本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，具體涉及一種特異性結(jié)合pd-1的納米抗體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、在駱駝科和軟骨魚綱動物血液中存在一種缺失輕鏈的特殊抗體，即重鏈抗體。與普通抗體相比，它只包含一個重鏈可變區(qū)(vhh)和兩個常規(guī)的ch2與ch3區(qū)?？寺∑淇勺儏^(qū)，可以得到只由重鏈可變區(qū)組成的單域抗體(又稱納米抗體)，具有分子量小、組織穿透力強、穩(wěn)定性高、免疫原性低等優(yōu)點。

2、羊駝抗體與普通抗體(研究載體以小鼠、兔子為主)相比，羊駝抗體擁有諸多優(yōu)勢，包括：(1)體積小，是普通抗體的十分之一，這使得它能夠滲透到組織和細(xì)胞內(nèi)部，特別是能夠穿透血腦屏障。(2)穩(wěn)定性強，納米抗體在極端的溫度和ph值條件下都能保持穩(wěn)定性，在高達(dá)90度的高溫下仍能保持生物活性。(3)結(jié)構(gòu)簡單，納米抗體更容易進行改造，如人源化、多價性構(gòu)建等，且生產(chǎn)成本低，適合大規(guī)模生產(chǎn)。(4)高特異性，羊駝的免疫系統(tǒng)能夠產(chǎn)生對特定抗原有高度特異性和親和力的抗體，且對人的免疫原性弱。納米抗體引起免疫反應(yīng)的風(fēng)險較低。

3、程序化死亡分子1(programmed?death?1，pd-1)，又稱為cd279，廣泛表達(dá)于免疫細(xì)胞表面，是一種重要的免疫抑制分子。pd-1隸屬免疫球蛋白超家族cd28/b7，是由288個氨基酸組成的ⅰ型跨膜糖蛋白，為免疫抑制性受體。其有至少pd-l1和pdl2兩種配體。在正常情況下，t細(xì)胞表面的pd-1能夠抑制t淋巴細(xì)胞的功能，從而抑制自身免疫應(yīng)答，防止自身免疫性疾病的發(fā)生。但在腫瘤中，腫瘤細(xì)胞表達(dá)的pd-l1與t細(xì)胞表面的pd-1結(jié)合后，能通過對t淋巴細(xì)胞的抑制作用，導(dǎo)致t細(xì)胞增殖下調(diào)，甚至誘導(dǎo)t細(xì)胞凋亡，促進腫瘤的免疫逃逸。而阻斷pd-1/pd-l1負(fù)調(diào)控通路，可激活免疫系統(tǒng)功能，殺傷腫瘤細(xì)胞。

4、目前利用pd-1抗體阻斷pd-1/pd-l1途徑以恢復(fù)t細(xì)胞腫瘤活性，激活t細(xì)胞，殺傷腫瘤細(xì)胞治療已經(jīng)成為癌癥免疫治療的焦點。市面上已有多種靶向pd-1單克隆抗體，這些pd-1單抗在臨床中已經(jīng)取得成功應(yīng)用，但這些抗體大多為普通抗體。相比與普通抗體，羊駝抗體具有諸多優(yōu)勢，開發(fā)一種特異性結(jié)合pd-1的羊駝抗體；并基于此制備成抗體藥物或細(xì)胞藥物，其在癌癥的治療中具有重要的應(yīng)用價值。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種特異性結(jié)合pd-1的納米抗體及其應(yīng)用。本發(fā)明制備的納米抗體的特異性高，同時可以阻斷pd-1和pd-l1的結(jié)合，增強免疫細(xì)胞的功能。

2、為達(dá)到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供一種特異性結(jié)合pd-1的納米抗體，所述納米抗體的重鏈可變區(qū)包括cdr1、cdr2和cdr3；

4、所述cdr1的氨基酸序列包括seq?id?no:1所示；

5、所述cdr2的氨基酸序列包括seq?id?no:2所示；

6、所述cdr3的氨基酸序列包括seq?id?no:3所示。

7、優(yōu)選地，所述納米抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列包括seq?id?no:4所示。

8、第二方面，本發(fā)明提供一種特異性結(jié)合pd-1的重鏈抗體，所述重鏈抗體包括第一方面所述的特異性結(jié)合pd-1的納米抗體和人免疫球蛋白可結(jié)晶段ig?fc的全長或部分氨基酸序列。

