本發(fā)明涉及一組具有抗豬藍(lán)耳病病毒活性的多肽，還涉及所述的多肽在抗豬藍(lán)耳病病毒感染中的應(yīng)用，本發(fā)明屬于醫(yī)藥。

背景技術(shù)：

1、豬的病毒感染是全球養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的難題之一。廣泛傳播的豬病原病毒主要有偽狂犬病病毒(pseudorabies?virus,prv)、豬流行性腹瀉病毒(porcine?epidemic?diarrheavirus,pedv)和豬藍(lán)耳病病毒(porcine?reproductive?and?respiratory?syndromevirus,prrsv)等，在養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。自1987年在美國首次發(fā)現(xiàn)以來，prrsv已于全球范圍內(nèi)廣泛存在，常引起母豬發(fā)熱、厭食和繁殖障礙以及仔豬呼吸道疾病，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。中國于20世紀(jì)90年代中期發(fā)現(xiàn)該病并將其列為二類動物疫病，該病可在豬群中持續(xù)存在，單一感染或與其他病原體混合感染豬群，尤其是感染后產(chǎn)生的并發(fā)和繼發(fā)感染使感染豬群的臨床癥狀加重，死亡率增加，因此豬繁殖與呼吸障礙綜合癥是目前制約我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展最為重要的病毒性傳染病之一。

2、面對prrsv給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來的巨大威脅，疫苗接種成為動物疾病防控的主要手段，許多傳統(tǒng)的藍(lán)耳病疫苗已經(jīng)獲批生產(chǎn)許可，在臨床上廣泛應(yīng)用，但新型疫苗多處于研發(fā)階段，暫時未能獲批生產(chǎn)許可。針對藍(lán)耳病的防控，各種疫苗都面臨著許多挑戰(zhàn)，滅活疫苗雖然沒有生物安全風(fēng)險，但是其中和抗體水平低，不能產(chǎn)生細(xì)胞免疫，需要多次注射使用；活疫苗存在對異源毒株的保護(hù)不足、潛在毒力返強、疫苗毒株和野毒株之間的重組以及缺乏標(biāo)記等缺點；亞單位疫苗和病毒樣顆粒疫苗雖無致病性，但對易感動物只有部分保護(hù)。核酸疫苗雖然生產(chǎn)工藝簡單，但是有潛在生物安全風(fēng)險，如外源dna整合宿主基因組。prrsv主要感染豬肺泡巨噬細(xì)胞(pams)，具有高突變率和高重組率的特點，隨著病毒抗原的變異，現(xiàn)有疫苗很容易失效。

3、由于prrsv在全球范圍內(nèi)帶來的巨大經(jīng)濟(jì)損失，越來越多具有抗prrsv活性的抗菌肽被發(fā)現(xiàn)和設(shè)計出來?？咕氖且环N小分子蛋白質(zhì)，具有潛在的抗細(xì)菌、病毒、真菌、腫瘤和寄生蟲活性，廣泛存在于動物、植物和微生物中[wang?j,song?j,yang?z,etal.correction?to?antimicrobial?peptides?with?high?proteolytic?resistance?forcombating?gram-negative?bacteria[j].j?med?chem,2019,62(12):5921.]。抗菌肽能夠通過干擾病毒生命周期的多個階段來抑制病毒的復(fù)制，作用機(jī)制多樣主要包括破壞病毒囊膜、阻止病毒與宿主細(xì)胞結(jié)合、與宿主細(xì)胞的特定受體相互作用等[pen?g,yang?n,teng?d,et?al.a?review?on?the?use?of?antimicrobial?peptides?to?combat?porcine?viruses[j].antibiotics(basel),2020,9(11):]。體外實驗中發(fā)現(xiàn)小分子肽cecropin?d(cd)可以減弱prrsv感染后期誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，抑制病毒顆粒的釋放[liu?x,guo?c,huangy,etal.inhibition?of?porcine?reproductive?and?respiratory?syndrome?virus?bycecropin?d?in?vitro[j].infect?genet?evol,2015,34(7-16.]，以及humancathelicidin?ll37可以在體外通過減少病毒復(fù)制表現(xiàn)出抗prrsv活性[levast?b,hogand,van?kessel?j,et?al.synthetic?cationic?peptide?idr-1002and?humancathelicidin?ll37?modulate?the?cell?innate?response?but?differentially?impactprrsv?replication?in?vitro[j].front?vet?sci,2019,6(233.]，這些多肽的研究結(jié)果均展示了抗菌肽在抗病毒藥物開發(fā)中具有巨大潛力。

4、面對prrsv具有高突變率和高重組率的特點，以及現(xiàn)有疫苗容易失效這一巨大挑戰(zhàn)，本發(fā)明針對prrsv設(shè)計多肽并對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，以提高其抗病毒活性，進(jìn)而殺滅prrsv并防止其對豬造成感染。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一組具有抗豬藍(lán)耳病病毒活性的多肽及其應(yīng)用。

