本發(fā)明屬于生物，涉及一種對(duì)香豆酸或?qū)ο愣顾嵫苌锷a(chǎn)水平提高的微生物及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、對(duì)香豆酸（ p-coumaric?acid， p-ca）是具有抗菌、抗炎、抗氧化等等多種藥理作用的化合物，也是包括酚酸類（代表物質(zhì)有咖啡酸、阿魏酸等）、黃酮類（代表物質(zhì)有柚皮素、兒茶素等）、芪類（代表物質(zhì)有白藜蘆醇、銀松素等）香豆素類（代表物質(zhì)有傘形酮、東莨菪素等）等多種化合物的重要前體代謝物。目前對(duì)香豆酸及對(duì)香豆酸衍生物的生產(chǎn)主要依賴植物提取，而作為提取原料的經(jīng)濟(jì)作物的種植面積有限、培養(yǎng)周期較長(zhǎng)且易受到氣候和季節(jié)變化影響，不能保證對(duì)香豆酸及其衍生物的充足、穩(wěn)定供給。相比于植物提取的生產(chǎn)方式，構(gòu)建微生物細(xì)胞工廠生產(chǎn)香豆酸及其衍生物的方法更為環(huán)保、產(chǎn)量更穩(wěn)定。合成生物學(xué)通過生物工程化設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)了人工生物系統(tǒng)的構(gòu)建，推動(dòng)了天然產(chǎn)物生物合成的革命性的發(fā)展，為穩(wěn)定生產(chǎn)天然產(chǎn)物提供了新的策略，是近年來的研究熱點(diǎn)。

2、通過微生物細(xì)胞工廠來實(shí)現(xiàn)對(duì)香豆酸及其衍生物的生產(chǎn)，關(guān)鍵在于高產(chǎn)菌株的構(gòu)建。通過遺傳改造工具向菌株引入外源合成途徑，可使微生物異源合成對(duì)香豆酸及其衍生物，但仍需要對(duì)菌株的代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行迭代設(shè)計(jì)與優(yōu)化來實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)。研究者們?cè)谶^去的近20年中，通過優(yōu)化外源途徑基因的來源與表達(dá)、提高前體代謝物供給等策略，獲得了一系列高效異源合成對(duì)香豆酸及其衍生物的微生物細(xì)胞工廠。

3、對(duì)香豆酸生物降解是制約宿主微生物高效生產(chǎn)對(duì)香豆酸及其衍生物的一個(gè)重要因素，以生產(chǎn)多酚類化合物的重要宿主解脂耶氏酵母為例，在sáez-sáez等人（sáez-sáez,j.,?wang,?g.,?marella,?e.?r.,?sudarsan,?s.,?cernuda?pastor,?m.,&borodina,?i.(2020).?engineering?the?oleaginous?yeast yarrowialipolyticafor?high-levelresveratrol?production.?metabolic?engineering,?62,?51–61.?）以及zhu等人（zhu,j.,?yang,?s.,?cao,?q.,?li,?x.,?jiao,?l.,?shi,?y.,yan,?y.,?xu,?l.,?yang,?m.,xie,?x.,?madzak,?c.,&yan,?j.?(2024).?engineering yarrowialipolyticaas?acellulolytic?cell?factory?for?production?of?p-coumaric?acid?from?celluloseand?hemicellulose.?journal?ofagricultural?and?food?chemistry,?72(11),?5867–5877.）關(guān)于構(gòu)建合成對(duì)香豆酸及對(duì)香豆酸衍生物細(xì)胞工廠的研究中，均報(bào)道了解脂耶氏酵母具有大量降解對(duì)香豆酸的能力，進(jìn)而限制了對(duì)香豆酸及其衍生物的產(chǎn)量提升。然而目前僅有其他物種中的少數(shù)幾個(gè)對(duì)香豆酸降解酶被報(bào)道，包括解脂耶氏酵母在內(nèi)的多種微生物代謝對(duì)香豆酸的過程與參與這一過程的基因均尚不明確。識(shí)別鑒定對(duì)香豆酸的代謝途徑與相關(guān)基因，對(duì)菌株進(jìn)行相應(yīng)的基因工程改造，從而減弱和消除菌株對(duì)于對(duì)香豆酸的降解消耗，是提高微生物細(xì)胞合成對(duì)香豆酸及對(duì)香豆酸衍生物水平的關(guān)鍵。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的一個(gè)目的是解決至少上述問題和/或缺陷，并提供至少后面將說明的優(yōu)點(diǎn)。