9、優(yōu)選地，所述ig?fc包括igg1、igg2、igg3或igg4的fc段的全長或部分序列，或其組合。

10、優(yōu)選地，所述igg1?fc氨基酸序列包括seq?id?no:5所示。

11、優(yōu)選地，所述重鏈抗體的氨基酸序列包括seq?id?no:6所示。

12、本發(fā)明使用pd-1蛋白免疫羊駝。每次免疫后通過elisa確定羊駝血清中pd-1特異性抗體的效價，待效價足夠高時，表明羊駝中已經(jīng)存在能分泌高親和力的抗pd-1蛋白的b細(xì)胞，隨后分離羊駝外周血單個核細(xì)胞(peripheral?blood?mononuclear?cell，pbmc)，提取rna并反轉(zhuǎn)錄獲得cdna。用羊駝單域抗體特異性引物，擴增vhh序列，并克隆至酵母表達(dá)質(zhì)粒中，構(gòu)建酵母展示文庫。然后用生物素-pd-1蛋白-鏈霉素磁珠或鏈霉素磁珠對酵母展示文庫進行正負(fù)篩選，富集結(jié)合pd-1蛋白的酵母菌。從富集產(chǎn)物中挑取單克隆命名為195-1-a07，通過elisa檢測195-1-a07與pd-1的特異性結(jié)合情況。195-1-a07表達(dá)純化后，檢測其與pd-1蛋白結(jié)合的親和力。檢測195-1-a07阻斷pd-1和pd-l1結(jié)合的能力。結(jié)果顯示，195-1-a07的特異性高，同時可以阻斷pd-1和pd-l1的結(jié)合，增強免疫細(xì)胞的功能。

13、所述cdr1的氨基酸序列，seq?id?no:1：vsgsifgihais。

14、所述cdr2的氨基酸序列，seq?id?no:2：tritsgtstdyge。

15、所述cdr3的氨基酸序列，seq?id?no:3：nreirgssgiwypldy。

16、所述納米抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列，seq?id?no:4：

17、dvqlvesggglvqpggsltlscavsgsifgihaiswyrqapgnqrelvtritsgtstdygesvkgrfivsrdnakntvylqmdslkpedtavyycnreirgssgiwypldywgqgtqvtvss。

18、所述igg1?fc氨基酸序列，seq?id?no:5：

19、epkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk。

20、所述重鏈抗體的氨基酸序列，seq?id?no:6：

21、dvqlvesggglvqpggsltlscavsgsifgihaiswyrqapgnqrelvtritsgtstdygesvkgrfivsrdnakntvylqmdslkpedtavyycnreirgssgiwypldywgqgtqvtvssahhsedpssaaasgatkaepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk。

22、第三方面，本發(fā)明提供一種核酸分子，所述核酸分子編碼第一方面所述的特異性結(jié)合pd-1的納米抗體或第二方面所述的特異性結(jié)合pd-1的重鏈抗體。

23、第四方面，本發(fā)明提供一種重組載體，所述重組載體含有第三方面所述的核酸分子。

24、第五方面，本發(fā)明提供一種表達(dá)第一方面所述的特異性結(jié)合pd-1的納米抗體或第二方面所述的特異性結(jié)合pd-1的重鏈抗體的細(xì)胞，所述細(xì)胞中含有至少一個拷貝的第四方面所述的重組載體，或其基因組上整合了第三方面所述的核酸分子。

25、第六方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，所述組合物包括第一方面所述的特異性結(jié)合pd-1的納米抗體或第二方面所述的特異性結(jié)合pd-1的重鏈抗體。

26、第七方面，本發(fā)明提供一種檢測pd-1的試劑盒，所述試劑盒包括第一方面所述的特異性結(jié)合pd-1的納米抗體或第二方面所述的特異性結(jié)合pd-1的重鏈抗體。

27、第八方面，本發(fā)明提供第一方面所述的特異性結(jié)合pd-1的納米抗體、第二方面所述的特異性結(jié)合pd-1的重鏈抗體、第三方面所述的核酸分子、第四方面所述的重組載體、第五方面所述的細(xì)胞、第六方面所述的藥物組合物或第七方面所述的檢測pd-1的試劑盒在制備檢測和/或治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。

28、本發(fā)明中，制備的羊駝抗體特異性高，可以阻斷pd-1和pd-l1的結(jié)合，增強免疫細(xì)胞的功能。所述抗pd1的羊駝抗體可以應(yīng)用相關(guān)技術(shù)做成抗體藥物，可用于癌癥的治療。

29、相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下有益效果：

30、本發(fā)明制備的抗pd-1蛋白的抗體有較好的親和力和特異性，195-1-a07對cho-k1細(xì)胞不結(jié)合，對cho-k1-pd-1有顯著結(jié)合，且能檢測到大部分的cho-k1-pd-1細(xì)胞表達(dá)pd-1蛋白，表明195-1-a07對pd-1蛋白有較好的親和力和特異性。進一步測量了195-1-a07對cho-k1-pd-1的ec50值，結(jié)果為0.2μg/ml，表明195-1-a07具有較高的親和力。重組抗體的阻斷功能檢測結(jié)果表明，195-1-a07阻斷pd-1與pd-l1結(jié)合的能力較強，能有效促進jurkat-pd-1-luciferase表達(dá)熒光素酶，可用于研發(fā)免疫增強型藥物。進一步測量了195-1-a07的ic50值，結(jié)果為1.25μg/ml，表明195-1-a07具有較強的阻斷pd-1和pd-l1蛋白結(jié)合的能力。綜上，本發(fā)明制備的抗體特異性高，可以阻斷pd-1和pd-l1的結(jié)合，能增強免疫細(xì)胞的功能，在藥物制備中具有重要的應(yīng)用前景。