據(jù)本公開內(nèi)容的方面，減少測序文庫中的接頭-二聚體的方法還包括向純化的混合物中加入5'接頭；和在連接反應(yīng)條件下孵育純化的混合物，從而1)將5'接頭與第一連接產(chǎn)物連接，產(chǎn)生測序文庫分子，所述測序文庫分子包括位于5'接頭和3'接頭之間并與其結(jié)合的樣品核酸插入片段。

9、根據(jù)本公開內(nèi)容的方面，提供了減少測序文庫中的接頭-二聚體的方法，其中減少但不清除過量的未連接的3'接頭，使得所述連接包括將5'接頭與過量的未連接的3'接頭的至少一部分連接，產(chǎn)生接頭-二聚體，其包括在5'接頭-3'接頭界面處(interface)與3'接頭結(jié)合的5'接頭。因此，根據(jù)本公開內(nèi)容的方面，提供了減少測序文庫中的接頭-二聚體的方法，其進(jìn)一步包括抑制擴(kuò)增反應(yīng)中接頭-二聚體的擴(kuò)增，使得與接頭-二聚體相比，通過擴(kuò)增反應(yīng)選擇性富集測序文庫分子。抑制接頭-二聚體的擴(kuò)增可包括以下中的一種或多種：在擴(kuò)增之前去除至少一些接頭-二聚體；接頭-二聚體的特異性酶促切割；基于crispr/cas9的接頭-二聚體的切割；凝膠純化以去除接頭-二聚體；基于spri小珠的尺寸選擇以去除接頭-二聚體；以及向混合物中加入接頭-二聚體阻斷劑寡核苷酸，所述接頭-二聚體阻斷劑寡核苷酸有效抑制接頭-二聚體的擴(kuò)增。

10、根據(jù)本公開內(nèi)容的方面，提供了減少測序文庫中接頭-二聚體的方法，其包括向混合物中加入接頭-二聚體阻斷劑寡核苷酸，所述接頭-二聚體阻斷劑寡核苷酸有效抑制接頭-二聚體的擴(kuò)增，其中所述接頭-二聚體阻斷劑寡核苷酸與接頭-二聚體的一個或多個相鄰部分互補(bǔ)，所述一個或多個相鄰部分包括在5'接頭-3'接頭界面處的5'接頭的至少一個核苷酸，和包括擴(kuò)增引物結(jié)合位點(diǎn)的3'接頭的相鄰部分。

11、根據(jù)本公開內(nèi)容的方面，提供了在測序文庫中減少接頭-二聚體的方法，其中樣品核酸為rna或包括rna。

12、根據(jù)本公開內(nèi)容的方面，提供了減少測序文庫中的接頭-二聚體的方法，其中樣品核酸為rna或包括rna，且所述方法包括逆轉(zhuǎn)錄rna，產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄的測序文庫分子。

13、根據(jù)本公開內(nèi)容的方面，提供了減少測序文庫中的接頭-二聚體的方法，其進(jìn)一步包括擴(kuò)增測序文庫分子或逆轉(zhuǎn)錄的測序文庫分子。

14、根據(jù)本公開內(nèi)容的方面，提供了一種用于減少測序文庫中的接頭-二聚體的寡核苷酸對，其包括a)第一阻斷劑寡核苷酸，其包括：i)長度為至少8個核苷酸的第一阻斷劑寡核苷酸5’部分和ii)長度為至少1至20個核苷酸且包括第一寡核苷酸3’端的第一阻斷劑寡核苷酸3’部分，其中所述1至20個核苷酸中的至少1個是非天然存在的核苷酸；和b)第二阻斷劑寡核苷酸，其包括：iii)長度為至少8個核苷酸的第二寡核苷酸5’部分和iv)第二阻斷劑寡核苷酸3’部分，其長度為至少1至20個核苷酸，并包括第二阻斷劑寡核苷酸3’端，其中所述1至20個核苷酸中的至少1個是非天然存在的核苷酸；其中第一阻斷劑寡核苷酸3'部分和第二阻斷劑寡核苷酸3'部分長度相等且彼此互補(bǔ)；其中第一阻斷劑寡核苷酸5'部分和第二阻斷劑寡核苷酸5'部分均與3'接頭的5'末端部分互補(bǔ)。

15、根據(jù)本公開內(nèi)容的方面，第一阻斷劑寡核苷酸3'端和第二阻斷劑寡核苷酸3'端均能夠連接至過量的未連接的3'接頭的5'端處的腺苷酸化核苷酸。

16、根據(jù)本公開內(nèi)容的方面，提供了用于減少測序文庫中的接頭-二聚體的阻斷劑寡核苷酸對，其中第一阻斷劑寡核苷酸3'部分的至少1至20個核苷酸中的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個是非天然存在的核苷酸，且第二阻斷劑寡核苷酸3'部分的至少1至20個核苷酸中的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個是非天然存在的核苷酸。

17、根據(jù)本公開內(nèi)容的方面，提供了用于減少測序文庫中的接頭-二聚體的阻斷劑寡核苷酸對，其中當(dāng)?shù)谝蛔钄鄤┕押塑账?'部分和第二阻斷劑寡核苷酸3'部分的長度各自為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個核苷酸時，第一阻斷劑寡核苷酸3'部分和第二阻斷劑寡核苷酸3'部分各自包括回文核苷酸序列，其中第一阻斷劑寡核苷酸3'部分的回文核苷酸序列與第二阻斷劑寡核苷酸3'部分的回文核苷酸序列相同。

18、根據(jù)本公開內(nèi)容的方面，提供了用于減少測序文庫中接頭-二聚體的阻斷劑寡核苷酸對，其中第一阻斷劑寡核苷酸和第二阻斷劑寡核苷酸各自具有約11至約50個核苷酸范圍內(nèi)的長度。

19、根據(jù)本公開內(nèi)容的方面，提供了用于減少測序文庫中的接頭-二聚體的阻斷劑寡核苷酸對，其中第一阻斷劑寡核苷酸和第二阻斷劑寡核苷酸具有相同的核苷酸序列。

20、根據(jù)本公開內(nèi)容的方面，提供了用于減少測序文庫中的接頭-二聚體的試劑盒，其包括一個或多個用于用于減少測序文庫中的接頭-二聚體的阻斷劑寡核苷酸對。

21、根據(jù)本公開內(nèi)容的方面，用于減少測序文庫中的接頭-二聚體的試劑盒進(jìn)一步包括有效阻斷接頭-二聚體擴(kuò)增的接頭-二聚體阻斷劑寡核苷酸。

22、根據(jù)本公開內(nèi)容的方面，提供了用于減少測序文庫中的接頭-二聚體的試劑盒，其中接頭-二聚體阻斷劑寡核苷酸與接頭-二聚體的一個或多個相鄰部分互補(bǔ)，所述一個或多個相鄰部分包括在5'接頭-3'接頭界面處的5'接頭的至少一個核苷酸，和包括擴(kuò)增引物結(jié)合位點(diǎn)的3'接頭的相鄰部分。