2、本發(fā)明另有一個(gè)目的是提供一種對(duì)香豆酸或?qū)ο愣顾嵫苌锷a(chǎn)水平提高的微生物及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，通過改造對(duì)香豆酸代謝途徑相關(guān)遺傳靶點(diǎn)，以減少微生物降解對(duì)香豆酸的程度，從而提高微生物生產(chǎn)對(duì)香豆酸及對(duì)香豆酸衍生物的產(chǎn)量和/或生產(chǎn)效率。

3、本發(fā)明再有一個(gè)目的是提供對(duì)香豆酸代謝途徑相關(guān)酶、生產(chǎn)對(duì)香豆酸及對(duì)香豆酸衍生物的方法。

4、為此，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：

5、一種對(duì)香豆酸或?qū)ο愣顾嵫苌锷a(chǎn)水平提高的微生物，對(duì)微生物的對(duì)香豆酸代謝途徑相關(guān)遺傳靶點(diǎn)進(jìn)行改造，所述改造為去除對(duì)香豆酸代謝途徑相關(guān)遺傳靶點(diǎn)的部分或者全部活性，所述改造方法包括使用敲除相應(yīng)基因、突變相應(yīng)基因、rna干擾、基因下調(diào)或去除遺傳靶點(diǎn)酶活性，所述的對(duì)香豆酸或?qū)ο愣顾嵫苌锷a(chǎn)水平提高的微生物的構(gòu)建方法中，所述對(duì)香豆酸代謝途徑相關(guān)遺傳靶點(diǎn)具備4-香豆酰輔酶a連接酶（e.c?6.2.1.12）、羥肉桂酰輔酶a水合酶裂解酶（e.c?4.1.2.61）、羥脂酰輔酶a脫氫酶（e.c?1.1.1.35）、β-酮酰輔酶a硫醇化酶（e.c?2.3.1.16），3-（芳基）丙烯酸酯還原酶（e.c?1.3.8.15）中一種或兩種及以上組合的催化能力。

6、優(yōu)選地，所述的對(duì)香豆酸或?qū)ο愣顾嵫苌锷a(chǎn)水平提高的微生物的構(gòu)建方法中，所述對(duì)香豆酸代謝途徑相關(guān)遺傳靶點(diǎn)為4-香豆酰輔酶a連接酶、羥肉桂酰輔酶a水合酶裂解酶、羥脂酰輔酶a脫氫酶、β-酮酰輔酶a硫醇化酶，3-（芳基）丙烯酸酯還原酶中一種或兩種及以上組合。

7、優(yōu)選地，所述的對(duì)香豆酸或?qū)ο愣顾嵫苌锷a(chǎn)水平提高的微生物的構(gòu)建方法中，4-香豆酰輔酶a連接酶包括如seq?id?no：1所示的氨基酸序列或其類似物；

8、羥肉桂酰輔酶a水合酶裂解酶的基因包括如seq?id?no：2、seqid?no：3所示的氨基酸序列或其類似物；

9、羥脂酰輔酶a脫氫酶包括如seq?id?no：4所示的氨基酸序列或其類似物；

10、β-酮酰輔酶a硫醇化酶包括如seq?id?no：5所示的氨基酸序列或其類似物；

11、3-（芳基）丙烯酸酯還原酶包括如seq?id?no：6、seq?id?no：7所示的氨基酸序列或其類似物。

12、優(yōu)選地，所述的對(duì)香豆酸代謝途徑相關(guān)遺傳靶點(diǎn)，所述類似物為相應(yīng)遺傳靶點(diǎn)的突變體，所述突變體的氨基酸序列具有與相應(yīng)遺傳靶點(diǎn)的氨基酸序列至少20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或99%的序列同一性。