2、為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段：

3、本發(fā)明設(shè)計合成了多肽protegrin-4(p-1)，其氨基酸序列如seq?id?no.1所示，并進(jìn)行結(jié)構(gòu)進(jìn)行了優(yōu)化，我們保留了p-1中的芳香族氨基酸，在p-2(seq?id?no.2所示)中引入了具有正電荷的賴氨酸，增加了肽鏈的陽離子性質(zhì)，有助于與帶負(fù)電的病毒囊膜或細(xì)胞膜相互作用，賴氨酸也是親水氨基酸，可以增強多肽與細(xì)胞膜表面的相互作用，p-3(seq?idno.3所示)和p-4(seq?id?no.4所示)中引入了連續(xù)的具有正電荷的精氨酸，具有較強的細(xì)胞穿透力，有助于增強多肽的穿膜能力。hplc和cd光譜結(jié)果表明，多肽的純度較高以及具有良好的二級結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞膜環(huán)境中，可以誘導(dǎo)多肽結(jié)構(gòu)顯著變化，主要是形成α螺旋和β折疊。接著，我們通過多種實驗方法對其抗病毒活性進(jìn)行檢測。通過rt-qpcr和western?blot分析，我們觀察到本發(fā)明的多肽對病毒rna和蛋白質(zhì)表達(dá)有顯著抑制作用，尤其經(jīng)過結(jié)構(gòu)優(yōu)化后在低劑量條件下也可發(fā)揮同樣的效果。通過間接免疫熒光實驗進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示本發(fā)明的多肽對prrsv具有明顯的直接滅活作用。

4、因此，在上述研究的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提出了一組具有抗豬藍(lán)耳病病毒活性的多肽，所述的多肽的氨基酸序列如seq?id?no.1、seq?id?no.2、seq?id?no.3或seq?id?no.4所示。

5、進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了所述的多肽在制備抗豬藍(lán)耳病病毒的藥物中的應(yīng)用。

6、其中，優(yōu)選的，所述的豬藍(lán)耳病病毒為高致病性豬藍(lán)耳病病毒。

7、其中，優(yōu)選的，所述的多肽通過直接接觸prrsv，達(dá)到對prrsv的滅活作用。

8、相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果是：

9、本發(fā)明設(shè)計合成了一組具有抗豬藍(lán)耳病病毒活性的多肽，與其他已知抗病毒多肽相比，如cecropin?d在體外300μg/ml濃度條件下對prrsv的感染和復(fù)制表現(xiàn)出有效的抗病毒活性，而本發(fā)明的多肽顯示相對較低的細(xì)胞毒性以及在25μg/ml濃度條件下也可發(fā)揮同樣的抗病毒效果，表明本發(fā)明設(shè)計的多肽在藥物開發(fā)中具有較高的安全性和有效性。因此，本發(fā)明的提出為抗prrsv提供了新的技術(shù)手段。

技術(shù)特征：

1.一組具有抗豬藍(lán)耳病病毒(porcine?reproductive?andrespiratory?syndromevirus,prrsv)活性的多肽，其特征在于，所述的多肽的氨基酸序列如seq?id?no.1、seq?idno.2、seq?id?no.3或seq?id?no.4所示。

2.權(quán)利要求1所述的多肽在制備抗豬藍(lán)耳病病毒(porcine?reproductive?andrespiratory?syndrome?virus,prrsv)的藥物中的應(yīng)用。

3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的豬藍(lán)耳病病毒為高致病性豬藍(lán)耳病病毒(high?pathogenicity?porcine?reproductive?and?respiratory?syndrome?virus,hp-prrsv)。

4.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的多肽通過直接接觸prrsv，達(dá)到對prrsv的滅活作用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一組具有抗豬藍(lán)耳病病毒(Porcine?Reproductive?and?Respiratory?Syndrome?virus,PRRSV)活性的多肽及其應(yīng)用。所述的多肽的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.2、SEQ?ID?NO.3或SEQ?ID?NO.4所示。此外，本發(fā)明還提出了所述的多肽在制備抗豬藍(lán)耳病病毒的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明針對PRRSV設(shè)計多肽并對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，與其他已知抗病毒多肽相比，本發(fā)明的多肽顯示相對較低的細(xì)胞毒性以及在25μg/mL濃度條件下也可發(fā)揮同樣的抗病毒效果，表明本發(fā)明設(shè)計的多肽在藥物開發(fā)中具有較高的安全性和有效性。本發(fā)明的提出為抗PRRSV提供了新的技術(shù)手段。

技術(shù)研發(fā)人員：郭慧琛,周靜靜,孫世琪,臧浩月,張韻,滕志東,白滿元,董虎,吳金恩,尹雙輝,穆素雨,丁耀忠
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所（中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心蘭州分中心）
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/5/8