13、上述方法中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性?？墒褂脟?guó)際互聯(lián)網(wǎng)上的同源性檢索站點(diǎn)測(cè)定氨基酸序列的同一性，如ncbi主頁網(wǎng)站的blast網(wǎng)頁。例如，可在高級(jí)blast2.1中，通過使用blastp工具，將expect值設(shè)置為10，將所有filter設(shè)置為off，使用blosum62?作為matrix，將gap?existence?cost，per?residue?gap?cost和lambda?ratio分別設(shè)置為11，1和0.85（缺省值）并進(jìn)行檢索一對(duì)氨基酸序列的同一性進(jìn)行計(jì)算，然后即可獲得同一性的值（%）。

14、優(yōu)選地，所述的對(duì)香豆酸或?qū)ο愣顾嵫苌锷a(chǎn)水平提高的微生物中，所述對(duì)香豆酸代謝途徑相關(guān)遺傳靶點(diǎn)為seq?id?no：1、seq?id?no：2、?seq?id?no：3、seq?id?no：4、seq?id?no：5、seq?id?no：6和seq?id?no：7所示的氨基酸序列的編碼基因中一種或兩種及以上組合。

15、優(yōu)選地，所述的對(duì)香豆酸或?qū)ο愣顾嵫苌锷a(chǎn)水平提高的微生物中，改造方法為敲除seq?id?no：1、seq?id?no：2、?seq?id?no：3、seq?id?no：4、seq?id?no：5、seq?id?no：6和seq?id?no：7所示氨基酸序列的編碼基因中一種或兩種及以上組合。

16、優(yōu)選地，所述的對(duì)香豆酸或?qū)ο愣顾嵫苌锷a(chǎn)水平提高的微生物中，所述構(gòu)建方法為敲除seq?id?no：2和seq?id?no：5所示氨基酸序列的編碼基因。

17、優(yōu)選地，所述微生物是真菌、細(xì)菌；

18、優(yōu)選地，所述真菌選自耶氏酵母屬、克魯維酵母屬、釀酒酵母屬、假絲酵母屬、畢赤酵母屬、曲霉屬或鐮刀菌屬；

19、所述細(xì)菌細(xì)胞選自乳桿菌屬或芽孢桿菌屬；

20、優(yōu)選地，所述耶氏酵母屬是解脂耶氏酵母（ yarrowia?lipolytica）、 yarrowia? alimentaria、 yarrowia?bubula、 yarrowia?hollandica、yarrowia?deformans或yarrowia? divulgata的任意之一；

21、優(yōu)選地，所述克魯維酵母屬是馬克斯克魯維酵母、馬克斯克魯維酵母變種、乳酸克魯維酵母、湖北克魯維酵母、威克海姆克魯維酵母或耐熱克魯維酵母的任意之一；

22、優(yōu)選地，所述芽孢桿菌屬是蠟樣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌任意之一；

23、優(yōu)選地，所述乳桿菌屬是德氏乳桿菌保加利亞種、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌干酪亞種、羅伊氏乳桿菌、卷曲乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、格氏乳桿菌、約氏乳桿菌、植物乳桿菌或唾液乳桿菌任意之一；

24、更優(yōu)選地，所述微生物是解脂耶氏酵母、釀酒酵母、巴斯德畢赤酵母、圓紅冬孢酵母、發(fā)酵畢赤酵母、馬克斯克魯維酵母、漢遜氏酵母、漢遜德巴利酵母、拜耳接合酵母、異常威克漢姆酵母或庫(kù)德里亞畢赤酵母、里氏木霉或黑曲霉。

25、更優(yōu)選地，所述微生物為解脂耶氏酵母（ yarrowia?lipolytica）。

26、一種對(duì)香豆酸或?qū)ο愣顾嵫苌锷a(chǎn)水平提高的微生物構(gòu)建方法，其按照任一項(xiàng)所述的內(nèi)容進(jìn)行構(gòu)建。

27、所述對(duì)香豆酸或?qū)ο愣顾嵫苌锷a(chǎn)水平提高的微生物的應(yīng)用，

28、具體地，所述對(duì)香豆酸衍生物包括以對(duì)香豆酸和/或?qū)ο愣辊］o酶a為代謝前體的化合物。

29、優(yōu)選地，所述對(duì)香豆酸衍生物為類黃酮、酚酸、木脂素、芪類；

30、進(jìn)一步地，所述對(duì)香豆酸衍生物為二苯乙烯類、黃酮類、色素類平臺(tái)化合物；

31、進(jìn)一步地，所述酚酸類化合物選自對(duì)香豆酸、咖啡酸、阿魏酸；二苯乙烯類化合物選自白藜蘆醇、赤松素、云杉醇、虎杖苷、紫檀芪、桑皮苷及其他白藜蘆醇衍生物；所述黃酮類化合物選自柚皮素及其衍生物，優(yōu)選地，所述的柚皮素及其衍生物選自柚皮素、黃芩素、槲皮素、橘紅素、木犀草素、楊梅黃酮、兒茶素、表兒茶素、異甘草素、黃腐酚、淫羊藿素、7-o-(2-萘基甲基）柚皮素、5-o-甲基柚皮素、7,4′-2-o-甲基柚皮素、7-o-甲基柚皮素（櫻花素）和異櫻花素（4′-o-甲基柚皮素）；所述色素類化合物選自姜黃素、花青素及其衍生物，優(yōu)選地，所述的姜黃素、花青素及其衍生物選自去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素、矢車菊素、天竺葵素、芍藥色素、飛燕草素、牽?；ㄋ亍㈠\葵色素。

32、優(yōu)選地，所述應(yīng)用包括如下步驟，

33、首先將解脂耶氏酵母的對(duì)香豆酸代謝途徑相關(guān)遺傳靶點(diǎn)進(jìn)行改造，所述改造為去除對(duì)香豆酸代謝途徑相關(guān)遺傳靶點(diǎn)的部分或者全部活性，

34、然后將改造后的解脂耶氏酵母培養(yǎng)基中培養(yǎng)2~8天，從發(fā)酵液中收獲對(duì)香豆酸及對(duì)香豆酸衍生物；

35、所述培養(yǎng)基包括碳源和氮源，具體可為以下一項(xiàng)或多項(xiàng)的組合：

36、（i）所述碳源選自可發(fā)酵碳源或不可發(fā)酵碳源，優(yōu)選地，可發(fā)酵碳源包括但不限于葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、蔗糖，不可發(fā)酵碳源包括但不限于乙醇、乙酸及乙酸鹽、甘油、乳酸鹽、甲醇、甲酸；

37、（ii）所述氮源選自有機(jī)氮源或無機(jī)氮源，優(yōu)選地，有機(jī)氮源包括但不限于蛋白胨、酵母粉、玉米漿，無機(jī)氮源包括但不限于硫酸銨、氯化銨、硝酸鹽和氨水。

38、（iii）含有碳源和氮源的生物質(zhì)，包括但不限于農(nóng)業(yè)、工業(yè)和林業(yè)殘留物和廢料。

39、所述的微生物或所述的對(duì)香豆酸代謝途徑相關(guān)酶在提高對(duì)香豆酸及對(duì)香豆酸衍生物產(chǎn)量中的應(yīng)用，優(yōu)選地，所述對(duì)香豆酸衍生物包括以對(duì)香豆酸和/或?qū)ο愣辊］o酶a為代謝前體的化合物；

40、本發(fā)明至少包括以下有益效果：

41、本發(fā)明鑒定了解脂耶氏酵母降解對(duì)香豆酸的代謝途徑相關(guān)靶點(diǎn)：4-香豆酰輔酶a連接酶、羥肉桂酰輔酶a水合酶裂解酶、羥脂酰輔酶a脫氫酶、β-酮酰輔酶a硫醇化酶和3-（芳基）丙烯酸酯還原酶。通過在解脂耶氏酵母中組合改造以上基因，可減少?81.23%的對(duì)香豆酸降解。將該方法應(yīng)用于對(duì)香豆酸生產(chǎn)菌株中，可使對(duì)香豆酸產(chǎn)量相比改造前提高2.51倍。將該方法應(yīng)用于對(duì)香豆酸的衍生物白藜蘆醇的生產(chǎn)菌株中，可使微生物單體細(xì)胞生產(chǎn)白藜蘆醇效率比改造前提高至1.34倍（以mg/l/od計(jì)）。

42、本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)、目標(biāo)和特征將部分通過下面的說明體現(xiàn)，部分還將通過對(duì)本發(fā)明的研究和實(shí)踐而為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。